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长春花茉莉酸-异亮氨酸合成酶CrJAR1生物信息学分析与原核表达 被引量：6
1
作者 林颖 王燕燕 于放 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1181-1187,共7页
长春花(Catharanthus roseus)可以产生多种萜类吲哚生物碱,其中包括多种天然的抗癌药物,但合成含量很低,茉莉酸信号通路可以调控这些萜类吲哚生物碱的生物合成,茉莉酸-异亮氨酸合成酶为茉莉酸信号通路中的关键元件。为了研究其功能,该... 长春花(Catharanthus roseus)可以产生多种萜类吲哚生物碱,其中包括多种天然的抗癌药物,但合成含量很低,茉莉酸信号通路可以调控这些萜类吲哚生物碱的生物合成,茉莉酸-异亮氨酸合成酶为茉莉酸信号通路中的关键元件。为了研究其功能,该文以长春花叶片为材料,分析了CrJAR1基因所编码的氨基酸序列,并进行原核表达。结果表明:CrJAR1基因编码了585个氨基酸,该蛋白不存在跨膜区域,定位于细胞质中,且该蛋白不含有信号肽;进一步系统进化树分析表明,长春花CrJAR1与笋瓜和番木瓜的JAR1同源性最高;对二级、三级结构进行预测,发现CrJAR1蛋白主要由α-螺旋构成;同时,成功构建了pET-30b-CrJAR1重组表达质粒,并经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21中异源表达,经16、37℃分别诱导至16 h后,均显示出最高的表达量。综上结果,对长春花中CrJAR1蛋白进行生物信息学分析,并成功在大肠杆菌中进行异源表达,这对体外该蛋白功能的研究具有深远影响,为调节茉莉酸信号通路甚至调控长春花中次级代谢产物的生物合成提供了指导。 展开更多
关键词 长春花 茉莉酸-异亮氨酸合成酶 序列分析 三级结构预测 原核表达
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重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸 被引量：3
2
作者 徐礼生 高贵珍 +4 位作者 曹稳根 赵亮 张兴桃 焦庆才 鲍妮娜 《精细化工》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第1期47-51,68,共6页
利用重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸,采用单因素以及响应面分析方法考察了p H、反应温度、底物浓度和底物摩尔比对L-5-羟基色氨酸合成的影响。最佳转化条件为:反应温度为32℃,p H=8.6,5-羟基吲哚与工业角蛋白水解氨基酸液中L-... 利用重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸,采用单因素以及响应面分析方法考察了p H、反应温度、底物浓度和底物摩尔比对L-5-羟基色氨酸合成的影响。最佳转化条件为:反应温度为32℃,p H=8.6,5-羟基吲哚与工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.1∶1,底物工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸最适合浓度为180 mmol/L,反应平衡时间为18 h,工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸摩尔转化率达到86.5%。 展开更多
关键词 色氨酸合成酶 5-羟基色氨酸 L-丝氨酸 5-羟基吲哚 生物工程
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水/有机溶剂双相体系中色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸 被引量：2
3
作者 徐礼生 高贵珍 +5 位作者 曹稳根 赵亮 张兴桃 焦庆才 陈军 宋曼 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期547-552,共6页
本文作者研究了水/有机溶剂双相体系中利用色氨酸合成酶催化L-丝氨酸和2-甲基吲哚合成2-甲基-L-色氨酸,考察了有机溶剂、有机溶剂体积分数、p H、反应温度、表面活性剂、金属离子和底物浓度对色氨酸合成酶催化合成2-甲基-L-色氨酸的影... 本文作者研究了水/有机溶剂双相体系中利用色氨酸合成酶催化L-丝氨酸和2-甲基吲哚合成2-甲基-L-色氨酸,考察了有机溶剂、有机溶剂体积分数、p H、反应温度、表面活性剂、金属离子和底物浓度对色氨酸合成酶催化合成2-甲基-L-色氨酸的影响。有机溶剂包括二甲苯、甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯和辛醇,表面活性剂包括吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚(OP)、CTAB和Trion X-100,金属离子包括Mg2+、Ca2+、Cu2+、Co2+和Zn2+。结果表明,酶法最佳转化条件为:有机相溶剂为甲苯,甲苯体积分数为2%,反应温度为40℃,水相p H为8,底物L-丝氨酸浓度为150mmol/L,表面活性剂Trion X-100质量分数为2%,金属离子Ca2+浓度为0.1 mmol/L,色氨酸合成酶酶促反应5 h,2-甲基-L-色氨酸的质量浓度为21.17 g/L。重组大肠杆菌DM206可作为2-甲基-L-色氨酸生产菌,具有较好的2-甲基-L-色氨酸生产潜力。 展开更多
