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一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析 被引量：32
1
作者 曾伟伟 王庆 +4 位作者 刘永奎 张乐生 刘宝芹 石存斌 吴淑勤 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期790-795,共6页
从江西南昌患出血病草鱼体内分离出的草鱼病毒(暂命名为JX09-01)能使草鱼肾脏细胞(CIK)、草鱼肝细胞(L8824)、草鱼吻端成纤维细胞(PSF)产生明显的细胞病变效应(CPE)。感染CIK细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量病毒聚集,形态和排... 从江西南昌患出血病草鱼体内分离出的草鱼病毒(暂命名为JX09-01)能使草鱼肾脏细胞(CIK)、草鱼肝细胞(L8824)、草鱼吻端成纤维细胞(PSF)产生明显的细胞病变效应(CPE)。感染CIK细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量病毒聚集,形态和排列方式与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)相似。针对GCRV 873株S6基因设计的简并引物可以从病料组织和感染细胞中扩增出目的条带,而针对GCRV HZ08株S6基因设计特异性引物未能扩增出目的条带。对JX09-01株的S6全基因进行序列分析表明,其核苷酸序列同GCRV 873株和HZ08株的同源性分别是99.3%和30.4%,推导出的氨基酸序列同源性分别是98.6%和30%,说明草鱼病毒JX09-01株为草鱼呼肠孤病毒。用JX09-01株接种当年8—10 cm左右的草鱼,没有明显的临床症状,不能致草鱼死亡。用传代至15代的CIK细胞病毒液进行免疫保护试验,结果显示其对强毒株的免疫保护率达到86.7%。实验结果初步显示,新分离到的JX09-01为草鱼呼肠孤病毒弱毒株,可作为弱毒疫苗的候选毒株。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 分离 鉴定 序列分析 免疫原性
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草鱼呼肠孤病毒湖州分离株的分离及鉴定 被引量：21
2
作者 郝贵杰 沈锦玉 +3 位作者 潘晓艺 徐洋 姚嘉赟 尹文林 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2011年第1期47-52,共6页
2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8~10 cm的草鱼鱼种。5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡。将无菌处理的病样滤液接种草鱼... 2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8~10 cm的草鱼鱼种。5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡。将无菌处理的病样滤液接种草鱼肾细胞（CIK）,连续接5代均出现明显的细胞病变（CPE）,并与草鱼呼肠孤病毒参考株所产生的CPE一致。该株病毒的TCID50为10-8/0.1ml。内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察,发现组织内有大量的病毒颗粒,大小均一,近似球形,直径约70~75 nm。理化鉴定表明,氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比并没有多大变化,说明该株病毒对氯仿和乙醚有一定的抗性。经草鱼呼肠孤病毒特异性的RT-PCR检测,获得阳性的目的片段,测序的结果与草鱼呼肠孤病毒相应序列的同源性达99%以上。上述鉴定结果表明所分离的病毒为草鱼呼肠孤病毒,将其命名为HZ2008。 展开更多
关键词 草鱼 草鱼呼肠孤病毒 草鱼肾细胞 分离 鉴定
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两株草鱼呼肠孤病毒江西株的分离与鉴定 被引量：29
3
作者 徐洋 郝贵杰 +4 位作者 沈锦玉 郑善坚 潘晓艺 姚嘉赟 尹文林 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2010年第3期44-49,共6页
