荧光环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)技术在病毒性出血性败血症(VHS)诊断中的应用 被引量：10

1

作者 安元龙 吴斌 +1 位作者 林长军 肇慧君 《中国动物检疫》 CAS 2012年第12期23-25,38,共4页

运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统,以LAMP法荧光检测为基础,建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。根据对VHSV病毒N基因序列的分析,针对病毒的高保守区域的6个特异性序列,设计了3对特异性引物... 运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统,以LAMP法荧光检测为基础,建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。根据对VHSV病毒N基因序列的分析,针对病毒的高保守区域的6个特异性序列,设计了3对特异性引物,同时加入dsDNA混合染料,对核酸扩增过程进行实时荧光监控。该方法的特异性良好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。敏感度高,检测限为20fgRNA模板。实验结果表明该方法是一种操作简单、快速高效、高特异性高灵敏度的病毒检测方法。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 荧光逆转录lamp法 诊断

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人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定 被引量：3

2

作者 贺伟峰 吴军 +5 位作者 易绍萱 罗高兴 陈希炜 郑峻松 马兵 雷晓 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第7期782-785,共4页

目的　构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8... 目的　构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果　成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。 展开更多

关键词 逆转录病毒载体 CTLA4IG基因 EGFP基因 IRES2 逆转录病毒 双基因共表达 基因重组 脂质体法 增强型绿色荧光蛋白

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食蟹猴(Macaca Fascicularis)血清中三种逆转录病毒抗体调查 被引量：1

3

作者 周亚敏 李绍东 段幸生 《中国实验动物学杂志》 1997年第2期73-74,共2页

本文用免疫荧光法（IFA）对657只食蟹猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴T淋巴细胞性病毒Ⅰ型（STLV－1）和D型逆转录病毒Ⅰ型（SRV－1）的血清抗体作了检查。SIV抗体阳性猴为95只（14.5％），STLV－1抗体阳性猴为98只（14．9％），SRV－1抗体... 本文用免疫荧光法（IFA）对657只食蟹猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴T淋巴细胞性病毒Ⅰ型（STLV－1）和D型逆转录病毒Ⅰ型（SRV－1）的血清抗体作了检查。SIV抗体阳性猴为95只（14.5％），STLV－1抗体阳性猴为98只（14．9％），SRV－1抗体阳性猴为119只（18．1％）。本文还比较了经不同饲养时间的猴群中三种逆转录病毒抗体的阳性检出率，结果表明：三种逆转录病毒抗体阳性率随饲养时间的增长而增高。同时查出了一种以上逆转录病毒抗体阳性的动物。 展开更多

关键词 逆转录病毒 抗体阳性率 SIV 血清抗体 食蟹猴 猴免疫缺陷病毒 免疫荧光法 饲养时间 动物 阳性检出率

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经典方法与LaSRT法测定绿色荧光蛋白标记重组病毒滴度的研究 被引量：15

4

作者 江千里 王健民 +2 位作者 江汕 温丽敏 周虹 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第10期1101-1103,共3页

目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl... 目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl带有GFP 标记基因的病毒感染,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以流式细胞仪检测细胞eGFP+率。病毒滴度(TU/ml)=(2×105×细胞eGFP+率)/病毒原液体积。(2)LaSRT法:NIH3T3 细胞以5 000/孔接种于96 孔板,12 h后更换成完全培养液90 μl/孔,以8孔为一组,第1 孔中加入病毒液10 μl,此后每孔依次10∶1 倍比稀释,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以浓度自高到低的方向,在荧光倒置显微镜下确定计量孔(第n孔),计数孔中的阳性细胞数m。病毒滴度(TU/ml)=m×10n+1。(3)对7批病毒以LaSRT法研究,探讨冻存/复苏过程对重组病毒滴度的影响。结果经典方法测定的重组病毒滴度为(1.54±0.38)×106 TU/ml,LaSRT法测定的病毒滴度为(1.33±0.57)×106 TU/ml,两者无统计学差异(P>0.05)。LaSRT法可以大批量、快速地测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度。单次冻存/复苏后的病毒滴度为冻存前的(18.1±9.9)%(n=7)。结论LaSRT法和经典方法测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度,结果无统计学差异; 展开更多

