复杂性疾病遗传研究中Tag SNP的筛选及其潜在功能预测 被引量：3

1

作者 朱益民 许玉洋 凌洁 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期237-244,共8页

利用公共数据库筛选与复杂性疾病相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。运用FastSNP、SNP Function Prediction、F-SNP等多种SNP功能预测软件筛选有潜在功能的SNPs;通过HapMap等数据库筛选Tag SNP;综合比较各软... 利用公共数据库筛选与复杂性疾病相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。运用FastSNP、SNP Function Prediction、F-SNP等多种SNP功能预测软件筛选有潜在功能的SNPs;通过HapMap等数据库筛选Tag SNP;综合比较各软件结果。以IGFBP 7基因为例,筛选转录因子结合位点SNPs 11个,内含子增强子31个,内含子增强子和转录因子结合位点4个,剪接位点1个,共47个SNPs。 展开更多

关键词 胰岛素样生长因子结合蛋白质类/遗传学 多态性 单核苷酸 转录因子 数据库 文献型

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幽门螺杆菌cagA基因片段原核表达载体的构建及其cagA基因和CagA蛋白及感染者血清抗体的检测 被引量：2

2

作者 王媛 罗依惠 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2005年第3期223-229,共7页

　目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)cagA基因片段的原核表达系统,建立ELISA检测CagA及其抗体,了解表达CagA的Hp菌株(CagA+Hp)感染与所致疾病种类的关系。方法:从快速尿素酶试验阳性的156例患者胃黏膜活检标本中分离Hp。采用... 　目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)cagA基因片段的原核表达系统,建立ELISA检测CagA及其抗体,了解表达CagA的Hp菌株(CagA+Hp)感染与所致疾病种类的关系。方法:从快速尿素酶试验阳性的156例患者胃黏膜活检标本中分离Hp。采用PCR检测109株HpcagA基因,并从临床菌株Y06中扩增2148bp的cagA基因片段(cagA1)。构建cagA1原核表达系统,用SDS-PAGE检查目的重组蛋白(rCagA1)的表达情况,用Westernblot和免疫双扩散试验鉴定rCagA1的免疫反应性和抗原性。建立ELISA,检测109株HpCagA表达和相应患者血清中CagA抗体。分析CagA+Hp感染与胃炎和消化性溃疡的关系。结果:80.8%胃黏膜活检标本中分离出Hp(126/156),97.2%的Hp菌株(106/109)cagA基因阳性。与文献报道比较,所克隆的cagA1片段核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.83%和93.30%。所构建的原核表达系统表达的rCagA1量约为细菌总蛋白的30.0%。rCagA1能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔产生双扩散效价为1∶4的抗体。92.6%菌株(101/109)可表达CagA,88.1%患者(96/109)血清CagA抗体阳性。消化性溃疡标本中CagA+Hp菌株分离阳性率(97.9%)高于胃炎标本(88.5%),但无统计学差异(χ2=3.48,P>0.05)。 展开更多

关键词 抗体 细菌/分析 CAGA基因 基因表达 抗原 细菌 克隆 分子 螺杆菌 幽门/免疫学 螺杆菌 幽门/遗传学 免疫性 细菌蛋白质类/遗传学

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s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达与定位 被引量：1

3

作者 宋忆淑 宋志宇 +2 位作者 费向东 贺冰 李玉新 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期39-41,共3页

目的 :观察 s- lap/ GFP融合蛋白在 Hela细胞中的表达及定位。方法 :根据 s- lap基因的编码区序列 ,应用 PCR技术突变其 3′末端终止密码子 ,并通过基因重组技术将其与 GFP基因融合 ,构建 s- lap/ GFP重组质粒 ;采用脂质体转染法 ,将 s-... 目的 :观察 s- lap/ GFP融合蛋白在 Hela细胞中的表达及定位。方法 :根据 s- lap基因的编码区序列 ,应用 PCR技术突变其 3′末端终止密码子 ,并通过基因重组技术将其与 GFP基因融合 ,构建 s- lap/ GFP重组质粒 ;采用脂质体转染法 ,将 s- lap/ GFP融合基因转入 Hela细胞中 ,用荧光显微镜观察其表达。结果 :s- lap/ GFP重组质粒序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜显示 ,在转染 GFP基因的 Hela细胞中 ,荧光呈网状均匀分布于细胞浆内 ,而细胞核内低表达 ;在转染 s- lap/ GFP融合基因的 Hela细胞中 ,荧光均匀分布于整个细胞 ,尤其以细胞核内高表达。结论 :s- lap/ GFP融合蛋白可在人 Hela细胞中表达 ,并主要定位于细胞核。 展开更多

