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缺氧促进5HRE和AFPp调控的NTR/CB1954自杀基因系统特异杀伤HepG2细胞 被引量：5
1
作者 王炜 孙学军 +1 位作者 郑见宝 禄韶英 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期125-129,共5页
目的:研究5拷贝缺氧反应元件(5HRE)和甲胎蛋白启动子(AFPp)联合调控的自杀基因系统硝基还原酶/CB1954(nitro-reductase/CB1954,NTR/CB1954)在缺氧环境下对人肝癌细胞株HepG2生长的抑制作用。方法:利用5HRE作为增强子和AFPp构成联合调控... 目的:研究5拷贝缺氧反应元件(5HRE)和甲胎蛋白启动子(AFPp)联合调控的自杀基因系统硝基还原酶/CB1954(nitro-reductase/CB1954,NTR/CB1954)在缺氧环境下对人肝癌细胞株HepG2生长的抑制作用。方法:利用5HRE作为增强子和AFPp构成联合调控元件,与自杀基因NTR构成真核表达载体。将载体转染AFP阳性的人肝癌细胞株HepG2及AFP阴性的人胃癌细胞株MKN45,利用G418筛选稳定转染的细胞。用RT-PCR和Westernblotting检测NTR的表达。将前体药物CB1954加入稳定表达NTR基因的细胞,用MTT法观察其毒性代谢产物4-羟胺还原产物对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果:成功筛选出稳定表达NTR的单克隆HepG2细胞和MKN45细胞。RT-PCR和Westernblotting证实单克隆HepG2细胞中NTR在mRNA和蛋白水平的表达,且缺氧环境中的表达量更高;单克隆MKN45细胞在常氧和缺氧环境中均无NTR表达。MTT法检测发现,缺氧环境下NTR基因能有效地活化前体药物CB1954,剂量依赖性地抑制NTR阳性的HepG2细胞的生长(P<0.05);但对MKN45细胞和野生型HepG2细胞无抑制作用。结论:5HRE和AFPp双重调控的NTR/CB1954自杀基因系统在体外缺氧环境下可促进对人肝癌细胞株HepG2靶向性杀伤作用。 展开更多
关键词 肝肿瘤 NTR/CB1954自杀基因系统 缺氧环境 AFP
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HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应 被引量：5
2
作者 李涛 张虹 +4 位作者 王骞 梁峰 李伟 李贵刚 卢运萍 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期533-537,共5页
目的　研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /更昔洛韦 (herpessimplexvirusthymidinekinase /gancyclovir,HSV tk/GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma ,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法　应用脂质体... 目的　研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 /更昔洛韦 (herpessimplexvirusthymidinekinase /gancyclovir,HSV tk/GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma ,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法　应用脂质体将pCMV/hytk IRES hrGFP质粒导入HXO Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO Rb44/tk。RT PCR鉴定hytk基因在HXO Rb44/tk细胞中的转录结果。比较HXO Rb44和HXO Rb44/tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO Rb44/tk和HXO Rb44混合细胞的杀伤作用 (“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果　HXO Rb44/tk细胞经RT PCR可检测出 5 30bp的hytk基因片段。HXO Rb44/tk和HXO Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO Rb44/tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应 ,而GCV作用的HXO Rb44/tk细胞上清对HXO Rb44细胞无杀伤作用。结论　HSV tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法 。 展开更多
关键词 HSV—tk/GCV 自杀基因系统 视网膜母细胞瘤 体外抗肿瘤效应 基因疗法 胸腺嘧啶核苷激酶
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HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究 被引量：3
3
作者 刘志 成诗银 鱼兵 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期582-585,共4页