关键词 经典方法 LaSRT法 测定 绿色荧光蛋白 病毒滴度测定法 基因重组逆转录病毒

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LAMP法鸟类性别鉴定的研究与应用 被引量：7

5

作者 李巍 杨卓 +5 位作者 陈明非 高东梅 刘佳 苍真伟 程淑晶 王德强 《现代畜牧兽医》 2017年第3期12-18,共7页

本研究利用鸡W染色体中EE0.6序列上的Eco R片段为靶序列,进行引物设计,建立了基于LAMP法的快速鸟类性别鉴定方法。试验表明,该引物可用于多属种鸟类的性别鉴定,在64℃条件下,60 min即可完成检测。同时利用实时浊度法和荧光目视法两种LAM... 本研究利用鸡W染色体中EE0.6序列上的Eco R片段为靶序列,进行引物设计,建立了基于LAMP法的快速鸟类性别鉴定方法。试验表明,该引物可用于多属种鸟类的性别鉴定,在64℃条件下,60 min即可完成检测。同时利用实时浊度法和荧光目视法两种LAMP检测法对体系进行了敏感性试验,并与PCR方法进行比较,实时浊度法与荧光目视法敏感性相近,是PCR方法的100倍。方法建立后,在大连老虎滩鸟语林进行了11目14科35种鸟类的性别鉴定临床试验,符合率为100%。 展开更多

关键词 lamp 鸟类 性别鉴定 实时浊度法 荧光目视法

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PCR方法检测食品中沙门氏菌研究进展 被引量：16

6

作者 汪月霞 赵会杰 赵一丹 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第24期11435-11436,11445,共3页

对目前出现的一些具有代表性的食品中沙门氏菌的PCR检测方法做一综述,由此可以得出,目前开发出的检测食品中沙门氏菌的PCR方法正逐渐以多种PCR方法相结合、多重PCR技术以及食品样品预处理方法等为主,以开发出更快速、灵敏、简便、实时... 对目前出现的一些具有代表性的食品中沙门氏菌的PCR检测方法做一综述,由此可以得出,目前开发出的检测食品中沙门氏菌的PCR方法正逐渐以多种PCR方法相结合、多重PCR技术以及食品样品预处理方法等为主,以开发出更快速、灵敏、简便、实时、低廉的食源性沙门氏菌PCR检测方法。 展开更多

关键词 沙门氏菌 多重逆转录PCR 毛细管PCR 荧光定量PCR DNA环介导的恒温扩增法

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呼吸道标本的采集、储存和运送规范 被引量：7

7

作者 杨童玲 夏爱梅 +7 位作者 胡晓静 余艮珍 史欢 顾莺 张晓波 王传清 张崇凡 黄国英 《中国循证儿科杂志》 CSCD 北大核心 2020年第1期19-21,共3页

流感病毒检测最常见的是采集呼吸道标本,可采用拭子、刷子、吸出物和灌洗液获取呼吸道标本,可以采集鼻咽、口咽、鼻孔等.曾使用培养法或直接法荧光抗体法进行检测[1,2],现以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法,可以通过样本中少量的病毒核... 流感病毒检测最常见的是采集呼吸道标本,可采用拭子、刷子、吸出物和灌洗液获取呼吸道标本,可以采集鼻咽、口咽、鼻孔等.曾使用培养法或直接法荧光抗体法进行检测[1,2],现以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法,可以通过样本中少量的病毒核酸扩增而提高检测率[3].急性严重呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染流行期间,RT-PCR是SARS-CoV-2感染确诊的首选方法[4,5].检测准确性最高的标本是下呼吸道标本,但属于有创性操作.由于核酸扩增检测可以检测更低浓度的病毒,并且不需要细胞的存在,因此喉部拭子或唾液样本可能是进行分析的合适样本[6],但其检出率低于83%[7]. 展开更多