关键词 色氨酸合成酶 2-甲基-L-色氨酸 L-丝氨酸 2-甲基吲哚
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白三烯诱导人呼吸道上皮细胞氧化应激及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用研究 被引量：5
4
作者 牛磊 汪隽瑛 蒋瑾瑾 《临床儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期66-69,共4页
目的研究白三烯诱导人呼吸道上皮细胞内谷胱甘肽氧化还原状态变化及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用。方法将人气道上皮细胞分为对照组和暴露组。暴露组的人气道上皮细胞暴露于白三烯2、4、6、12 h。检测对照组及暴露组在2、4、6... 目的研究白三烯诱导人呼吸道上皮细胞内谷胱甘肽氧化还原状态变化及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用。方法将人气道上皮细胞分为对照组和暴露组。暴露组的人气道上皮细胞暴露于白三烯2、4、6、12 h。检测对照组及暴露组在2、4、6、12 h相应指标。测定气道上皮细胞内谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量;双酶法测定γ-GCS活性;RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达;Western-blot检测气道上皮细胞核和细胞质中γ-GCS蛋白表达;细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白表达。结果暴露组细胞2、4、6、12 h的GSH含量、GSH/GSSG比值先减少后逐渐增加,4 h最低,6 h达最高,12 h恢复正常;而GSSG含量则呈现相反趋势,与对照组之间差异有统计学意义。暴露组细胞2、4、6 h,γ-GCS活性增强,与对照组比较差异有统计学意义。细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白阳性信号主要分布在胞质中,暴露组呈强阳性表达,而对照组表达较弱,暴露组2、4、6 h时与对照组比较,差异有统计学意义。Western-blot检测结果相似。RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达,暴露组2、4、6 h时较对照组增加,差异有统计学意义。结论白三烯诱导氧化应激影响呼吸道上皮细胞谷胱甘肽氧化还原状态,而呼吸道上皮细胞通过提高γ-GCS活性对抗氧化应激,保持氧化还原稳定的状态。 展开更多
关键词 支气管哮喘 白三烯 氧化应激 Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 人气道上皮细胞
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人γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因E-box元件功能初步分析 被引量：2
5
作者 罗伶俐 邹国民 +1 位作者 李冰 冉丕鑫 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1428-1430,共3页
目的:探讨人支气管上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列E-box元件的功能。方法:利用PCR法克隆人GCLC基因上游调控序列,PCR重叠延伸法对2个E-box元件分别和同时进行定点突变。扩增获得的突变体片段克隆入PM... 目的:探讨人支气管上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列E-box元件的功能。方法:利用PCR法克隆人GCLC基因上游调控序列,PCR重叠延伸法对2个E-box元件分别和同时进行定点突变。扩增获得的突变体片段克隆入PMD18-T载体,DNA测序鉴定后,亚克隆入野生型GCLC-Luc荧光素酶报道载体。将3个突变体质粒和野生型质粒转染人肺泡上皮细胞A549和人支气管上皮细胞16HBE,检测转染后细胞荧光素酶活性值。结果:测序结果证实,成功将E-box1CACGGG突变为AGCGGG;E-box2CACGTG突变为CACGGA。GCLC-Luc、GCLC-mEbox1-Luc(突变E-box1)、GCLC-mEbox2-Luc(突变E-box2)、GCLC-mEbox12-Luc(突变E-box1和E-box2)转染A549细胞后荧光素酶活性值分别为(5197852±132206)U、(5455692±127431)U、(5315722±244197)U、(5174303±183179)U,转染16HBE细胞后荧光素酶活性值分别为(141157±18907)U、(126454±23724)U、(137315±22179)U、(132441±28970)U。经过统计学分析,各组荧光酶活性没有显著差别,均P>0.05。结论:E-box元件不参与基础状态下A549细胞和16HBE细胞GCLC基因转录调控。 展开更多