对从江西省南昌县莲塘镇的患病草鱼鱼种池塘采集到草鱼出血病疑似病样材料分离出的两株病毒株进行了鉴定。结果显示:用除菌过滤后的患病鱼肝脏、脾脏、肾脏组织浆滤液腹腔注射感染8～10 cm健康草鱼鱼种,5 d后试验鱼发病,可复制出自然发... 对从江西省南昌县莲塘镇的患病草鱼鱼种池塘采集到草鱼出血病疑似病样材料分离出的两株病毒株进行了鉴定。结果显示:用除菌过滤后的患病鱼肝脏、脾脏、肾脏组织浆滤液腹腔注射感染8～10 cm健康草鱼鱼种,5 d后试验鱼发病,可复制出自然发病症状,死亡率达50%以上,对照组未有死亡。用病样滤液接种草鱼肾细胞系(CIK),可产生细胞病变效应(CPE),病毒的TCID50分别为10-8.3/0.1 mL和10-8.0/0.1 mL。理化特性研究结果显示:氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比变化不显著。病毒基因组RT-PCR反应可扩增出目的片段,序列测定与分析结果表明,其与GenBank中GCRV(登录号为AF403392,AF239175)相应序列的同源性达99%以上。 展开更多
关键词 草鱼(Ctenopharyngodon idellus) 呼肠孤病毒 江西株 分离 鉴定
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草鱼呼肠孤病毒分子生物学研究进展 被引量：12
4
作者 李永刚 曾伟伟 +4 位作者 王庆 殷亮 王英英 石存斌 吴淑勤 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第4期97-103,共7页
由草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病是危害我国淡水养殖业,尤其是草鱼养殖业最为重要的疫病,论文就近年来国内外对草鱼呼肠孤病毒一般生物学特性、基因组特征、蛋白及其功能、细胞培养特性、致病机理、分子生物学诊断技术等各方面的研究... 由草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病是危害我国淡水养殖业,尤其是草鱼养殖业最为重要的疫病,论文就近年来国内外对草鱼呼肠孤病毒一般生物学特性、基因组特征、蛋白及其功能、细胞培养特性、致病机理、分子生物学诊断技术等各方面的研究进展进行综述,为草鱼呼肠孤病毒的进一步深入研究和草鱼出血病的防控提供参考。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 草鱼出血病 分子生物学
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草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发与应用 被引量：7
5
作者 高岩 裴超 +2 位作者 张超 李筝 孔祥会 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期237-242,共6页
随着水产养殖产业的不断扩大,我国已成为世界上最大的水产品生产消费和进出口国家。2000年至2013年,水产养殖产量以每年5%~6%稳步增长,在2013年,中国水产养殖产量达4.542×10~7t,占全球水产养殖总产量的60%以上[1]。根据世界粮农组... 随着水产养殖产业的不断扩大,我国已成为世界上最大的水产品生产消费和进出口国家。2000年至2013年,水产养殖产量以每年5%~6%稳步增长,在2013年,中国水产养殖产量达4.542×10~7t,占全球水产养殖总产量的60%以上[1]。根据世界粮农组织数据显示,2015年我国水产养殖总量达7.430×107 t。这些数据表明我国水产养殖业不仅保障了中国水产品的市场供应, 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 疫苗研发 免疫预防
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草鱼呼肠孤病毒上调稀有鮈鲫鳃中TLR3和Mx基因的表达(英文) 被引量：9
6
作者 苏建国 朱作言 汪亚平 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期728-734,共7页
鳃暴露在水环境中,增加了对疾病的易感性。为了研究稀有鮈鲫人工感染草鱼呼肠孤病毒过程中鳃部先天性免疫反应机制,我们克隆了抗病毒效应分子Mx基因的部分序列,用适时荧光定量PCR检测双链RNA的模式识别受体(Toll-like receptor3,TLR3)及... 鳃暴露在水环境中,增加了对疾病的易感性。为了研究稀有鮈鲫人工感染草鱼呼肠孤病毒过程中鳃部先天性免疫反应机制,我们克隆了抗病毒效应分子Mx基因的部分序列,用适时荧光定量PCR检测双链RNA的模式识别受体(Toll-like receptor3,TLR3)及I型干扰素指示基因Mx的表达。TLR3和Mx基因的表达在注射病毒后12h显著升高(p<0.05),TLR3的表达水平在注射后48h恢复到正常水平(p>0.05),而Mx的高水平表达一直持续到实验结束(p<0.05)。结果表明在GCRV感染中,鳃能发生局部免疫反应,其干扰素途径被激活。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 鳃 稀有鮈鲫 MX TLR3
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草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建 被引量：6
7