关键词 荧光抗体法 逆转录多聚酶链反应 呼吸道标本 拭子 灌洗液 冠状病毒 核酸扩增 吸出物

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血管生成素Ⅱ在低压性缺氧成年大鼠视网膜的表达 被引量：6

8

作者 张勇 王志斌 +3 位作者 周霞 许玲 芦晓磊 黄剑云 《眼科新进展》 CAS 2007年第10期758-761,共4页

目的探讨成年大鼠缺氧后血管生成素Ⅱ（angiopoietinⅡ,AngⅡ）在视网膜中的表达情况。方法成年Wistar大鼠暴露于低氧环境（70~90mL.L-1O2）2h后,分别在3h、24h、3d、7d和14d,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测An... 目的探讨成年大鼠缺氧后血管生成素Ⅱ（angiopoietinⅡ,AngⅡ）在视网膜中的表达情况。方法成年Wistar大鼠暴露于低氧环境（70~90mL.L-1O2）2h后,分别在3h、24h、3d、7d和14d,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测AngⅡ在视网膜中的表达情况。结果缺氧后3h、24h和3d,成年大鼠视网膜AngⅡmRNA水平与正常对照组相比分别增加120%、50%、30%（P〈0.05）,AngⅡ蛋白质水平与正常对照组相比分别增加了90%、32%、20%,而在7d和14d时其表达较正常对照组差异无显著性。结论缺氧可以使成年大鼠视网膜AngⅡ表达上调。 展开更多

关键词 血管生成素Ⅱ 缺氧 视网膜 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 蛋白免疫印迹法

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hTERT mRNA与p16蛋白在非小细胞肺癌中的表达 被引量：2

9

作者 冼磊 周华富 +3 位作者 张兴华 薛邦德 郭建极 冯旭 《中国肺癌杂志》 CAS 2009年第9期1005-1008,共4页

背景与目的端粒酶逆转录酶(hTERT)和p16参与多种肿瘤的发生发展。本研究旨在探讨端粒酶逆转录酶和p16在人非小细胞肺癌组织中的表达情况。方法应用实时荧光定量RT-PCR法和免疫组化SP法检测117例非小细胞肺癌组织及癌旁组织,21例肺良性... 背景与目的端粒酶逆转录酶(hTERT)和p16参与多种肿瘤的发生发展。本研究旨在探讨端粒酶逆转录酶和p16在人非小细胞肺癌组织中的表达情况。方法应用实时荧光定量RT-PCR法和免疫组化SP法检测117例非小细胞肺癌组织及癌旁组织,21例肺良性疾病组织中端粒酶逆转录酶和p16的表达情况。结果hTERT mRNA在非小细胞肺癌组织的表达量为2.937±0.836,明显高于正常肺组织2.042±0.378(t=-5.242,P<0.01);肺良性疾病中p16蛋白表达率为85.7%,高于癌组织中的47.9%,差异有统计学意义(P=0.004)。hTERT mRNA表达与非小细胞肺癌病理类型具有统计学意义(P<0.05),p16蛋白表达与非小细胞肺癌临床分期、淋巴结转移及细胞分化程度具有统计学意义(P<0.05)。hTERT mRNA与p16蛋白表达存在相关性(P<0.05)。结论hTERT mRNA表达对非小细胞肺癌诊断具有潜在临床价值,端粒酶逆转录酶和p16蛋白的表达情况与非小细胞肺癌的发生、发展有关。 展开更多

关键词 肺肿瘤 实时荧光定量RT-PCR法 端粒酶逆转录酶 P16蛋白

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电击死兔骨骼肌及心肌HSP 70 mRNA和c-fos mRNA表达 被引量：3