关键词 16HBE细胞 A549细胞 基因 GCLC Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶
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谷氨酸棒杆菌3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶基因的克隆与过量表达 被引量：1
6
作者 王玉华 于含松 +2 位作者 刘加欢 刘回民 胡耀辉 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2009年第5期162-165,共4页
本实验对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)AS10111及其亚硝基胍诱变获得的丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型、抗3-甲基色氨酸突变菌株JLC1中3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶(DS)基因进行克隆和序列分析,将突变体来源DS基因构... 本实验对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)AS10111及其亚硝基胍诱变获得的丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型、抗3-甲基色氨酸突变菌株JLC1中3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶(DS)基因进行克隆和序列分析,将突变体来源DS基因构建pZ8-1-DSM重组质粒,在谷氨酸棒杆菌突变株JLC1中进行表达,重组菌株JLC1(pZ8-1-DSM)DS酶活力分别是宿主菌和野生型菌株DS酶活力的5.9和7.3倍,色氨酸产量达到14.90g/L,较宿主菌提高了65%。这表明通过在谷氨酸棒杆菌中过量表达3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶基因可以有效提高该酶活力和色氨酸的产量。 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 L-色氨酸3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶 过量表达
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γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和多药耐药相关蛋白基因在膀胱癌中的表达及相关性分析 被引量：1
7
作者 曾晓勇 杨为民 +3 位作者 叶章群 刘继红 张旭 周惜才 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期649-652,共4页
为探讨 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ- GCS)及多药耐药相关蛋白 (MRPs)与膀胱癌化疗耐药的关系 ,应用逆转录多聚酶链式反应 (Rt- PCR)技术检测了 32例膀胱癌及其癌周正常膀胱粘膜上 γ- GCS亚单位 γ- GCSh、γ- GCSl以及 MRPs家族成员 ... 为探讨 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ- GCS)及多药耐药相关蛋白 (MRPs)与膀胱癌化疗耐药的关系 ,应用逆转录多聚酶链式反应 (Rt- PCR)技术检测了 32例膀胱癌及其癌周正常膀胱粘膜上 γ- GCS亚单位 γ- GCSh、γ- GCSl以及 MRPs家族成员 MRP1 和 MRP2 的 m RNA的表达 ,并以 β- actin m RNA为内对照半定量进行相关分析。结果显示 :γ-GCSh、γ- GCSl、MRP1 和 MRP2 m RNA在癌组织的平均相对表达水平均高于其在正常粘膜的表达 ;γ- GCSh和 MRP1 在化疗复发病例的癌组织的平均表达水平明显高于在未接受过任何化疗的初发病例 ,同时显示两者在癌组织的表达具有较强的相关性 (r=0 .786 ,P<0 .0 1)。提示 :正常细胞的恶性化可上调 γ- GCS和 MRPs的表达 ;膀胱癌临床化疗耐药的形成与 γ- GCSh和 MRP1 的过表达密切相关 。 展开更多
关键词 相关性 膀胱肿瘤 Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 多药耐药相关蛋白 基因表达 逆转录多聚酶链式反应
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腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位表达的机制研究 被引量：1