作者 周勇 范玉顶 +3 位作者 徐进 李艳秋 肖艺 曾令兵 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2009年第4期40-44,共5页
以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PC... 以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 VP6基因 植物表达载体 构建
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鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞凋亡 被引量：7
8
作者 屈三甫 张小榕 +5 位作者 郑从义 胡国斌 艾桃山 丁桂珍 喻运珍 刘颖 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期616-621,共6页
采用荧光显微镜、电子显微镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪分析等技术研究鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞 (CIK)凋亡。结果显示 ,鱼呼肠孤病毒感染CIK细胞后 ,光镜下可见空斑形成 ;荧光染色观察到细胞凋亡碎裂核 ;且电镜下呈现细胞核裂解 ... 采用荧光显微镜、电子显微镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪分析等技术研究鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞 (CIK)凋亡。结果显示 ,鱼呼肠孤病毒感染CIK细胞后 ,光镜下可见空斑形成 ;荧光染色观察到细胞凋亡碎裂核 ;且电镜下呈现细胞核裂解 ,核周裂隙增大 ,细胞膜内陷并出泡形成凋亡小体现象 ;琼脂糖凝胶电泳出现 1 80— 2 0 0bp整数倍的DNA梯形带 ;流式细胞仪检测到典型的细胞凋亡峰 ,在病毒感染 48h ,细胞凋亡百分率达 1 5%。上述结果显示 ,鱼呼肠孤病毒诱导CIK细胞凋亡是其致细胞病变死亡的重要表现形式之一。 展开更多
关键词 鱼呼肠孤病毒 草鱼肾细胞 细胞凋亡
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草鱼呼肠孤病毒的致病机制及抗病毒新对策 被引量：13
9
作者 郭帅 李家乐 吕利群 《渔业现代化》 北大核心 2010年第1期37-42,共6页
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引发草鱼病毒性出血病,是危害性最大的草鱼病原体。该病毒基因组由11条双链RNA组成,共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。报告总结了呼肠孤病毒在基因表达、蛋白质合成、细胞凋亡、细胞融合、... 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引发草鱼病毒性出血病,是危害性最大的草鱼病原体。该病毒基因组由11条双链RNA组成,共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。报告总结了呼肠孤病毒在基因表达、蛋白质合成、细胞凋亡、细胞融合、细胞膜渗透、干扰素分泌、细胞分裂以及细胞压力小体等方面与宿主细胞相互作用的生物学研究进展;论述了蛋白酶抑制剂、RNA干扰(RNAi)机制、干扰素诱导素、GCRV干扰颗粒及小分子化合物等抗病毒策略的分子作用机制。报告预测基于中草药的免疫增强剂和口服化基因工程抗病毒疫苗将是最容易被市场化的两种绿色抗草鱼出血病药物。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 草鱼出血病 抗病毒 药物
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草鱼呼肠孤病毒JX-0901株FQ-PCR检测方法的建立及其在定量分析中的应用 被引量：5
10
作者 刘宝芹 曾伟伟 +5 位作者 王庆 张乐生 王英英 石存斌 李华 吴淑勤 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期139-143,共5页
根据GCRV JX-0901株S7基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了针对GCRV JX-0901株病毒的TaqMan实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并利用FQ-PCR方法对该毒株在不同鱼类细胞中的增殖情况和不同温度条件下的稳定性进行了定量分析。... 根据GCRV JX-0901株S7基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了针对GCRV JX-0901株病毒的TaqMan实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并利用FQ-PCR方法对该毒株在不同鱼类细胞中的增殖情况和不同温度条件下的稳定性进行了定量分析。