目的　研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法　构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外... 目的　研究逆转录病毒介导的HSV tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。方法　构建携带HSV tk基因的逆转录病毒载体 ,并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep 2。以G4 18筛选的抗性克隆 (命名为Hep 2 /tk) ,用MTT比色法观察GCV在体外对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。结果　Hep 2 /tk细胞与未转染tk基因的Hep 2 /0、Hep 2细胞相比较 ,三者的生长速度无明显差别。Hep 2 /tk细胞对GCV高度敏感 ,即低浓度GCV(0～ 1mg/L)处理Hep 2 /tk细胞 7d,可将其大部分细胞杀死 ,增加GCV的浓度 (>1mg/L)不能显著增强其对Hep 2 /tk细胞的杀伤作用。 结论　人喉癌细胞Hep 2对HSV tk/GCV系统高度敏感 。 展开更多
关键词 HSV-TK/GCV自杀基因系统 喉癌 细胞杀伤作用 体外研究 基因治疗 更昔洛韦
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靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用 被引量：3
4
作者 黄宗海 杨文宇 +2 位作者 龚小卫 钱勇 车小燕 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第2期139-143,共5页
目的研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法... 目的研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联? 展开更多
关键词 靶向性双自杀基因系统 脐静脉内皮细胞 杀伤作用 血管内皮生长因子受体 基因治疗 KDR启动子 肿瘤
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自杀基因系统HSV1-TK/GCV对MEC-1细胞的体外杀伤及诱导凋亡作用 被引量：1
5
作者 司徒镇强 王江华 +3 位作者 刘斌 吴军正 李焰 贾永庆 《实用口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期458-461,共4页
目的 :探讨HSV TK/GCV系统对MEC 1细胞的体外作用。方法 :用脂质体介导将含有HSV 1 TK全长cDNA的真核表达质粒G1NATK转染人黏液表皮样癌细胞系MEC 1,经G418筛选 ,挑选阳性克隆 ,用PCR及RT PCR检测目的基因的整合及mRNA转录 ;分别用MTT... 目的 :探讨HSV TK/GCV系统对MEC 1细胞的体外作用。方法 :用脂质体介导将含有HSV 1 TK全长cDNA的真核表达质粒G1NATK转染人黏液表皮样癌细胞系MEC 1,经G418筛选 ,挑选阳性克隆 ,用PCR及RT PCR检测目的基因的整合及mRNA转录 ;分别用MTT及细胞记数法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应 ;用倒置显微镜、HE染色、活细胞荧光染色及TUNNEL染色观察GCV作用下MEC 1/TK的形态学变化。结果 :PCR及RT PCR分别从G418阳性克隆中成功扩增出 40 4bp的特异性基因片段 ,将此G418抗性克隆命名为MEC 1/TK ;IC50 MEC 1/TK为 0 .7μg/ml,而MEC 1为 10 0 0 μg/ml以上 ;当将TK阳性细胞和TK阴性细胞以不同比例混合 ,TK阳性细胞只占 10 %时 ,即有 90 %的细胞被杀死 ;形态学观察表明 ,经GCV作用 ,MEC 1/TK细胞变圆、脱壁、漂浮 ,部分细胞呈现核浓缩、核碎裂等特征 ,TUNNEL染色核阳性着色细胞明显增多。结论 :HSV TK/GCV系统在体外能明显杀伤MEC 1细胞 ,对GCV的敏感性比未转染的亲本细胞提高 10 0 0倍以上 ,并显示较强的旁观者效应 ;GCV可诱导部分MEC 展开更多
关键词 自杀基因系统 HSVl-TK/GCV系统 MEC-1细胞 唾液腺 肿瘤 自杀基因疗法
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CD/TK双自杀基因系统对Balb/c小鼠大肠癌的杀伤作用 被引量：1
6
作者 姚晓军 黄宗海 +1 位作者 李强 王朝阳 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2010年第7期1119-1122,共4页
目的:探讨腺病毒介导的以血管内皮生长因子(VEGF)启动的CD/TK双自杀基因对Balb/c小鼠大肠癌的杀伤作用。方法:将Ad-VEGF-CD/TK在293细胞中包装、扩增、纯化、鉴定,用CT26细胞通过皮下注射法建立荷大肠癌Balb/c小鼠模型,随机选取30只荷... 目的:探讨腺病毒介导的以血管内皮生长因子(VEGF)启动的CD/TK双自杀基因对Balb/c小鼠大肠癌的杀伤作用。方法:将Ad-VEGF-CD/TK在293细胞中包装、扩增、纯化、鉴定,用CT26细胞通过皮下注射法建立荷大肠癌Balb/c小鼠模型,随机选取30只荷瘤小鼠分为治疗组和对照组,每组15只小鼠。治疗组小鼠使用重组腺病毒和5-FC、GCV两种前药治疗,对照组注射生理盐水。记录两组小鼠不同时间点肿瘤生长体积,计算抑瘤率,3周后处死小鼠,取瘤,切片行TUNEL原位凋亡检测。结果:治疗组与对照组相比,治疗前肿瘤体积差异无统计学意义,第7、14、21天肿瘤体积差异有统计学意义(P<0.05),治疗组肿瘤体积较对照组明显变小,生长受抑制,第7、14、21天的抑瘤率分别为69.5%、75.1%、84.3%,TUNEL原位凋亡检测显示治疗组肿瘤细胞凋亡率较对照组明显增高,分别为(43.2±6.67)%和(2.4±0.91)%。结论:VEGF启动的CD/TK双自杀基因系统对Balb/c小鼠大肠癌具有明显的杀伤作用。 展开更多
关键词 肠肿瘤 自杀基因系统
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特异性启动子LEP503介导的自杀基因系统对晶状体上皮细胞增殖的抑制作用
7
作者 杨晋 卢奕 +1 位作者 刘天津 蒋永祥 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2011年第10期912-916,共5页
