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鸭IFN-β启动子及其NF-κB结合位点荧光素酶报告质粒的构建与活性检测 被引量：2
1
作者 张蓉蓉 卢琴 +5 位作者 王红琳 张腾飞 温国元 罗青平 汪最 邵华斌 《湖北农业科学》 2020年第S01期207-209,212,共4页
通过PCR方法,扩增得到鸭I型干扰素β(IFN-β)基因启动子功能区域的DNA片段和其4个重复NF-κB结合位点的DNA片段,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL4.2-basic载体上,构建了包含鸭IFN-β启动子及其NF-κB结合位点的荧光素酶报告质粒pdu... 通过PCR方法,扩增得到鸭I型干扰素β(IFN-β)基因启动子功能区域的DNA片段和其4个重复NF-κB结合位点的DNA片段,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL4.2-basic载体上,构建了包含鸭IFN-β启动子及其NF-κB结合位点的荧光素酶报告质粒pduIFN-β-luc和4×NF-κB-luc;分别将构建的两个报告质粒与海肾荧光素酶内参质粒pRL-TK用JetPEITM转染试剂共转染至鸭胚成纤维细胞系DEF,在转染24 h后,用poly(I∶C)刺激转染细胞,结果表明,与未刺激组相比,刺激组的荧光素酶活性均显著增加。为进一步研究鸭天然免疫信号通路提供了重要的研究工具。 展开更多
关键词 鸭干扰素β 启动子 荧光素酶报告质粒 Poly(I∶C) DTMUV
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大鼠Caspase8基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与IRF-1结合位点的鉴定 被引量：1
2
作者 单锴 邱文 +4 位作者 李妍 周建博 刘丽莎 赵聃 王迎伟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期291-296,共6页
目的:构建大鼠Caspase 8基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK293)中,过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对Caspase 8基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的IRF-1结合位点。方法... 目的:构建大鼠Caspase 8基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK293)中,过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对Caspase 8基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的IRF-1结合位点。方法:采用PCR技术,扩增出大鼠Caspase 8基因启动子序列(-1136～+101 nt),将Caspase 8基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。将Caspase 8基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-Caspase 8-FL)和大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对Caspase 8基因的启动作用。另用生物信息学软件预测Caspase 8基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建Caspase 8基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-Caspase8-1～4)。将上述Caspase 8基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功。将pGL3-Caspase8-FL和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,Caspase 8基因启动子活性显著增加。而将pGL3-Caspase 8-FL、pGL3-Caspase 8-1～4和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-Caspase 8-4的启动活性显著低于pGL3-Caspase 8-2和pGL3-Caspase 8-3。提示IRF-1可能结合在Caspase 8基因启动子的-336～-136 nt区域。结论:本实验成功构建了大鼠Caspase 8基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在Caspase 8基因启动子上的结合区域。 展开更多
关键词 CASPASE8 干扰素调节因子-1 荧光素酶报告质粒 启动子活性
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大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定
3
作者 周建博 邱文 +3 位作者 卢燕来 单锴 赵聃 王迎伟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期295-300,共6页