结果显示,建立的FQ-PCR方法的Ct值与标准品在1.0×101～1.0×108拷贝/μL浓度范围呈良好的线性关系,R2高达0.999;该方法有较好的敏感性和特异性,最低模板检出量为10个拷贝,只能特异地检测出GCRV JX-0901,不能检出其他鱼类常见病毒。该毒株能在10种常见鱼类细胞中增殖,其中在L8824细胞中的增殖量最大,含量达到4.1933×107拷贝/μL;此外,该毒株对温度敏感性较弱,病毒在48、56℃条件下放置96 h后才失去对CIK细胞感染性,而在4、15、28、37℃条件下放置32d,-20℃条件下储存2年仍具有较高的含量和较强的感染性。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 JX-0901株 FQ-PCR 定量分析
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草鱼呼肠孤病毒VP5蛋白的表达与纯化 被引量：5
11
作者 方珍珍 景宏丽 +3 位作者 江育林 张利峰 张旻 李华 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期508-512,共5页
从草鱼Ctenopharyngodon idellus出血病病原——草鱼呼肠孤病毒GCRV-873株扩增病毒的外壳蛋白(GCRV-VP5)基因,并将GCRV-VP5基因克隆到原核表达载体pET-30α,转化至大肠杆菌E.coli BL-21(DE3)中后,用IPTG诱导培养,获得带有重组质粒菌体... 从草鱼Ctenopharyngodon idellus出血病病原——草鱼呼肠孤病毒GCRV-873株扩增病毒的外壳蛋白(GCRV-VP5)基因,并将GCRV-VP5基因克隆到原核表达载体pET-30α,转化至大肠杆菌E.coli BL-21(DE3)中后,用IPTG诱导培养,获得带有重组质粒菌体的总蛋白。用GCRV-873毒株免疫山羊得到的抗血清作为一抗进行免疫印迹试验,结果在硝酸纤维素膜上检测到在相对分子质量为77 000处有特异性免疫条带,与预测的GCRV-873 VP5蛋白一致,提示大肠杆菌融合表达草鱼出血病病毒的VP5蛋白。表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,经柱层析纯化后蛋白纯度可达90%。本试验中获得的融合蛋白可为后期免疫动物提供了抗原,也为建立GCRV免疫学检测方法提供了依据。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 衣壳蛋白 原核表达
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基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：5
12
作者 黄琦雯 王庆 +7 位作者 王英英 李莹莹 石存斌 任燕 高彩霞 吴杰兴 郑树城 曾伟伟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期804-809,共6页
基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)是当前引起草鱼出血病暴发与流行的主要病原,为建立快速检测GCRV-Ⅱ的方法,本研究根据GCRV-ⅡRd Rp基因的保守区域序列设计引物及TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测GCRV-Ⅱ的荧光定量PCR方法。结果... 基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)是当前引起草鱼出血病暴发与流行的主要病原,为建立快速检测GCRV-Ⅱ的方法,本研究根据GCRV-ⅡRd Rp基因的保守区域序列设计引物及TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测GCRV-Ⅱ的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法仅对GCRV-Ⅱ的靶基因序列进行扩增,与其它非靶目标核酸均无交叉反应;其最低检出量为3拷贝/μL病毒核酸,比普通PCR的敏感度高100倍;组内和组间重复试验变异系数均小于1%。采用该方法检测60份草鱼出血病疑似样品,GCRV-Ⅱ阳性检出率为75%(45/60),与细胞分离结果一致。应用该方法分析了GCRV-Ⅱ在不同细胞和不同培养方式下病毒的增殖含量,结果显示GSB和PSF细胞增殖量最大,达106拷贝/μL^107拷贝/μL病毒核酸,转瓶接种比常规的细胞培养瓶和培养板接种其病毒含量低2个数量级。本研究建立的GCRV-ⅡTaqMan荧光定量PCR方法具有高效、特异、敏感、可重复性强的优点,适用于GCRV-Ⅱ的临床快速检测和病毒定量分析。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 基因Ⅱ型 TAQ Man荧光定量PCR 检测方法