8
作者 方怡 李冰 +2 位作者 陈娟 刘启才 冉丕鑫 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期2382-2385,共4页
目的:研究腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)表达的机制。方法:构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞,将GCLC基因5’-上游调控序列不同长度的缺失体-萤火虫荧光素酶报道系统转染后分... 目的:研究腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)表达的机制。方法:构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞,将GCLC基因5’-上游调控序列不同长度的缺失体-萤火虫荧光素酶报道系统转染后分析转录活性的变化;检测AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因调控序列的结合活性。结果:GCLC基因5’-上游调控序列报道系统检测结果显示大部分(9/11)缺失体的转录活性抑制,AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因的结合活性增强,而对应的功能元件的转录活性降低。结论:腺病毒E1A蛋白通过抑制GCLC基因5’-上游调控序列的转录活性,扩大大鼠肺泡上皮细胞氧化应激时的氧化/抗氧化失衡,其机制可能涉及E1A对辅助转录因子的抑制。 展开更多
关键词 腺病毒E1A蛋白质类 Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 肺疾病 慢性阻塞性
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山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因LsCAS的原核表达及蛋白聚合状态分析 被引量：1
9
作者 贾海燕 李辰浩 +3 位作者 宋瑶瑶 刘凤娟 焦成瑾 徐全乐 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期1605-1610,共6页
该研究从山黧豆种子萌发6 d后的幼苗根中扩增到β-腈基丙氨酸合成酶基因(LsCAS)的CDS序列,并构建pGEX2T-LsCAS表达载体;经诱导表达后,通过GST亲和层析进行LsCAS蛋白纯化,并利用GST标签抗体和大豆半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,CS)... 该研究从山黧豆种子萌发6 d后的幼苗根中扩增到β-腈基丙氨酸合成酶基因(LsCAS)的CDS序列,并构建pGEX2T-LsCAS表达载体;经诱导表达后,通过GST亲和层析进行LsCAS蛋白纯化,并利用GST标签抗体和大豆半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,CS)抗体对纯化蛋白进行Western-blot验证;纯化后的LsCAS蛋白经凝血酶切除GST标签抗体后,利用凝胶过滤预装柱Superdex 200 Increase 10/300 GL分析判断分子量。结果显示:(1)山黧豆LsCAS基因的CDS序列为1035 bp,编码344个氨基酸;其编码的蛋白质具有典型的CBS-like蛋白功能结构域胱硫醚β-合酶(CBS)和半胱氨酸合成酶(CS)。(2)成功构建LsCAS基因的原核表达载体pGEX2T-LsCAS并进行蛋白纯化;SDS-PAGE检测表明,所获融合蛋白条带单一,大小在64 kD左右;Western-blot分析发现,诱导后的菌体蛋白和纯化后的重组蛋白中均能检测到特征条带,说明所获融合蛋白为山黧豆LsCAS蛋白。(3)纯化的山黧豆LsCAS蛋白在412 nm的特征吸收峰显示,LsCAS隶属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖的半胱氨酸合成酶家族;分子排阻试验证实山黧豆LsCAS为PLP依赖性蛋白酶,可能以四聚体方式发挥作用。研究结果为进一步探讨山黧豆LsCAS的调控及其功能奠定了基础。 展开更多
关键词 山黧豆 β-腈基丙氨酸合成酶 原核表达 蛋白纯化 磷酸吡哆醛
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核因子相关因子2调节大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达 被引量：3
10
作者 江刚 戴爱国 胡瑞成 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期150-156,共7页