目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatoryfac... 目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatoryfactor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点。方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497～+166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用。同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1、pGL3-XAF1-2、pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)。将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功。将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加。而将pGL3-XAF1-QC、pGL3-XAF1(1～4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2。提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337～-47 nt区域。结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1) 干扰素调节因子-1(IRF-1) 启动子 生物信息学 荧光素酶报告质粒
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大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C/EBP β结合位点的鉴定 被引量：1
4
作者 庞蓉蓉 李妍 +5 位作者 张婧 单锴 邱文 何风霞 赵聃 王迎伟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期722-727,共6页
目的 :构建大鼠IL-6基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞(HEK293)中过表达CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)对该质粒基因启动子活性的影响。同时,筛选C/EBPβ与IL-6基因... 目的 :构建大鼠IL-6基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞(HEK293)中过表达CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)对该质粒基因启动子活性的影响。同时,筛选C/EBPβ与IL-6基因启动子区的结合位点。方法:采用PCR技术,扩增出大鼠IL-6基因启动子全长序列(-1 791～+30 nt),将IL-6基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。将IL-6基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-IL-6-1)和大鼠野生型C/EBPβ表达质粒(pIRES2-EGFP-C/EBPβ)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定C/EBPβ对IL-6基因的启动作用。另用生物信息学软件预测IL-6基因启动子上C/EBPβ潜在的结合位点,并构建IL-6基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-IL-6-2～5)。将上述IL-6基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和C/EBPβ过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选出C/EBPβ的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功。将pGL3-IL-6-1和pIRES2-EGFP-C/EBPβ共转染HEK293细胞发现,IL-6基因启动子活性显著增加。另将pGL3-IL-6-1、pGL3-IL-6-2～5和pIRES2-EGFP-C/EBPβ共转染HEK293细胞后发现,pGL3-IL-6-5的启动活性显著低于其他组。提示C/EBPβ可能结合在IL-6基因启动子的-618 bp～-126 bp区域。结论:成功构建了大鼠IL-6基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出了C/EBPβ在IL-6基因启动子上的结合部位。 展开更多
关键词 IL-6 CCAAT 增强子结合蛋白β(C EBPβ) 荧光素酶报告质粒 启动子活性
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鸭IFN-β启动子区域IRF1结合位点荧光素酶报告质粒的构建与活性检测
5
作者 张蓉蓉 王红琳 +5 位作者 卢琴 张腾飞 温国元 罗青平 汪最 邵华斌 《湖北农业科学》 2019年第S02期433-435,共3页
构建并鉴定鸭Ⅰ型干扰素β(IFN-β)基因启动区域的IRF1结合位点荧光素酶报告基因载体,并进行转录活性分析。通过PCR方法从鸭脾脏cDNA中克隆得到鸭干扰素启动子区域IRF1结合位点,通过连接转化亚克隆至含萤火虫荧光素酶报告基因pGL4.2-ba... 构建并鉴定鸭Ⅰ型干扰素β(IFN-β)基因启动区域的IRF1结合位点荧光素酶报告基因载体,并进行转录活性分析。通过PCR方法从鸭脾脏cDNA中克隆得到鸭干扰素启动子区域IRF1结合位点,通过连接转化亚克隆至含萤火虫荧光素酶报告基因pGL4.2-basic载体上,构建得到4个重复鸭源IRF1结合位点的荧光素酶报告基因载体4×IRF1-luc;用JetPEITM转染试剂将构建的报告基因转染至鸭胚成纤维细胞系DEF,在poly(I∶C)的刺激下,荧光素酶活性显著增加。 展开更多