关键词 s-lap/GFP融合蛋白 重组融合蛋白质类/遗传学 基因融合/方法 HELA细胞

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先天性白内障一家系中两个β-晶体蛋白基因的突变筛查 被引量：1

4

作者 胡继元 廖荣丰 +2 位作者 杨森 方巧云 周伏圣 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2008年第5期570-573,共4页

目的对一中国常染色体显性先天性粉尘状白内障家系进行β-晶体蛋白基因(cryba1、crybb1)的突变筛查。方法对一中国先天性白内障家系进行研究,通过直接测序,筛查此家系中全部患者的cryba1基因、crybb1基因外显子以及临近的内含子的剪接... 目的对一中国常染色体显性先天性粉尘状白内障家系进行β-晶体蛋白基因(cryba1、crybb1)的突变筛查。方法对一中国先天性白内障家系进行研究,通过直接测序,筛查此家系中全部患者的cryba1基因、crybb1基因外显子以及临近的内含子的剪接位点。结果直接测序后发现该粉尘状白内障家系cryba1基因和crybb1基因的外显子及其临近的内含子中,均未发现任何突变。结论该表型的先天性白内障家系并非是由这两个β-晶体蛋白基因突变引起。 展开更多

关键词 白内障/先天性 白内障/遗传学 β晶体蛋白质类/遗传学 突变 系谱

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人tau融合蛋白的原核表达及纯化

5

作者 梁燕 王海萍 +2 位作者 冯利杰 李琪 沈玉先 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2007年第4期367-370,共4页

目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21... 目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE染色及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。分别使用His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白结合来纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pET28a-tau和pGEX-5X-1-tau并在大肠杆菌BL21中诱导其大量表达。经His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B纯化后,可以得到较纯化的His-tau和GST-tau融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗tau单克隆抗体(tau-5)所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。结论构建了人tau两种原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该蛋白,为进一步的tau与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。 展开更多

关键词 tau蛋白质类/遗传学 大肠杆菌 基因表达 质粒

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PML蛋白参与三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病的分子生物学机制研究 被引量：3

6

作者 郝睿 苏力德 +3 位作者 邵一鸣 部娜 马丽亚 那仁满都拉 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期541-551,共11页

PML蛋白作为一种肿瘤抑制因子,在三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的过程中发挥重要作用。绝大多数APL患者的典型特征是细胞内PML基因和RARα基因发生融合,该融合基因所表达的PML-RARα融合蛋白是APL发病的主要原因。三氧化二... PML蛋白作为一种肿瘤抑制因子,在三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的过程中发挥重要作用。绝大多数APL患者的典型特征是细胞内PML基因和RARα基因发生融合,该融合基因所表达的PML-RARα融合蛋白是APL发病的主要原因。三氧化二砷作为临床治疗APL的一线药物,通过直接作用于PML-RARα融合蛋白的PML部分,诱导相关蛋白多聚化,并招募多种功能蛋白,促进PML核小体重构,使PML-RARα蛋白发生小泛素修饰蛋白(SUMO)化和泛素化,最终经蛋白酶体途径降解,达到治疗APL的目的。PML蛋白发生点突变会导致APL复发及三氧化二砷耐药。本文阐述了PML蛋白的结构和功能、PMLRARα融合蛋白诱导APL发病的机制、PML蛋白参与三氧化二砷治疗APL的分子机制以及PML蛋白发生突变导致APL患者发生三氧化二砷耐药的现象,以期为目前治疗方案的优化及针对耐药患者有效治疗手段的开发提供理论指导。 展开更多

关键词 白血病 早幼粒细胞 急性/药物疗法 砷剂/治疗应用 肿瘤蛋白质类/生物合成 小泛素相关修饰蛋白质类/遗传学

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sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒的构建和表达及生物学活性鉴定

7

作者 吴茜茜 陈鸿鹄 +2 位作者 郭佳 王圣超 潘建平 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期350-356,共7页

