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抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段抗体dsFv V_L链的构建、表达和鉴定 被引量:1
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作者 葛晓冬 邹佳 +1 位作者 杨艳丽 刘友生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第14期1364-1367,共4页
目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a(+),于工程菌BL2... 目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a(+),于工程菌BL21star(DE3)中表达及TALON柱芯亲合纯化,通过ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果dsFv VL链的Thr21替换为Cys,扩增出基因片段长约为650bp,经BL21star(DE3)菌表达出相对分子质量约为28×103的目的蛋白,与NH-LBP具有一定的结合力。结论抗体轻链中成功引入了Cys。 展开更多
关键词 多糖结合蛋白氨基片段 二硫键稳定性Fv抗体 半胱氨酸
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人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定 被引量:11
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作者 葛晓冬 刘友生 +3 位作者 王晓东 王长松 邓军 李红 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期180-184,共5页
 目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BA...  目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BAC杆状病毒表达系统来表达NH -LBP。再以NH -LBP为抗原, 从人源噬菌体抗体库中筛选可产生抗NH- LBPmAb的菌株并进行鉴定。结果: 昆虫细胞sf21可表达人源NH- LBP, 经亲和纯化柱芯 (TALON)有效纯化后, 获得约8mg的NH- LBP。成功地建立人源噬菌体抗体库, 库容达5. 0×108 CFU。经 8轮筛选后, 抗体库被富集 1. 85×104 倍。经ELISA法鉴定, 获得 3株可产生抗NH -LBPmAb的菌株(核酸序列及氨基酸序列见GenBank中的: AY337713,AY337714 )。结论: 以昆虫细胞sf21表达NH LBP及以其为抗原制备噬菌体mAb是可行的。本研究为进一步建立抗NH- LBP的二硫键稳定的Fv抗体 ( disulfidestabilizedFvfrag ments, dsFv), 研究人体内LBP的变化规律和过度炎症反应的防治奠定了基础。 展开更多
关键词 多糖结合蚩白氨基片段 人源噬菌体抗体库 昆虫细胞
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人源抗NH-LBP Fab抗体的制备和初步鉴定 被引量:2
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作者 葛晓冬 邹佳 +2 位作者 刘友生 杨艳丽 段光杰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期359-362,共4页
目的构建人源抗脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)Fab抗体的原核表达载体,并制备高稳定性Fab抗体。方法用PCR方法,从可溶性表达抗NH-LBP抗体的重组质粒pComb3H-Fab中扩增出VH链和VL链基因序列,分别构建表达质粒pET-28a(+)-VH和pET-28a(+... 目的构建人源抗脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)Fab抗体的原核表达载体,并制备高稳定性Fab抗体。方法用PCR方法,从可溶性表达抗NH-LBP抗体的重组质粒pComb3H-Fab中扩增出VH链和VL链基因序列,分别构建表达质粒pET-28a(+)-VH和pET-28a(+)-VL,并于工程菌BL21(DE3)star中分别表达及TALON柱芯亲和纯化,将抗体片段VH和VL共同复性,通过二硫键形成Fab抗体,再采用ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果扩增出VL链和VH基因片段长约为650bp和700bp,经BL21star表达出相对分子质量(Mr)约为28000和30000的目的蛋白,共同折叠后所获得Fab抗体与NH-LBP具有较高的结合力。结论成功地制备抗NH-LBPFab抗体,为临床抗炎研究提供了条件。 展开更多
关键词 多糖结合蛋白氨基片段(nh-lbp) 人源抗体Fab 高效表达
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