红系衍生的核因子相关因子2(Nrf2)是调节抗氧化基因表达的关键转录因子.γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是肺内主要的抗氧化基因,但Nrf2如何调节γ-GCS表达目前仍不清楚.该文采用香烟烟雾提取物(CSE)诱导大鼠气道上皮细胞为研究对象,探... 红系衍生的核因子相关因子2(Nrf2)是调节抗氧化基因表达的关键转录因子.γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是肺内主要的抗氧化基因,但Nrf2如何调节γ-GCS表达目前仍不清楚.该文采用香烟烟雾提取物(CSE)诱导大鼠气道上皮细胞为研究对象,探索Nrf2调节γ-GCS基因表达机制.细胞免疫荧光显示,Nrf2蛋白质在CSE处理1、3和6h组,主要在胞核中表达.细胞免疫化学与Western印迹显示,γ-GCS蛋白质在CSE1、3、6h组表达明显增强,其中Western印迹结果高于对照组(P<0.05);Nrf2胞核蛋白质表达增强.p-aPKCι/ζ蛋白质在CSE1、3h组表达增强,与对照组相比差异显著(P<0.05).RT-PCR结果表明,γ-GCSmRNA在CSE1、3、6h组表达明显高于对照组(P<0.05).γ-GCS活性在CSE1、3、6h组增高并高于对照组(P<0.05).GSH含量在CSE3、6h组明显高于对照组(P<0.05).预先加入aPKCι/ζ抑制剂RO813220,Nrf2胞浆蛋白质表达增强,GSH含量、p-aPKCι/ζ蛋白质、γ-GCS蛋白质与其mRNA和活性均明显低于CSE3h组(P<0.05).相关性分析显示Nrf2与γ-GCS、γ-GCS活性、p-aPKCι/ζ呈正相关,p-aPKCι/ζ与Nrf2、γ-GCS、γ-GCS活性呈正相关(P<0.05).以上结果表明,CSE可能通过aPKCι/ζ-Nrf2信号通路调节γ-GCS的表达水平和活性. 展开更多
关键词 香烟烟雾提取物 不典型蛋白激酶Cι/ζ 红系衍生的核因子相关因子2 Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶
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重组大肠杆菌全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸 被引量：2
11
作者 Umutumwa Eric Principe 乔郅钠 +5 位作者 龙梦飞 邵明龙 徐美娟 杨套伟 张显 饶志明 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期26-35,共10页
4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E.co... 4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E.coli BL21(DE3)中的异源表达。其次,通过同源建模和蛋白质结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成丙氨酸Ala的原则,对I156位点进行了定点突变,以增大底物结合口袋,扩宽底物通遒进而提高4-HIL的产量。最后,对野生酶及突变酶的酶学性质、突变酶的羟基化反应体系进行研究,在最优催化条件下,分批补料转化底物进行4-HIL的生产。酶学性质结果显示,野生酶及突变酶I156A的最适温度均为25℃,最适pH均为7.0;突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍,L-ILe转化率提高了28%。羟基化反应体系的最优转化条件为:20 mmol/L L-ILe,20 mmol/Lα-酮戊二酸,8 mmol/L Fe^(2+),30 mmol/L抗坏血酸和HEPES(50 mmol/L,pH 7.0)缓冲液。在最优转化条件下,重组菌E.coli BL21/pET28a-ido^(I156A)进行分批补料转化底物,时间间隔为4 h,32 h后得到77.3 mmol/L 4-HIL,底物最高转化率98.35%e。 展开更多
关键词 L-异亮氨酸 L-异亮氨酸羟化酶 4-羟基异亮氨酸 定点突变 酶学性质 催化体系
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组成型过表达ido基因对4-羟基异亮氨酸合成的影响及其发酵培养基的响应面优化 被引量：2
12
作者 何继龙 李英滋 +4 位作者 韩世宝 满德恩 郭脉海 战俊杰 张成林 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第14期91-98,共8页
为考察组成型过表达异亮氨酸羟化酶(isoleucine dioxygenase,IDO)基因ido对4-羟基异亮氨酸合成的影响,构建ido组成型表达质粒pXM01-ido及菌株HIL017,其ido转录量及IDO活性较诱导型过表达菌株HIL016显著提升,4-羟基异亮氨酸产量较HIL016... 为考察组成型过表达异亮氨酸羟化酶(isoleucine dioxygenase,IDO)基因ido对4-羟基异亮氨酸合成的影响,构建ido组成型表达质粒pXM01-ido及菌株HIL017,其ido转录量及IDO活性较诱导型过表达菌株HIL016显著提升,4-羟基异亮氨酸产量较HIL016提高19.4%。为进一步提高4-羟基异亮氨酸产量,通过Plackett-Burman试验确定HIL017发酵培养基中玉米浆、谷氨酸和FeSO4·7H2O用量为主要影响因素,利用最陡爬坡试验和响应面法确定其最优用量为玉米浆34.1 mL/L、谷氨酸2.98 g/L、FeSO4·7H2O 0.016 7 g/L,此时4-羟基异亮氨酸理论产量为5.57 g/L。验证实验结果表明,最佳条件下4-羟基异亮氨酸产量为5.53 g/L,较优化前提高19.7%。 展开更多