目的:构建表达可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2,在小鼠又称sflk1)与IFN-γ双功能蛋白的重组质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ,对表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白的生物学活性进行鉴定。方法:以RT-PCR法分别扩增出sflk1与小鼠IFN-γ基因片... 目的:构建表达可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2,在小鼠又称sflk1)与IFN-γ双功能蛋白的重组质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ,对表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白的生物学活性进行鉴定。方法:以RT-PCR法分别扩增出sflk1与小鼠IFN-γ基因片段,克隆入pcDNA3.1(+)载体,将该重组质粒表达于真核细胞,以ELISA和W estern blotting分别检测胞外及胞内sflk1-IFN-γ双功能重组蛋白的表达,并对该蛋白的生物学活性进行鉴定。结果:构建的pcDNA3.1(+)/sflk1-IFNγ-重组质粒能够在真核细胞中有效表达,且表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白兼有sflk1和IFN-γ两者的生物学活性。结论:成功构建和表达了sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒,为进一步研究该双功能蛋白的抗肿瘤作用打下了基础。 展开更多

关键词 蛋白质类/遗传学 血管内皮生长因子受体2/遗传学 sflk-1 IFN-γ 双功能蛋白 基因重组

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艾滋病合并分枝杆菌感染患者分枝杆菌菌种鉴定 被引量：10

8

作者 宋炜 刘莉 卢洪洲 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期243-248,共6页

目的：对艾滋病合并分枝杆菌感染患者菌株标本进行菌种鉴定，评价MPB64抗原胶体金法快速检测试剂盒鉴别分枝杆菌的价值。方法：对艾滋病患者临床标本中培养出的140株分枝杆菌菌株用16SrDNA测序的方法进行菌种鉴定，分析艾滋病患者中常... 目的：对艾滋病合并分枝杆菌感染患者菌株标本进行菌种鉴定，评价MPB64抗原胶体金法快速检测试剂盒鉴别分枝杆菌的价值。方法：对艾滋病患者临床标本中培养出的140株分枝杆菌菌株用16SrDNA测序的方法进行菌种鉴定，分析艾滋病患者中常见非结核性分枝杆菌（NTM）菌种，同时对这些标本用MPB64抗原免疫胶体金法进行菌株鉴定，分析后者的敏感性和特异性。结果：以16SrDNA测序结果为金标准，MPB64抗原胶体金法快速检测区分结核分枝杆菌（MTB）与NTM的敏感性和特异性分别为96．00％和96．84％。共有114份标本（114／140，81．43％）获得明确鉴定结果，其中50份（43．86％）为MTB，63份标本（55．26％）鉴定为NTM。最常见的NTM菌种为戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌。结论：MPB64抗原胶体金法检测分枝杆菌菌种具有较好的特异性，且快速、经济、简便，适合用于临床对MTB及NTM的初步鉴别。艾滋病合并结核患者中NTM的比例较高，需进行菌种鉴定以指导临床治疗。 展开更多

关键词 获得性免疫缺陷综合征 分枝杆菌 结核/分离和提纯 分枝杆菌属/分类 寡核苷酸序列分析 细菌蛋白质类/遗传学 胶体金 试剂盒 诊断

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HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化 被引量：4

9

作者 彭方毅 姜海蓉 +5 位作者 陈远翔 陈盛珍 林治华 彭方亮 赵卫兵 陈保德 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期395-398,418,共5页

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109... 目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 病毒蛋白质类/生物合成 病毒蛋白质类/遗传学 大肠杆菌/遗传学 基因表达 克隆 分子 乳头状瘤病毒 人/遗传学 HPV16L1 原核表达 GST融合蛋白 疫苗

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抗HIF-1α和survivin基因双靶位miR-RNAi载体的构建及其对胰腺癌细胞的作用 被引量：4

10

作者 徐孙兵 朱一平 +1 位作者 牟一平 朱玲华 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期81-88,共8页