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草鱼呼肠孤病毒AH528株全基因组特征及进化分析 被引量：3
13
作者 吴明林 李海洋 +3 位作者 江河 何吉祥 侯冠军 蒋阳阳 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2018年第5期36-43,共8页
草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的严重危害1~2龄草鱼的一种传染性疾病。本研究从安徽合肥地区患典型草鱼出血病的病鱼组织中分离到1株新的GCRV致病株,暂命名为GCRV-AH528。鱼体人工感染实验结果显示,实验... 草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的严重危害1~2龄草鱼的一种传染性疾病。本研究从安徽合肥地区患典型草鱼出血病的病鱼组织中分离到1株新的GCRV致病株,暂命名为GCRV-AH528。鱼体人工感染实验结果显示,实验鱼出现典型的出血病症状:体背发黑,鳍基部、腹部、口腔、鳃丝、肠道充血发红。全基因组特征分析显示,GCRV-AH528由11个双链RNA节段组成,节段大小在1027~3925 bp之间,AT平均含量为50.2%,GC平均含量为49.8%。与其他GCRVⅡ型毒株相比,L1节段在701~702位置缺少3个核苷酸(TAT),少编码1个酪氨基;M4节段出现突变,含2个开放阅读框,编码2个非结构蛋白NS9和NS69。所有节段两端均含有6 bp保守的末端核苷酸序列5'-GUAAU/CU…UU/GCAUC-3';另除L1、M6节段外,其余9个节段均在编码区两侧发现5~9 bp的颠倒互补序列。GCRV-AH528与其他呼肠孤病毒核苷酸平均相似度在37.1%~98.1%之间;编码蛋白平均相似度在24.3%~98.3%之间。基于VP1蛋白的聚类分析结果显示,该病毒属于水生呼肠孤病毒属,在氨基酸水平上与典型株GCRV-873株的进化关系较远。本研究结果表明,该毒株为一株新的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型致病株。 展开更多
关键词 草鱼出血病 草鱼呼肠孤病毒 VP1蛋白 水生呼肠孤病毒
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草鱼呼肠孤病毒的研究进展 被引量：16
14
作者 肖雪 颜其贵 +9 位作者 欧洋 曹洪志 樊汶樵 李冰 赖维莉 张传斌 周磊 冯婷 林涛 刘亚 《水利渔业》 北大核心 2006年第5期106-109,共4页
草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒,严重危害着我国淡水渔业的养殖。基因组由11条分节段dsRNA组成,编码11种结构多肽。GCRV能够合成内源性RNA聚合酶,在体外转录。总结了近20年来我国在GCRV... 草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒,严重危害着我国淡水渔业的养殖。基因组由11条分节段dsRNA组成,编码11种结构多肽。GCRV能够合成内源性RNA聚合酶,在体外转录。总结了近20年来我国在GCRV形态结构、理化特性、培养特性、分子生物学以及预防治疗等方面的研究成果,提出了GCRV的重要酶类作为RNA干涉靶基因的思路。由于中和效价最高的蛋白基因M6在毒株中具有相对保守性,初步确认了基因工程亚单位疫苗开发的可行性。 展开更多
关键词 草鱼出血病 草鱼呼肠孤病毒(GCRV) DSRNA 理化特性 培养特性
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一株草鱼呼肠孤病毒检测用单克隆抗体的制备及其特性 被引量：4
15
作者 杨倩 曹海鹏 +2 位作者 和永杏 姜有声 吕利群 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期240-241,共2页
草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒（Grass CrapReovirus,GCRV）引起的病毒性疾病,传染性强,对草鱼的致死率极高,是危害我国水产养殖业最严重的疾病之一[1]。因此,采用快速有效的手段检测草鱼呼肠孤病毒对诊断草鱼出血病具有重要的意义。
关键词 呼肠孤病毒 病毒检测 单克隆抗体 草鱼 病毒性疾病 制备 出血病 传染性
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草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用 被引量：4
16
作者 王晓丰 薛晖 +2 位作者 丁正峰 唐建清 夏爱军 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第2期213-216,共4页
