为研究海洋中常见致病性弧菌的快速分离富集方法——免疫磁珠法,本文以副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌为研究对象,制备纳米免疫磁珠,并通过一系列优化条件,用3M试纸计算捕获率来确定免疫磁珠最佳捕获条件。最后分别对4种...为研究海洋中常见致病性弧菌的快速分离富集方法——免疫磁珠法,本文以副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌为研究对象,制备纳米免疫磁珠,并通过一系列优化条件,用3M试纸计算捕获率来确定免疫磁珠最佳捕获条件。最后分别对4种致病性弧菌的不同菌液稀释浓度、对1株目标菌和8株非目标菌、4种混合菌进行捕获,从而评价免疫磁珠的灵敏度、特异性以及抗干扰能力。结果表明,4种磁珠偶联最佳抗体量为300、600、150、150μg。最佳捕获条件:副溶血弧菌免疫磁珠用量3mg,免疫反应45min,磁分离3min,p H 7.4缓冲液体系。哈维氏弧菌免疫磁珠用量3mg,免疫反应45min,磁分离1min,p H 6.0缓冲液体系。创伤弧菌免疫磁珠用量12mg,免疫反应60min,磁分离5min,p H 8.0缓冲液体系。灿烂弧菌免疫磁珠用量6mg,免疫反应30min,磁分离3min,p H 7.4缓冲液体系。在纯培养情况下,4种免疫磁珠灵敏度均达到10 CFU/m L数量级;分别对9株菌进行捕获,对目标菌的捕获率均达到87%以上,对非目标菌的捕获率均低于32%;对4种混合菌进行捕获时,免疫磁珠捕获率不受其它杂菌干扰。本研究证明了该免疫磁珠有较好的灵敏度、特异性和抗干扰能力,且与其它增菌方法相比,大大缩短了时间,具有较好的应用前景。展开更多
目的:对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法:用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用...目的:对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法:用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用棋盘方法确定免疫血清最佳工作浓度,并对致病性与非致病性副溶血弧菌分别进行特异性测定。结果:最佳免疫血清最佳工作浓度为1:3200;检测致病性副溶血弧菌为阳性,非致病性副溶血弧菌属呈阴性。结论:Western斑点印迹法技术可以特异性检测致病性副溶血弧菌,灵敏度高、操作简单,可用肉眼判定结果。展开更多
对克隆的拟态弧菌Vibrio mi micus的全长toxR基因及进行相关的序列分析。根据已发表的其他几种弧菌toxR基因两翼核苷酸序列,设计和合成上下游简并引物,以拟态弧菌1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的1.3kb扩增片断进行...对克隆的拟态弧菌Vibrio mi micus的全长toxR基因及进行相关的序列分析。根据已发表的其他几种弧菌toxR基因两翼核苷酸序列,设计和合成上下游简并引物,以拟态弧菌1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的1.3kb扩增片断进行克隆、鉴定和测序,并将该序列提交至GenBank(登录号为EF693743)。首次获得拟态弧菌840bptoxR基因全长核苷酸序列。与其它弧菌的相应序列分析比对显示,该序列与霍乱弧菌Vibrio cholerae的toxR基因有87%—88%的相似性,与鳗弧菌Vibrio anguillarum的toxR基因有75%的相似性,与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的toxR基因有45%的相似性。该基因编码1个含有279个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为31.13kDa,等电点为5.35,并含有一个典型的转录激活区和一个跨膜区。系统发育树分析表明,几种常见致病性弧菌的toxR基因序列存在较大分歧,拟态弧菌能较容易与进化相近的霍乱弧菌鉴别区分开来。toxR基因全长核苷酸序列的获得将为拟态弧菌的菌种鉴定增添新的分子靶标,有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受toxR基因调控的致病基因。展开更多
文摘为研究海洋中常见致病性弧菌的快速分离富集方法——免疫磁珠法,本文以副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌为研究对象,制备纳米免疫磁珠,并通过一系列优化条件,用3M试纸计算捕获率来确定免疫磁珠最佳捕获条件。最后分别对4种致病性弧菌的不同菌液稀释浓度、对1株目标菌和8株非目标菌、4种混合菌进行捕获,从而评价免疫磁珠的灵敏度、特异性以及抗干扰能力。结果表明,4种磁珠偶联最佳抗体量为300、600、150、150μg。最佳捕获条件:副溶血弧菌免疫磁珠用量3mg,免疫反应45min,磁分离3min,p H 7.4缓冲液体系。哈维氏弧菌免疫磁珠用量3mg,免疫反应45min,磁分离1min,p H 6.0缓冲液体系。创伤弧菌免疫磁珠用量12mg,免疫反应60min,磁分离5min,p H 8.0缓冲液体系。灿烂弧菌免疫磁珠用量6mg,免疫反应30min,磁分离3min,p H 7.4缓冲液体系。在纯培养情况下,4种免疫磁珠灵敏度均达到10 CFU/m L数量级;分别对9株菌进行捕获,对目标菌的捕获率均达到87%以上,对非目标菌的捕获率均低于32%;对4种混合菌进行捕获时,免疫磁珠捕获率不受其它杂菌干扰。本研究证明了该免疫磁珠有较好的灵敏度、特异性和抗干扰能力,且与其它增菌方法相比,大大缩短了时间,具有较好的应用前景。
文摘目的:对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法:用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用棋盘方法确定免疫血清最佳工作浓度,并对致病性与非致病性副溶血弧菌分别进行特异性测定。结果:最佳免疫血清最佳工作浓度为1:3200;检测致病性副溶血弧菌为阳性,非致病性副溶血弧菌属呈阴性。结论:Western斑点印迹法技术可以特异性检测致病性副溶血弧菌,灵敏度高、操作简单,可用肉眼判定结果。
基金The National Natural Science Foundation of China(31271870,31571917)Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation(11DZ2280300)Supported by Innovation Program of Shanghai Municipal Education Commission~~