目的:构建抗HIF-1α单靶位(anti-H)、抗Survivin单靶位(anti-S)以及抗HIF-1α和Survivin基因双靶位微小RNA表达载体(anti-H+S),观察和比较这3种载体对胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响。方法:设计4组靶向HIF-1α和Survivin基因的寡核苷酸序列... 目的:构建抗HIF-1α单靶位(anti-H)、抗Survivin单靶位(anti-S)以及抗HIF-1α和Survivin基因双靶位微小RNA表达载体(anti-H+S),观察和比较这3种载体对胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响。方法:设计4组靶向HIF-1α和Survivin基因的寡核苷酸序列,连接至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒,构建两组共8个载体,依次为anti-H(Ⅰ)、anti-H(Ⅱ)、anti-H(Ⅲ)、anti-H(Ⅳ)和anti-S(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)、anti-S(Ⅲ)、anti-S(Ⅳ)。实时定量RT-PCR检测靶基因mRNA的表达水平,将两组中mRNA下调作用最强的质粒串联,构建anti-H+S。用anti-H+S及mRNA下调作用最强的anti-H和anti-S转染胰腺癌Panc-1细胞,Western blot测定靶蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖活性。结果:经测序鉴定,所有anti-H、anti-S及双靶位质粒anti-H+S装载位点核苷酸序列与设计序列完全相符。anti-H的靶基因mRNA沉默效率依次为48%、2%、44%和30%;anti-S的靶基因mRNA沉默效率依次为72%、75%、58%和59%。由anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ)串联得到双靶位质粒anti-H+S。anti-H+S的靶基因mRNA沉默效率为53%(HIF-1α)和42%(survivin)。anti-H(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)及anti-H+S与对照质粒相比均使靶基因蛋白的表达明显下降,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。其中anti-H+S对细胞的增殖抑制作用强于anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ),72h后差异有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究成功构建了抗HIF-1α和Survivin的单靶位质粒和双靶位质粒;其中,anti-H+S抑制胰腺癌Panc-1细胞增殖作用强于anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ)。 展开更多

关键词 胰腺肿瘤/遗传学 微管相关蛋白质类/遗传学 缺氧诱导因子1/遗传学 基因表达 遗传载体 质粒/遗传学 转染 肿瘤细胞 培养的 RNA干扰 微RNAs

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pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒的构建及其在活细胞内的作用 被引量：2

11

作者 高艳军 杨清玲 +1 位作者 陈昌杰 丁勇兴 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期519-526,共8页

目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用。方法:应用化学合成法获得巨噬细胞... 目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用。方法:应用化学合成法获得巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viralmacrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21肽(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)编码的基因序列,克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VC155中,筛选含有目标基因的正确克隆。利用RT-PCR扩增人乳腺癌细胞株SKBR3的CXCR4全长基因后,T-A亚克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VN173载体中。然后,经酶切鉴定及DNA测序分析2个基因是否正确连接至真核表达载体中。应用脂质体转染的方法共转染pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VC155-CXCR4至细胞株COS-7中,在荧光显微镜下观察NT21MP与CXCR4在胞内的相互作用。结果:经DNA测序及同源性对比,证实pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VN173-CXCR4重组载体构建成功;基因片段与NCBI基因库vMIP-Ⅱ和CXCR4基因CDS序列同源性达99.9%。BiFC法观察NT21MP与CXCR4在细胞内结合出现的荧光信号,该信号分布细胞内。结论:本实验成功构建了应用BiFC技术的真核表达载体,并且在活细胞内检测到NT21MP与CXCR4的互相结合。 展开更多

关键词 受体 趋化因子/遗传学 趋化因子CXCL2 质粒 重组蛋白质类/遗传学 遗传载体 转染 遗传互补测验

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两种ErbB2/Neu阳性-PTEN缺失乳腺癌基因工程小鼠模型的建立及其生物学特征比较 被引量：1

12

作者 王庆飞 丁慧 +1 位作者 刘宝瑞 张葵 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期427-433,共7页