关键词 4-羟基异亮氨酸 异亮氨酸羟化酶 谷氨酸棒杆菌 组成型过表达 响应面法
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两阶段溶氧控制及FeSO4添加对谷氨酸棒杆菌合成4-羟基异亮氨酸的影响 被引量：2
13
作者 孟静 芦楠 +4 位作者 朱福周 董解荣 王子申 陈宁 张成林 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1-6,共6页
优化4-羟基异亮氨酸发酵过程中溶氧水平及FeSO4添加量,以提高其发酵水平。结合菌株Corynebacterium glutamicum HIL18及4-羟基异亮氨酸合成特点,首先考察不同溶氧水平及两阶段溶氧控制对4-羟基异亮氨酸发酵的影响。然后考察FeSO4添加对... 优化4-羟基异亮氨酸发酵过程中溶氧水平及FeSO4添加量,以提高其发酵水平。结合菌株Corynebacterium glutamicum HIL18及4-羟基异亮氨酸合成特点,首先考察不同溶氧水平及两阶段溶氧控制对4-羟基异亮氨酸发酵的影响。然后考察FeSO4添加对其发酵的作用。20%溶氧有利于4-羟基异亮氨酸的合成。利用两阶段溶氧控制工艺(0~20h、20%溶氧;20~64h、30%溶氧)经64h发酵,4-羟基异亮氨酸产量达到38.7g/L,较未使用该工艺提高11.2%。采用两阶段FeSO4添加策略(初始浓度为65μmol/L、20h添加30μmol/L),4-羟基异亮氨酸的产量达到43.4g/L。采用优化后的工艺使得4-羟基异亮氨酸产量较优化前提高27.3%。获得了4-羟基异亮氨酸发酵过程中两阶段溶氧控制及FeSO4添加工艺。该结果为4-羟基异亮氨酸的高效发酵合成提供参考。 展开更多
关键词 4-羟基异亮氨酸 谷氨酸棒杆菌 溶氧 异亮氨酸羟化酶
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动态调控谷氨酸棒状杆菌合成4-羟基异亮氨酸 被引量：2
14
作者 来文梅 谭书煜 史锋 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第17期42-48,共7页
4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)在治疗Ⅱ型糖尿病方面极具潜力。异亮氨酸双加氧酶(isoleucine dioxygenase,IDO)能够将L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)转变成4-HIL。为提高重组谷氨酸棒杆菌的4-HIL产量同时降低副产物L-赖氨酸... 4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)在治疗Ⅱ型糖尿病方面极具潜力。异亮氨酸双加氧酶(isoleucine dioxygenase,IDO)能够将L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)转变成4-HIL。为提高重组谷氨酸棒杆菌的4-HIL产量同时降低副产物L-赖氨酸(L-lysine,Lys)的合成,首先将Lys-OFF核糖体开关整合到Lys合成途径的关键基因dapA序列上游,得到D-RS菌株。该菌株能够根据胞内外Lys的浓度,动态弱化Lys合成,使Lys的含量降低了46.7%。其次,在该菌株中再利用Ile激活型传感器Lrp-P_(brnFE)N去控制密码子优化后的ido基因的表达,使4-HIL的产量提高至116.3 mmol/L。最后,为了进一步提高4-HIL产量,利用强启动子P_(brnFE 7)动态控制odhI和vgb的表达,增强α-酮戊二酸和O_(2)的供应。最终得到了1株摇瓶发酵4-HIL产量高达166.0 mmol/L,Lys含量降至6.5 mmol/L的重组菌株D-RS-_(0)I_(7)O_(7)V。研究所采用的动态调控策略为4-HIL的高效合成提供了一种新思路。 展开更多
关键词 4-羟基异亮氨酸 谷氨酸棒杆菌 赖氨酸 Lrp-P_(brnFEN) Lys-OFF核糖体开关
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Cd胁迫下芦苇体内氯化钠提取态镉及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性研究 被引量：2
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作者 丁振华 苏芳莉 孙权 《生态与农村环境学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1139-1144,共6页