为了解草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)的感染流行情况及早期临床诊断的需要,研究并建立了该病毒的RT-PCR检测方法。根据GenBank中GCRV VP6蛋白基因保守序列设计引物,以GCRV弱毒疫苗株GCHV-892总RNA为模板,RT-PCR反应扩增出71... 为了解草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)的感染流行情况及早期临床诊断的需要,研究并建立了该病毒的RT-PCR检测方法。根据GenBank中GCRV VP6蛋白基因保守序列设计引物,以GCRV弱毒疫苗株GCHV-892总RNA为模板,RT-PCR反应扩增出712 bp的目的条带,并对PCR反应体系和反应程序进行了优化,测定了该方法的敏感性和特异性。敏感性试验结果表明以含VP6蛋白基因的重组质粒为模板,该PCR方法的最低检测限为102copies.μL-1,特异性试验表明该引物仅能扩增GCRV核酸,而与白斑综合征病毒(WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)无交叉反应性。应用所建立的RT-PCR方法检测了7份疑似出血病草鱼病样,3份病料获得了阳性扩增,随机挑选其中的1份阳性样品经克隆后测序,结果显示与GenBank中已知序列最高有99%的相似性。 展开更多
关键词 草鱼出血病 呼肠孤病毒 RT-PCR 检测方法
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草鱼呼肠孤病毒HZ08株S4基因序列分析 被引量：4
17
作者 曾伟伟 王庆 +5 位作者 张超 张乐生 刘宝芹 刘永奎 石存斌 吴淑勤 《生物学杂志》 CAS CSCD 2012年第2期12-17,共6页
草鱼呼肠孤病毒HZ08株是本实验室从患出血病草鱼体内分离到的一个新毒株,已完成部分基因序列的分析,其氨基酸序列的同源性和873株相比,仅为20%～30%之间。因序列差异较大,无法通过设计特异性引物来扩增和分析其基因序列,采用单引物扩增... 草鱼呼肠孤病毒HZ08株是本实验室从患出血病草鱼体内分离到的一个新毒株,已完成部分基因序列的分析,其氨基酸序列的同源性和873株相比,仅为20%～30%之间。因序列差异较大,无法通过设计特异性引物来扩增和分析其基因序列,采用单引物扩增技术,对HZ08株S4基因进行序列分析表明:S4全长为2263 bp,最大的ORF编码717个氨基酸,推导出其表达的蛋白约为79 kDa。正如其他基因节段,基因末端也含有保守碱基序列5'(GUAAUUU…UUCAUC),3'。S4基因推导的氨基酸序列与同宿主的其他呼肠孤病毒的非结构蛋白NS1同源性最大,其次是和哺乳动物正呼肠孤病毒的非结构蛋白mu-NS以及禽呼肠孤病毒非结构蛋白NS1同源性较大,表明S4可能表达细胞骨架相关蛋白。基于S4推导出的氨基酸序列构建的系统进化树HZ08株单独作为一个分支,与同宿主的其他呼肠孤病毒亲缘关系比较近,而与其他呼肠孤病毒则相对较远。这提示HZ08株可能是多个毒株的遗传信息经长期的遗传进化而得,综合其它已知序列信息,推测HZ08株可能为呼肠孤病毒的一个新成员。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 S4基因 序列分析 遗传进化树
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草鱼呼肠孤病毒vp5基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测 被引量：7
18
作者 谢吉国 闫秀英 +1 位作者 简纪常 吴灶和 《广东海洋大学学报》 CAS 2012年第3期42-48,共7页
根据草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)的vp5基因设计特异性引物,并扩增其开放阅读框序列(open reading frame,ORF),然后连接至pGBKT7载体上构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-vp5,转化至酵母菌Y2HGold,并进行PCR鉴定以及自激活性... 根据草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)的vp5基因设计特异性引物,并扩增其开放阅读框序列(open reading frame,ORF),然后连接至pGBKT7载体上构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-vp5,转化至酵母菌Y2HGold,并进行PCR鉴定以及自激活性和毒性检测。PCR、酶切以及测序表明,pGBKT7-vp5重组诱饵载体构建成功。自激活性和毒性检测显示,阳性重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold和阴性对照菌株pGBKT7/Y2HGold在SD/-Trp平板上出现大小相一致的乳白色菌落,且在SD/-Trp/X-α-Gel、SD/-Trp/AbA+/X-α-Gel平板上生长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/-Ade/-His无菌落出现。表明重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold表达的融合蛋白激活了报告基因AUR1-C和MEL1,没有激活报告基因ADE2和HIS3并且对宿主菌无毒性。该重组诱饵载体可用于酵母双杂交系统进一步筛选cDNA文库中与其相互作用的蛋白。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 酵母双杂交系统 诱饵载体 自激活性