目的：建立两种ErbB2／Neu阳性-PTEN缺失的乳腺癌基因工程小鼠模型并比较其生物学特征。方法：利用先前建立的由鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）启动子同时驱动活化型ErbB2／Neu基因和重组酶Cre表达的FVB／N—MMTV—NIC小鼠与Flox-PTEN小鼠交配... 目的：建立两种ErbB2／Neu阳性-PTEN缺失的乳腺癌基因工程小鼠模型并比较其生物学特征。方法：利用先前建立的由鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）启动子同时驱动活化型ErbB2／Neu基因和重组酶Cre表达的FVB／N—MMTV—NIC小鼠与Flox-PTEN小鼠交配；或将由内源性启动子驱动活化型ErbB2／Neu基因表达的FVB／N-ErbB2^KI、FVB／N—MMTV—Cre及Flox—PTEN三种基因工程小鼠交配；PCR分别扩增Neu、Cre和PTEN基因，对其子代小鼠进行基因型鉴定；免疫组织化学法检测乳腺组织ErbB2／Neu和PTEN蛋白表达。对两种模型的成瘤时间、肿瘤数目、肺转移等生物学特征进行比较，观察肿瘤组织病理学形态，免疫组织化学法检测肿瘤细胞Ki-67表达，TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡水平。结果：经基因型鉴定和组织蛋白表达分析，获得了两种ErbB2／Neu阳性-PTEN纯合型缺失的乳腺癌基因工程小鼠模型；一是由MMTV外源性启动子同时驱动活化型ErbB2／Neu和Cre表达，抑癌基因PTEN条件性敲除的NIC／PTEN^-/-模型；二是由MMTV-Cre使内源性启动子驱动ErbB2／Neu基因表达，PTEN条件性敲除的ErhB2^KI／PTEN^-/-模型。NIC／PTEN^-/-模型的平均成瘤时间低于ErbB2^KI／PTEN^-/-模型（30d与368d，P〈0．01）；肿瘤数目、肺转移率均高于ErbB2^KI／PTEN^-/-模型（分别为10个与1～2个，75．0％与37．5％，均P〈0．01）；两种模型肿瘤呈现不同的组织病理形态，肿瘤细胞凋亡水平相当（P〉0．05）；NIC／PTEN^-/-模型Ki-67阳性细胞百分率高于ErhB2^KI／PTEN^-/-模型（86．9％±2．8％与37．4％±7．2％，P〈0．01）。结论：两种不同表型的ErbB2／Neu阳性-PTEN缺失的乳腺癌基因工程小鼠为探索ErbB2／HER2阳性乳腺癌的发生、发展规律及更有效的防治方案提供了理想的动物模型。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤 基因 ERBB-2 磷酸单酯水解酶类/生物合成 免疫组织化学 染色体缺失 肿瘤抑制蛋白质类/遗传学 疾病模型 动物 遗传工程

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hTERT核心启动子驱动的条件复制型腺病毒载体的构建及鉴定 被引量：1

13

作者 倪芳 鲁茁壮 +3 位作者 瞿成奎 胡泽斌 王立生 汪思应 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2006年第1期19-22,共4页

目的构建并鉴定一种新型人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的条件复制型腺病毒载体。方法采用PCR的方法克隆腺病毒E1区基因(E1A,E1B55K)、E1B的启动子(E1Bp)以及人端粒酶逆转录酶亚基启动子(hTERTp),以及2个目的基因:人GM-CSF和GFP(Gre... 目的构建并鉴定一种新型人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的条件复制型腺病毒载体。方法采用PCR的方法克隆腺病毒E1区基因(E1A,E1B55K)、E1B的启动子(E1Bp)以及人端粒酶逆转录酶亚基启动子(hTERTp),以及2个目的基因:人GM-CSF和GFP(GreenFluorescenceProtein,GFP)。采用一系列分子生物学方法构建pShuttle-GFPSV55K穿梭质粒,应用此穿梭质粒与AdEasy-1腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得Ad-GFPSV55K重组腺病毒。PCR法鉴定重组腺病毒,噬斑形成实验测病毒滴度。结果经过酶切鉴定成功地构建了分别携带GM-CSF基因和GFP报告基因的腺病毒载体,病毒滴度为7×1010pfu/ml。结论成功获得由hTERT启动子驱动的条件复制型腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗打下良好的基础。 展开更多

关键词 末端转移酶/遗传学 腺病毒科 发光蛋白质类/遗传学

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大鼠BMP-7重组腺病毒构建及在肾小管上皮细胞中表达

14

作者 杨肃文 王伟 +1 位作者 徐再春 朱芸芸 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期71-78,共8页