芦苇(Phragmites australis)对污染水体重金属Cd具有极强的富集积累能力,能有效减少生长环境中的Cd含量。Cd被芦苇植株吸收后会转化为不同形态存在,其中与蛋白质结合的氯化钠提取态镉(SCd)是芦苇体内的主要形态。为研究不同Cd浓度环境... 芦苇(Phragmites australis)对污染水体重金属Cd具有极强的富集积累能力,能有效减少生长环境中的Cd含量。Cd被芦苇植株吸收后会转化为不同形态存在,其中与蛋白质结合的氯化钠提取态镉(SCd)是芦苇体内的主要形态。为研究不同Cd浓度环境中芦苇体内SCd含量及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)活性变化特征,采用5种浓度氯化镉溶液(0.5、1.0、2.0、3.0和5.0 mmol·L-1)对芦苇进行灌溉,然后测定不同生长时期的芦苇在镉胁迫下植株内SCd的积累量和γ-GCS活性的变化。结果显示:(1) Cd浓度增加时,芦苇植株根、茎、叶的SCd积累量呈现先增加后减少的趋势;(2)芦苇植株各部位不同时期镉积累量有所不同,成熟期时积累量达到最大。根部SCd的积累量为3 984.16 mg·kg-1,是茎部的7.33倍,叶部的4.83倍;(3)在镉溶液浓度小于3.0 mmol·L-1时,芦苇根茎叶中γ-GCS活性随灌溉浓度增加而增加;镉溶液浓度大于3.0 mmol·L-1时γ-GCS活性被抑制。 展开更多
关键词 芦苇 镉 分布 形态 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)
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基于7-异戊二烯色氨酸合成酶催化合成C-7异戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物碱 被引量：1
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作者 刘瑞 张弘弛 +1 位作者 李慧 周凤 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期413-421,共9页
以L-色氨酸系的二酮哌嗪为底物,7-异戊二烯色氨酸合成酶催化合成异戊烯化的吲哚二酮哌嗪;采用分子对接方法分析底物与酶的亲和关系;采用MTT法测定合成的异戊烯化吲哚二酮哌嗪对3种肿瘤细胞的抑制活性;单因素法优化活性最高的异戊烯化吲... 以L-色氨酸系的二酮哌嗪为底物,7-异戊二烯色氨酸合成酶催化合成异戊烯化的吲哚二酮哌嗪;采用分子对接方法分析底物与酶的亲和关系;采用MTT法测定合成的异戊烯化吲哚二酮哌嗪对3种肿瘤细胞的抑制活性;单因素法优化活性最高的异戊烯化吲哚二酮哌嗪的酶催化条件。结果表明,催化合成7个C-7异戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物碱,分子对接结果验证酶催化效率;体外抗肿瘤活性筛选出cyclo-L-7-dimethylallyl-Trp-L-Pro的活性最高,其最佳酶催化条件为:反应时间18 h,温度为35℃,pH为8.0(Tris-HCl缓冲液),添加5 mmol·L^(-1)的MgCl_(2)。 展开更多
关键词 吲哚二酮哌嗪 7-异戊二烯色氨酸合成酶 分子对接 抗肿瘤活性
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Fe(Ⅱ)/2-酮戊二酸依赖型双加氧酶重组大肠杆菌全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸 被引量：2
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作者 张文丽 聂尧 +1 位作者 景晓冉 徐岩 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1172-1177,共6页
以L-异亮氨酸(L-ILe)为底物,以异源表达Fe(Ⅱ)/2-酮戊二酸依赖型双加氧酶的重组大肠杆菌BL21/pET28a-ido全细胞作为催化剂,催化合成4-羟基异亮氨酸(4-HIL).基于重组异亮氨酸双加氧酶(IDO)催化异亮氨酸羟基化的性质和条件,在摇瓶水平上... 以L-异亮氨酸(L-ILe)为底物,以异源表达Fe(Ⅱ)/2-酮戊二酸依赖型双加氧酶的重组大肠杆菌BL21/pET28a-ido全细胞作为催化剂,催化合成4-羟基异亮氨酸(4-HIL).基于重组异亮氨酸双加氧酶(IDO)催化异亮氨酸羟基化的性质和条件,在摇瓶水平上对辅因子亚铁离子、α-酮戊二酸(α-KG)及底物浓度进行了单因素优化.获得的最佳反应条件为2g/L FeSO4·7H2O,底物与α-KG摩尔比为1∶1,该条件下反应8h可生成190mmol/L4-HIL.结合摇瓶水平的最优条件,在反应器水平上继续对搅拌速度、菌体浓度等进行优化,实现了对高底物浓度下催化反应的连续调控.在50g/L湿菌体及400r/min转速下可一次转化合成400mmol/L 4-HIL,建立了全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸的工艺流程. 展开更多
关键词 L-异亮氨酸 全细胞催化 4-羟基异亮氨酸 双加氧酶 过程调控
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过表达mqo对重组谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸合成的影响 被引量：2