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草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7重组疫苗的构建及其免疫效力评价 被引量：3
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作者 徐诗英 李婧慧 +5 位作者 邹勇 刘林 贡成良 曹广力 薛仁宇 陈辉 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期659-664,共6页
为探明呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7基因工程亚单位疫苗产生的抗体效价水平和免疫保护力,用RT-PCR方法,从GCRV中扩增到VP7基因片段,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,得到重组质粒pET-VP7,酶切鉴定后,将pET-VP7转化到大肠杆菌BL21(D... 为探明呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7基因工程亚单位疫苗产生的抗体效价水平和免疫保护力,用RT-PCR方法,从GCRV中扩增到VP7基因片段,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,得到重组质粒pET-VP7,酶切鉴定后,将pET-VP7转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,产生的重组蛋白经变性和复性后,按0.5、1.0、2.0 mg/尾的注射剂量分为3个免疫组,以等体积的氢氧化铝为佐剂进行注射。经SDS-PAGE电泳分析,发现了相对分子质量为34 000的蛋白表达带;Western Blot检测结果显示表达的蛋白具有很好的抗原性;间接凝集试验结果表明,3个免疫组均有抗体产生;攻毒试验结果表明,0.5、1.0、2.0 mg/尾重组蛋白剂量组的保护率分别为90%、85%、90%,对照组为0,表明所构建的疫苗具有较好的免疫作用。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 VP7蛋白 重组疫苗 免疫效力
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草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立 被引量：4
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作者 王晓丰 薛晖 +3 位作者 丁正峰 唐建清 夏爱军 熊怀生 《福建农业学报》 CAS 2012年第5期465-469,共5页
为更加快速、灵敏地检测草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV),建立环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据GenBank中GCRV HZ08等毒株VP6蛋白基因序列设计引物,以GCRV弱毒疫苗株(GCHV-892)总RNA为模板建立RT-LAMP反应,对扩增产物... 为更加快速、灵敏地检测草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV),建立环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据GenBank中GCRV HZ08等毒株VP6蛋白基因序列设计引物,以GCRV弱毒疫苗株(GCHV-892)总RNA为模板建立RT-LAMP反应,对扩增产物用限制性内切酶PvuⅡ进行酶切鉴定,所得酶切产物大小符合预期值。随后对LAMP反应体系包括Mg2+、dNTPs、甜菜碱(betaine)和内外引物浓度比进行了优化,并以含VP6蛋白基因的重组质粒(pEASY-VP6)为模板考量了该方法的敏感性,结果显示最低检测限为10copies.μL-1,比RT-PCR检测方法敏感10倍。特异性试验表明与白斑综合征病毒(WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)无交叉反应。应用RT-LAMP方法检测16份疑似出血病草鱼,6份病料获得了阳性扩增,与RT-PCR检测结果一致。 展开更多
关键词 草鱼出血病 呼肠孤病毒 逆转录环介导等温扩增 检测方法
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