目的:利用AdEasyTMsystem构建携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并鉴定其在原代肾小管上皮细胞中的表达。方法:将BMP-7全长序列分为46个片段分段合成,再采用PCR方法将合成的46个寡核苷酸片段拼接成BMP-7基因,并克隆到测序载体中测序鉴定。... 目的:利用AdEasyTMsystem构建携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并鉴定其在原代肾小管上皮细胞中的表达。方法:将BMP-7全长序列分为46个片段分段合成,再采用PCR方法将合成的46个寡核苷酸片段拼接成BMP-7基因,并克隆到测序载体中测序鉴定。经NotI和HindⅢ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-BMP-7。EcoRI酶切重组pShuttle-BMP-7,与pAdEasyTMDNA电穿孔共转化BJ5183感受态菌,抽提重组AdBMP-7质粒,PacI酶切线性化重组质粒AdBMP-7后,转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增,腺病毒荧光检测试剂盒测定其滴度。用AdBMP-7感染大鼠肾小管上皮细胞,以ELISA法和W estern-blot法检测BMP-7在大鼠肾小管上皮细胞中的表达。RT-PCR方法检测-αSMA mRNA的表达水平,以鉴定重组腺病毒AdBMP-7的生物学活性。结果:构建了BMP-7基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度重组腺病毒保存液。该重组腺病毒在体外能有效转染大鼠肾小管上皮细胞并高表达BMP-7蛋白,所表达的BMP-7蛋白能有效逆转由TGF-β1诱导的α-SMA表达增高。结论:成功地构建了携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并初步证实其具有一定的抗肾纤维化功能。 展开更多

关键词 骨形态发生蛋白质类/遗传学 重组 遗传 转染 遗传载体 腺病毒科/遗传学 肾小管/细胞学 上皮细胞/代谢 肾硬化症/治疗

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前体mRNA可变剪接调节因子NSSR1在大肠癌中的表达

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作者 张薇 沈权 沈嘉希 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期540-544,共5页

目的:研究神经系统显著表达的前体mRNA可变剪接调节因子NSSR1在大肠癌中的表达。方法:应用RT-PCR、Western blot以及免疫组织化学染色方法观测小鼠肠道等组织和人类大肠癌中NSSR1的mRNA和蛋白的表达以及分布。结果:NSSR1的mRNA在小鼠的... 目的:研究神经系统显著表达的前体mRNA可变剪接调节因子NSSR1在大肠癌中的表达。方法:应用RT-PCR、Western blot以及免疫组织化学染色方法观测小鼠肠道等组织和人类大肠癌中NSSR1的mRNA和蛋白的表达以及分布。结果:NSSR1的mRNA在小鼠的大脑、小脑、心脏、肝脏、大肠以及肺等组织中均有表达,而蛋白只在神经系统表达,在肠道中无表达。在人体正常肠道组织中,NSSR1只在肠黏膜上皮细胞中表达;而在大肠癌细胞中,NSSR1存在显著表达且主要分布在细胞核中。结论:NSSR1在大肠癌中高表达,这可能与NSSR1在大肠癌发生发展中的生物学功能有关。 展开更多

关键词 结直肠肿瘤 精氨酸/遗传学 丝氨酸/遗传学 RNA 信使 剪接体 免疫组织化学 基因表达 蛋白质类/遗传学

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真核双表达载体pIRES-hVEGF_(121)cDNA/hBMP-4的构建与鉴定 被引量：6

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作者 韩雷 汪春兰 +5 位作者 赵宇 何金生 王帮河 王兴宇 杨兵 周志林 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2007年第2期133-136,共4页

目的构建人血管内皮生长因子(hVEGF121)和人骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)的真核双表达质粒,转染COS-7细胞并表达。方法将hVEGF121 cDNA和hBMP-4通过非定向和定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4,经酶切鉴定... 目的构建人血管内皮生长因子(hVEGF121)和人骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)的真核双表达质粒,转染COS-7细胞并表达。方法将hVEGF121 cDNA和hBMP-4通过非定向和定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4,经酶切鉴定后,转染COS-7细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测。结果真核双表达载体pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4构建成功且hVEGF121cDNA和hBMP-4在COS-7细胞中得到了有效表达。结论hVEGF121和hBMP-4在COS-7细胞中成功表达,为进一步研究打下良好基础。 展开更多

关键词 血管内皮生长因子类/遗传学 骨形态发生蛋白质类/遗传学 遗传载体 基因表达

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HBx在原发性肝癌发生中的作用研究进展 被引量：9

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作者 项文清 刘伟 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期333-338,共6页