关键词 鸭干扰素β启动子区域 IRF1 荧光素酶报告质粒 poly(I∶C)
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SRE元件报告质粒构建、转染和活性测定 被引量：2
6
作者 张弦 王友平 +1 位作者 刘璐 刘健 《合肥工业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期110-113,共4页
固醇调节元件结合蛋白(SREBP)是机体调控脂质合成的重要转录因子,其作用靶标是所调控基因启动子区域的SRE元件,构建该元件报告质粒对于评价SREBP相关活性物质的作用机制具有重要意义。文章扩增或人工合成了人LDLr基因启动子区域SRE元件... 固醇调节元件结合蛋白(SREBP)是机体调控脂质合成的重要转录因子,其作用靶标是所调控基因启动子区域的SRE元件,构建该元件报告质粒对于评价SREBP相关活性物质的作用机制具有重要意义。文章扩增或人工合成了人LDLr基因启动子区域SRE元件1次重复片段或3次重复片段,将其插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建了2种含有人SRE元件的荧光素酶报告质粒;将该报告质粒转染到人肝癌细胞HepG2中,胰岛素处理可以显著活化荧光素报告质粒,而25-羟基胆固醇和胆固醇结合处理可以强烈抑制。结果表明,所构建的质粒能成功地反映SREBP活性的改变,为体外快速检测SREBP活性相关调控物质提供了一个有效的平台。 展开更多
关键词 SRE元件 荧光素酶报告质粒 活性测定
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团头鲂白细胞介素6基因启动子报告载体的构建及活性分析 被引量：2
7
作者 扶晓琴 丁祝进 +2 位作者 饶友亮 王卫民 刘红 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期86-91,共6页
为了解鱼类白细胞介素6(IL-6)基因的转录调控原理及其免疫作用机制,构建5个团头鲂il-6基因启动子的荧光素酶报告质粒(PGL3-IL-6P),以PGL3-basic质粒作为阴性对照,将它们分别与内参质粒pRL-TK共转染进鲤EPC细胞,并用100ng/mL的LPS诱导转... 为了解鱼类白细胞介素6(IL-6)基因的转录调控原理及其免疫作用机制,构建5个团头鲂il-6基因启动子的荧光素酶报告质粒(PGL3-IL-6P),以PGL3-basic质粒作为阴性对照,将它们分别与内参质粒pRL-TK共转染进鲤EPC细胞,并用100ng/mL的LPS诱导转染过重组载体的细胞,24h后检测荧光素酶的活性。结果显示:与阴性对照组相比,质粒转染组PGL3-IL-6P-0、PGL3-IL-6P-1、PGL3-IL-6P-2、PGL3-IL-6P-3与PGL3-IL-6P-4的荧光素酶活性均明显升高,其中PGL3-IL-6P-4组的荧光素酶活性最高,表明该启动子缺失体(-379至+34)包含il-6的核心启动子。用LPS刺激转染过重组载体的细胞后发现,与未经LPS刺激的对照组相比,仅PGL3-IL-6P-4组的活性明显增强,而其余缺失体的活性则没有显著变化,这进一步表明PGL3-IL-6P-4缺失体包含核心启动子区,并推测该核心启动子区域存在的潜在转录因子NF-κB与C/EBPβ等可能是响应LPS刺激的重要作用元件。 展开更多
关键词 团头鲂 白细胞介素6 荧光素酶报告质粒 启动子活性 LPS
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转录因子ATF3对大鼠Gadd45β/γ基因启动活性的影响及其可能的结合部位 被引量：2
8
作者 周梦雅 何风霞 +7 位作者 张婧 刘玉 虞天一 卢燕来 王璐璐 赵聃 邱文 王迎伟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期26-32,共7页
目的 :构建大鼠生长阻滞及DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)β/γ启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在大鼠肾小球系膜细胞(glomerular messangial cells,GMCs)中过表达激活转录因子3... 目的 :构建大鼠生长阻滞及DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)β/γ启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在大鼠肾小球系膜细胞(glomerular messangial cells,GMCs)中过表达激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)后分别对大鼠Gadd45β/γ基因启动活性的影响。同时筛选其可能的ATF3结合位点。方法:采用PCR技术,将扩增出的大鼠Gadd45β基因启动子全长(-1 105^+236 nt)和Gadd45γ基因启动子全长(-913^+72nt)分别插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得Gadd45β/γ基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-Gadd45β/γ-FL),再将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别与课题组前期构建的大鼠野生型ATF3过表达质粒(p IRES2/ATF3)共转染GMCs,检测其荧光素酶活性,以确定ATF3对Gadd45β/γ基因的启动作用。另用生物信息学软件预测Gadd45β/γ基因启动子上ATF3潜在的结合位点,并据此构建4个Gadd45β和3个Gadd45γ基因启动子截短片段的荧光素酶报告质粒。