10

作者 王晔 刘敏 +3 位作者 程薇波 何桂琼 李凡 廖志钢 《法医学杂志》 CAS CSCD 2008年第4期245-247,251,共4页

目的研究电击死兔骨骼肌与心肌HSP 70 mRNA和c-fos mRNA表达变化,探究生前电击与死后电击的鉴别方法。方法15只新西兰兔,随机分电击死组、死后电击组和对照组,每组5只,用荧光RT-PCR技术检测骨骼肌与心肌热休克蛋白70(HSP 70)mRNA与c-fos... 目的研究电击死兔骨骼肌与心肌HSP 70 mRNA和c-fos mRNA表达变化,探究生前电击与死后电击的鉴别方法。方法15只新西兰兔,随机分电击死组、死后电击组和对照组,每组5只,用荧光RT-PCR技术检测骨骼肌与心肌热休克蛋白70(HSP 70)mRNA与c-fos mRNA表达水平,对所得结果进行统计学分析。结果生前电击兔骨骼肌及心肌HSP 70 mRNA与c-fos mRNA表达高于死后即刻电击者(P<0.05)。结论检测骨骼肌及心肌HSP 70 mRNA与c-fos mRNA表达变化有助于于生前电击与死后电击的鉴别。 展开更多

关键词 法医病理学 电击伤 荧光光度测定法 HSP 70热休克蛋白质类 基因 FOS 逆转录聚合酶链反应

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猪流行性腹泻实验诊断技术的研究进展 被引量：3

11

作者 叶丽 汤德元 +6 位作者 曾智勇 王彬 黄涛 胡玲玲 龙冬梅 石远菊 杨伟 《猪业科学》 2017年第11期104-106,共3页

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种猪的高度接触性的肠道传染病,该病以排水样稀粪、呕吐、脱水及哺乳仔猪高死亡率为主要特征,给生猪养殖业带来严重危害。猪流行性腹泻于20世纪80年代在我国暴发并流行至今,该病不仅发生范围... 猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种猪的高度接触性的肠道传染病,该病以排水样稀粪、呕吐、脱水及哺乳仔猪高死亡率为主要特征,给生猪养殖业带来严重危害。猪流行性腹泻于20世纪80年代在我国暴发并流行至今,该病不仅发生范围广、强度大、致死率高,且常与猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒及德尔塔冠状病毒等传染病混合感染,临床诊断并不能对该病确诊,必须运用一些实验室方法才能准确诊断该病。通过对猪流行性腹泻的酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光法(IF),RT-PCR诊断技术、多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、环介导等温扩增检测技术(LAMP)等几种实验室检测技术进行综述,以期对该病的诊断及确诊提供可靠的实验方法和一定的技术依据。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻 PCR技术 lamp技术 ELISA 免疫荧光法 诊断

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脑红蛋白在蛛网膜下腔出血大鼠脑组织中的表达 被引量：1

12

作者 李维德 孙青 +1 位作者 李松 杭春华 《中国脑血管病杂志》 CAS 2013年第8期416-420,共5页

目的研究脑红蛋白(Ngb)在大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)模型脑组织中的表达。方法将成年雄性Sprague-Dawley大鼠84只,随机分为对照组(12只)和SAH组(72只),SAH组再分为模型建立后3、6、12、24、48及72 h共6个亚组(每组12只)。通过改良后视交... 目的研究脑红蛋白(Ngb)在大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)模型脑组织中的表达。方法将成年雄性Sprague-Dawley大鼠84只,随机分为对照组(12只)和SAH组(72只),SAH组再分为模型建立后3、6、12、24、48及72 h共6个亚组(每组12只)。通过改良后视交叉池注血法建立大鼠SAH模型。应用Western Blot、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组化法,检测SAH后不同时间点脑组织中Ngb蛋白及其mRNA的表达水平水平变化和分布。结果①Western Blot结果显示,大鼠正常脑组织中Ngb含量较少(0.56±0.14)。SAH后3 h脑组织中Ngb表达蛋白水平开始升高(0.77±0.16),24 h达到高峰(1.27±0.18),与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05;其后逐渐下降。②实时荧光定量RT-PCR结果显示,大鼠脑组织Ngb mRNA从SAH后3 h开始增加,6 h达高峰,随后逐渐下降,至72 h基本下降到对照组水平。其中6 h及12 h组与对照组相比,差异有统计学意义,均P<0.01。③免疫组化染色结果显示,对照组大鼠脑组织中有少量Ngb表达阳性细胞,但多呈弱阳性表达,且在颞叶皮质表达较多,海马区也有少量表达;SAH后Ngb阳性细胞明显增多,并且多数呈强阳性表达,在颞叶皮质增高最明显。结论大鼠SAH后脑组织内Ngb蛋白及mRNA水平表达均上调,提示Ngb可能参与对SAH后早期脑损伤的保护作用。 展开更多