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作者 卢正珂 史锋 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期30-35,共6页
4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)具有促进胰岛素分泌、降低胰岛素抵抗活性功能,在治疗糖尿病方面有潜在的应用价值。在产L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)的谷氨酸棒杆菌SN01菌株中过表达ido基因后可以合成4-HIL。为了促进草酰... 4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)具有促进胰岛素分泌、降低胰岛素抵抗活性功能,在治疗糖尿病方面有潜在的应用价值。在产L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)的谷氨酸棒杆菌SN01菌株中过表达ido基因后可以合成4-HIL。为了促进草酰乙酸的供应和4-HIL合成,在这株重组菌中又过表达了mqo。发酵144 h后,ido-mqo过表达菌的4-HIL产量是(60.86±2.24)mmol/L,低于ido过表达菌(72.06±5.60)mmol/L;但是,Ile的积累量高达(101.39±2.20)mmol/L,显著高于ido过表达菌(5.00±1.43)mmol/L。对ido-mqo过表达菌代谢途径中部分关键基因的RT-PCR分析表明,进入TCA循环的碳流由异柠檬酸裂解酶分流,进入乙醛酸循环,导致4-HIL合成所需的另一底物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)供应不足和Ile过剩。于是添加α-KG,当添加量为40 mmol/L时,4-HIL的产量提高到(77.7±10.91)mmol/L,Ile到4-HIL的转化率提高到75%。因此,过表达mqo能够促进Ile合成,添加α-KG后能够促进Ile向4-HIL转化,从而提高4-HIL产量。 展开更多
关键词 4-羟基异亮氨酸 谷氨酸棒杆菌SN01 L-异亮氨酸 mqo Α-酮戊二酸
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生物法合成4-羟基异亮氨酸的代谢工程研究进展 被引量：2
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作者 李洋 张稳杰 +2 位作者 韩雨辰 翟懿雪 张成林 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期281-288,共8页
4-羟基异亮氨酸是一种非蛋白质氨基酸,因具有血糖浓度依赖的诱导胰岛素分泌等生物学活性,而被视为治疗糖尿病的潜在药物。近年来,生物法合成4-羟基异亮氨酸取得了一定的进展。文章概述了4-羟基异亮氨酸的功能、合成方法及其生物合成途... 4-羟基异亮氨酸是一种非蛋白质氨基酸,因具有血糖浓度依赖的诱导胰岛素分泌等生物学活性,而被视为治疗糖尿病的潜在药物。近年来,生物法合成4-羟基异亮氨酸取得了一定的进展。文章概述了4-羟基异亮氨酸的功能、合成方法及其生物合成途径。在此基础上,从构建4-异亮氨酸合成途径、强化L-异亮氨酸合成、重构中心代谢途径等层面着重阐述了生物法合成4-羟基异亮氨酸的代谢工程策略,旨在为以4-羟基异亮氨酸为代表的高附加值氨基酸衍生物合成菌株代谢工程研究提供参考。 展开更多
关键词 4-羟基异亮氨酸 生物合成 代谢工程 谷氨酸棒杆菌 大肠杆菌
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外施硫酸根和蛋氨酸对大豆胱硫醚-γ-合成酶基因GmCGS表达的影响
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作者 刘修杰 陈莉 +4 位作者 郭晨 蔡宇鹏 孙石 韩天富 侯文胜 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期10-17,共8页
大豆蛋白中蛋氨酸等含硫氨基酸含量偏低,探究蛋氨酸合成过程关键酶胱硫醚-γ-合成酶编码基因Gm CGS表达规律,对于改善这一缺陷具有十分重要的意义。本研究以过表达At D-CGS转基因大豆株系及其受体品种Jack为材料,从上游物质硫酸根和下... 大豆蛋白中蛋氨酸等含硫氨基酸含量偏低,探究蛋氨酸合成过程关键酶胱硫醚-γ-合成酶编码基因Gm CGS表达规律,对于改善这一缺陷具有十分重要的意义。本研究以过表达At D-CGS转基因大豆株系及其受体品种Jack为材料,从上游物质硫酸根和下游产物蛋氨酸两方面入手,探究硫酸根和蛋氨酸对Gm CGS在转录水平上的影响。结果显示,较高浓度的硫酸根会促进野生型材料中该基因的表达,抑制转基因材料中该基因的表达;蛋氨酸处理之后,对Gm CGS的表达没有显著影响;转基因株系中,Gm CGS表达量显著低于野生型材料中该基因表达量。以上结果说明通过外界硫肥等栽培措施的改变只可以小幅度改变Gm CGS表达量,难以有效改善大豆蛋氨酸含量偏低的缺陷,这为提高大豆蛋氨酸含量提供了一定的理论参考。 展开更多
关键词 大豆 胱硫醚-γ-合成酶 硫酸根 蛋氨酸
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