将Gadd45β/γ基因启动子全长和各截短片段的荧光素酶报告质粒与p IRES2/ATF3共转染GMCs,再行荧光素酶活性测定,以筛选ATF3的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠Gadd45β/γ基因启动子(全长和截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别和p IRES2/ATF3共转染GMCs发现,Gadd45β/γ基因启动子活性均显著增加。而将Gadd45β启动子全长及4个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45β-4的启动活性显著低于p GL3-Gadd45β-FL、p GL3-Gadd45β-1、p GL3-Gadd45β-2和p GL3-Gadd45β-3。提示ATF3可能结合在Gadd45β基因启动子的(-146^+23 nt)区域。同样,将Gadd45γ启动子全长及3个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45γ-2、p GL3-Gadd45γ-3的启动活性显著低于p GL3-Gadd45γ-FL和p GL3-Gadd45γ-1。提示ATF3可能结合在Gadd45γ基因启动子的(-456^-61 nt)区域,且这段区域可能包含1个以上ATF3结合位点。结论:成功构建了大鼠Gadd45β/γ基因启动子全长及各截短片段荧光素酶报告质粒,并初步确定了ATF3在Gadd45β/γ基因启动子上的结合区域。 展开更多
关键词 生长阻滞和DNA损伤基因45(Gadd45) 激活转录因子3(ATF3) 荧光素酶报告质粒 启动子活性
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转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位
9
作者 王璐璐 何风霞 +5 位作者 赵聃 虞天一 张婧 卢燕来 邱文 王迎伟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期143-148,共6页
目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能... 目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686^-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286^-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。 展开更多
关键词 补体应答基因32 髓锌指基因1 荧光素酶报告质粒 启动子活性
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小鼠 Usp2基因序列分析、真核表达载体构建和启动子功能鉴定
10
作者 张宇 李超 +5 位作者 马天天 马白荣 李丹 周栋 靳亚平 陈华涛 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第9期49-59,共11页
为了分析小鼠泛素特异性蛋白酶2(USP2)2种主要转录本(Usp 2-45和Usp 2-69)及其编码蛋白的理化特性,构建Usp 2-45真核表达载体和Usp 2启动子荧光素酶报告质粒,探究生物钟系统对Usp 2不同转录本启动子的调控作用,本试验利用在线软件对小鼠... 为了分析小鼠泛素特异性蛋白酶2(USP2)2种主要转录本(Usp 2-45和Usp 2-69)及其编码蛋白的理化特性,构建Usp 2-45真核表达载体和Usp 2启动子荧光素酶报告质粒,探究生物钟系统对Usp 2不同转录本启动子的调控作用,本试验利用在线软件对小鼠Usp 2-45和Usp 2-69基因进行生物信息学分析;克隆Usp 2-45基因的蛋白编码序列(CDS)并构建pcDNA3.1-Usp2-45-Flag重组载体,转染至小鼠NIH3T3胚胎成纤维细胞后,利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测Usp2-45在mRNA和蛋白水平的表达;扩增Usp 2-45和Usp 2-69的启动子片段,并构建其荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶报告试验检测Usp 2启动子对生物钟核心转录因子脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1(BMAL1)和昼夜运动输出周期蛋白(CLOCK)的应答活性;通过构建不同长度的Usp 2-45启动子荧光素酶报告质粒鉴定其生物钟转录调控功能区。结果显示,小鼠USP2-45和USP2-69蛋白均为不稳定蛋白,亲水性强,无跨膜区域和信号肽,且基因的CDS区高度保守;pcDNA3.1-Usp2-45-Flag重组质粒的酶切和测序结果与预期一致,转染重组质粒组的Usp2-45在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于对照组(P<0.01)。双荧光素酶报告试验结果显示,Usp 2-69启动子对BMAL1/CLOCK无应答活性,而不同长度的Usp 2-45启动子对BMAL1/CLOCK均具有显著应答活性,活性由强到弱依次为1368、2004和998 bp。结果表明,本试验系统分析了小鼠USP2的理化性质和结构特性,成功构建了pcDNA3.1-Usp2-45-Flag真核表达载体,初步鉴定了生物钟系统选择性调控Usp 2-45节律性转录的启动子功能区。 展开更多
关键词 泛素特异性蛋白酶2 生物钟 生物信息学 真核表达载体 荧光素酶报告质粒
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