关键词 蛛网膜下腔出血 脑红蛋白 蛋白质印迹法 免疫组织化学 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 大鼠

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大鼠缺血脑中差异表达基因的研究

13

作者 皮荣标 银巍 +4 位作者 苏兴文 苏涛 邱鹏新 郑素秋 颜光美 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第9期1557-1562,共6页

目的鉴定大鼠脑缺血差异表达基因。方法复制大鼠大脑中动脉栓塞急性脑缺血模型,采用荧光差异显示RT-PCR法结合反Northern杂交快速鉴定差异表达基因。结果发现差异表达的基因9个,其中6个已知的序列和3个未知序列;已知基因中上调的是musmu... 目的鉴定大鼠脑缺血差异表达基因。方法复制大鼠大脑中动脉栓塞急性脑缺血模型,采用荧光差异显示RT-PCR法结合反Northern杂交快速鉴定差异表达基因。结果发现差异表达的基因9个,其中6个已知的序列和3个未知序列;已知基因中上调的是musmusculusab1-interactor1,homosapiensCGI-99protein,tissueinhibitorofmetalloproteinase3,homosapiensnuclearreceptorco-repressor,下调的是homo-sapiensnuclearmatrixproteinp84和coatomerproteincomplex,subunitgamma2。结论荧光差异显示法结合反Northern杂交是一种有效的快速鉴定差异表达基因的方法;脑缺血时,缺血侧和非缺血侧存在基因的差异表达。 展开更多

关键词 脑缺血 基因 印迹法 RNA 荧光差异显示 逆转录聚合酶链反应

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顺铂对人舌癌Tca8113细胞hTERT蛋白表达和端粒酶活性的影响 被引量：1

14

作者 陈鹏 雷德林 +2 位作者 刘冰 郭涛 商洪涛 《实用医学杂志》 CAS 2002年第11期1153-1154,共2页

目的 :探讨顺铂处理人舌癌Tca8113细胞前后细胞增殖活性和凋亡以及人类端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白表达和端粒酶活性的改变 ,进一步揭示顺铂的抗癌机制并初步探讨端粒酶作为化疗敏感性指标的可行性。方法 :以 1/2血药峰值浓度的顺铂处理... 目的 :探讨顺铂处理人舌癌Tca8113细胞前后细胞增殖活性和凋亡以及人类端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白表达和端粒酶活性的改变 ,进一步揭示顺铂的抗癌机制并初步探讨端粒酶作为化疗敏感性指标的可行性。方法 :以 1/2血药峰值浓度的顺铂处理人舌癌Tca8113细胞 12～ 72h ,应用MTT法检测细胞增殖活性 ,光镜观察细胞凋亡变化特征并计算调亡指数 ,用间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白含量 ,同时行TRAP PCR ELISA端粒酶活性检测。结果 :Tca8113细胞在顺铂作用后 ,细胞增殖活性明显下降 ;出现明显的凋亡 ;hTERT蛋白表达下降的同时端粒酶活性也相应下降 ,而且四者都有一定的时间依赖性。结论 :顺铂可使细胞增殖活性明显下降 ,诱导凋亡产生 ,下调hTERT蛋白表达及抑制端粒酶活性 。 展开更多

关键词 顺铂 舌肿瘤 抗癌机制 间接免疫荧光标记法 端粒酶逆转录酶 蛋白表达 端粒酶活性

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