目的构建晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)特异性启动子LEP503(lens epithelium gene product503)调控的Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP载体,观察慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙环鸟苷系统(herps simplex virus thymidine ki... 目的构建晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)特异性启动子LEP503(lens epithelium gene product503)调控的Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP载体,观察慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙环鸟苷系统(herps simplex virus thymidine kinase/ganciclov-ir,HSV-tk/GCV)自杀基因系统对人晶状体上皮细胞(HLEC)增殖的靶向性抑制作用。方法用RT-PCR方法从HLEC基因组中克隆LEP503启动子序列,构建单纯LEP503启动子调控HSV-tk基因表达的慢病毒载体Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP,同时构建广谱启动子巨细胞病毒(cytomegalo virus,CMV)调控的HSV-tk载体Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP。将特异性表达载体Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP分别转入HLEC和Hela细胞,用荧光显微镜观察荧光强度,用RT-PCR方法评估相关蛋白的组织特异性表达。将Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP和Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP分别转入HLEC,通过荧光显微镜观察EGFP的表达,用流式细胞仪及RT-PCR比较CMV与LEP503启动子介导下游靶基因HSV-tk的表达差异。结果 Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP能在HLEC中特异性表达,但Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP的表达效率明显低于Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP。转染Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP的HLEC在20mg·L-1GCV作用48h后EGFP阳性细胞的形态发生明显变化;GCV作用24h后Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP转染HLEC较正常HLEC和Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP转染Hela细胞活性有明显抑制,且随时间的延长抑制效果逐渐增强。结论 LEP503启动子能介导HSV-tk基因在HLEC中特异表达,并介导HSV-tk/GCV自杀基因系统靶向性抑制HLEC增殖,但该启动子表达效率较低,所介导的HSV-tk/GCV系统对HLECs增殖的抑制效率低于CMV启动子。 展开更多
关键词 慢病毒 单纯疱疹病毒酶 胸苷激酶 晶状体上皮细胞 特异性启动子 LEP503 自杀基因系统
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恢复connexin26表达联合载酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因纳泡杀灭膀胱癌细胞 被引量：3
8
作者 陈思乡 姜庆 张俊勇 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期322-327,共6页
目的分析载双基因的阳离子纳泡联合超声靶向微泡破坏技术进行基因转染的有效性,探索恢复或上调膀胱癌细胞的缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)表达,能否增强自杀基因系统(yeast cytosine deaminase/5-fluorocytosine,YCD/5-FC)的旁观者效应... 目的分析载双基因的阳离子纳泡联合超声靶向微泡破坏技术进行基因转染的有效性,探索恢复或上调膀胱癌细胞的缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)表达,能否增强自杀基因系统(yeast cytosine deaminase/5-fluorocytosine,YCD/5-FC)的旁观者效应,提高杀灭肿瘤细胞的效率。方法阳离子纳泡结合超声辐照(US)转染人膀胱癌T24细胞,荧光显微镜及流式细胞仪观测转染效率;qRT-PCR和Western blot检测质粒转染后的mRNA或蛋白相对表达量。将实验分为无处理空白对照、载pc DNA3.1-EGFP纳泡组、载Cx26纳泡组、载YCD纳泡组、载YCD+Cx26纳泡组;通过流式细胞术观察恢复Cx26表达后对膀胱癌细胞凋亡的影响。结果 qRT-PCR、Western blot显示纳泡结合超声辐照成功将目的基因转染并有效表达。恢复Cx26表达后,载YCD+Cx26纳泡组的细胞凋亡率为(60.68±2.61)%,明显高于单载YCD纳泡组的(46.42±2.13)%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论恢复缝隙连接蛋白Cx26表达,可改善细胞间通讯连接,加强自杀基因系统YCD/5-FC的旁观者效应,促进肿瘤细胞凋亡,提高杀灭膀胱癌细胞的效率。 展开更多
关键词 缝隙连接蛋白connexin26 阳离子纳泡 超声辐照 自杀基因系统yeast CYTOSINE deaminase/5-fluorocytosine 膀胱癌
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