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,而乙型肝炎病毒感染是引起肝癌的最主要原因。作为乙肝病毒X基因的表达产物HBx蛋白具有广泛的反式激活功能,其能通过直接或间接的蛋白质间相互作用参与感染肝细胞的信号转导、细胞凋亡和细胞周期调控。... 肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,而乙型肝炎病毒感染是引起肝癌的最主要原因。作为乙肝病毒X基因的表达产物HBx蛋白具有广泛的反式激活功能,其能通过直接或间接的蛋白质间相互作用参与感染肝细胞的信号转导、细胞凋亡和细胞周期调控。鉴于HBx蛋白在乙型肝炎病毒复制和在感染肝细胞中的重要作用,HBx蛋白在肝癌发生中扮演的角色及其作用机理研究,一直是HBV和肝癌研究的热点内容。 展开更多

关键词 肝肿瘤 病毒蛋白质类/遗传学 肝炎病毒 乙型/遗传学

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GAD67-GFP基因敲入小鼠GFP与nNOS在嗅球中的表达和共存研究 被引量：1

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作者 韩飞 杨静 +3 位作者 余文富 尹一飞 武胜昔 凌树才 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期159-165,170,共8页

目的:探究GAD67-GFP基因敲入小鼠嗅球各细胞层中GAD67阳性神经元的分布及与一氧化氮合酶(bNOS)的共存。方法:对该实验室繁育的成年GAD67-GFP基因敲入小鼠利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因型等鉴定,取阳性GAD67-GFP基因敲入小鼠嗅球做冰... 目的:探究GAD67-GFP基因敲入小鼠嗅球各细胞层中GAD67阳性神经元的分布及与一氧化氮合酶(bNOS)的共存。方法:对该实验室繁育的成年GAD67-GFP基因敲入小鼠利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因型等鉴定,取阳性GAD67-GFP基因敲入小鼠嗅球做冰冻切片进行尼氏染色、免疫荧光染色,观察GAD67阳性神经元在嗅球各细胞层中的分布比例及与bNOS共存。结果:GAD67阳性神经元在嗅小球层、僧帽细胞层、颗粒细胞层所占比例分别为:(42.98±0.92)%、(23.64±0.84)%、(77.75±0.84)%,bNOS阳性神经元在球旁细胞层、僧帽细胞层有强阳性分布,而在颗粒细胞层几乎没有分布。GAD67与bNOS仅在嗅小球层偶有共存。结论:GAD67阳性神经元主要分布于嗅小球层与颗粒细胞层,GAD67与bNOS仅少数共存于嗅小球层。 展开更多

关键词 谷氨酸脱羧酶/遗传学 发光蛋白质类/遗传学 嗅球/解剖学和组织学 小鼠 基因敲除 神经元 一氧化氮合酶 GAD67-GFP GAD67 bNOS 共存

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Sedlin突变体S124A对其与PAM14相互作用的影响

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作者 汪云飞 朱恒锐 +4 位作者 张庆慧 邢昕 武标 刘晓颖 范礼斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2009年第1期10-13,共4页

目的构建Sedlin的点突变体,研究其与PAM14在酵母中的相互作用,寻找其相互作用的位点。方法用蛋白质在线序列分析软件CPHmodels预测Sedlin蛋白的磷酸化位点,可能的磷酸化位点主要有S2、S30、S119、S124、Y115,针对其中一个磷酸化位点(S1... 目的构建Sedlin的点突变体,研究其与PAM14在酵母中的相互作用,寻找其相互作用的位点。方法用蛋白质在线序列分析软件CPHmodels预测Sedlin蛋白的磷酸化位点,可能的磷酸化位点主要有S2、S30、S119、S124、Y115,针对其中一个磷酸化位点(S124)设计定点突变引物;以pAS-Sedlin为模板,以两条含有突变位点的互补序列为引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物用DpnⅠ酶切除去模板,消化产物转化大肠杆菌感受态DH5α,对得到的阳性克隆进行测序;将构建的定点突变质粒pAS-SedlinS与pACT2-PAM14共转化至酵母Y190中,并对生长至合适大小的克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析。结果构建了pAS-Sedlin的定点突变质粒pAS-SedlinS,其与pACT2-PAM14共转克隆的β-半乳糖苷酶活性反应呈阳性,并且Sedlin S124A蛋白与PAM14蛋白的相互作用比野生型Sedlin蛋白与PAM14蛋白相互作用强。结论成功构建了Sedlin S124A,Sedlin蛋白的S124并不是其与PAM14在酵母中相互作用的特异性结合位点。 展开更多

关键词 蛋白质类/遗传学 酵母菌/遗传学 双杂交系统技术 骨骺 脊柱/畸形

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