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抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段抗体dsFv V_L链的构建、表达和鉴定 被引量:1
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作者 葛晓冬 邹佳 +1 位作者 杨艳丽 刘友生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第14期1364-1367,共4页
目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a(+),于工程菌BL2... 目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a(+),于工程菌BL21star(DE3)中表达及TALON柱芯亲合纯化,通过ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果dsFv VL链的Thr21替换为Cys,扩增出基因片段长约为650bp,经BL21star(DE3)菌表达出相对分子质量约为28×103的目的蛋白,与NH-LBP具有一定的结合力。结论抗体轻链中成功引入了Cys。 展开更多
关键词 脂多糖结合蛋白氨基端片段 二硫键稳定性Fv抗体 半胱氨酸
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重组人脂多糖结合蛋白的氨基末端片段在昆虫细胞中的表达、纯化及功能鉴定 被引量:1
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作者 葛晓冬 刘友生 +2 位作者 王晓东 王长松 邓军 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第22期2029-2032,共4页
目的 以昆虫sf2 1、sf9细胞表达、分泌人源脂多糖结合蛋白的氨基末端片段 (NH LBP) ,并初步观察其生物学特性。方法 以昆虫sf2 1和sf9细胞于完全Grace培养基中分别扩增编码人源NH LBP的杆状病毒 ,再以sf2 1和sf9细胞于SF 90 0Ⅱ无血... 目的 以昆虫sf2 1、sf9细胞表达、分泌人源脂多糖结合蛋白的氨基末端片段 (NH LBP) ,并初步观察其生物学特性。方法 以昆虫sf2 1和sf9细胞于完全Grace培养基中分别扩增编码人源NH LBP的杆状病毒 ,再以sf2 1和sf9细胞于SF 90 0Ⅱ无血清培养基中表达NH LBP ,并以TALON柱芯对NH LBP进行亲和纯化 ,此后以Tris Tricine电泳、毛细管电泳、流式细胞分析实验 (flowcytometryanalysis)、TNFa分泌实验的方法鉴定NH LBP的纯度及生物学活性。结果 昆虫sf2 1和sf9细胞均能有效地扩增编码NH LBP的杆状病毒 ,其中sf9细胞扩增病毒的能力为sf2 1细胞的 1 18倍。sf2 1细胞成功地表达、分泌NH LBP ,并经TALON柱芯亲和纯化 ,其纯度达 98%,NH LBP具有明确的与脂多糖 (LPS)结合的生物学活性 ,而sf9细胞却不能表达、分泌NH LBP。结论 以昆虫sf2 1细胞分泌表达具有活性人源NH LBP是可行的 ,昆虫sf9细胞可扩增编码NH LBP的杆状病毒 ,但不能表达、分泌NH LBP。 展开更多
关键词 昆虫细胞 人源氨基多糖结合蛋白 无血清培养基 杆状病毒
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抗人氨基末端脂多糖结合蛋白二硫键稳定性Fv抗体的制备及生物学活性的初步研究 被引量:1
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作者 邹佳 葛晓冬 +1 位作者 杨艳丽 刘友生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第14期1308-1311,共4页
目的制备抗人氨基末端脂多糖结合蛋白(N-terminal fragment of human lipopolysaccharide binding protein,NH-LBP)的二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv),并初步测定其生物学活性。方法将含有dsFv-VL与dsFvVH... 目的制备抗人氨基末端脂多糖结合蛋白(N-terminal fragment of human lipopolysaccharide binding protein,NH-LBP)的二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv),并初步测定其生物学活性。方法将含有dsFv-VL与dsFvVH包涵体蛋白经复性、折叠和纯化,获得完整的dsFv抗体。通过ELISA、TNF-α分泌等方法,初步测定dsFv抗体在体内外的生物学活性。结果获得dsFv抗体蛋白约2.1mg,dsFv与NH-LBP有较好的结合能力,并在动物体内减轻了LPS所诱导的炎症反应,发挥了一定的保护活性。结论通过分别表达VL和VH片段,再制备dsFv抗体是可行的,dsFv能部分抑制LBP的生物学功能。 展开更多
关键词 氨基多糖结合蛋白 包涵体 二硫键稳定性Fv抗体
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BAC-TO-BAC昆虫杆状病毒系统在真核表达人N端脂多糖结合蛋白的研究中的应用
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作者 殷育松 王晓东 刘友生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期1112-1112,1119,共2页
关键词 杆状病毒 sf1昆虫细胞 N多糖结合蛋白
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人源抗NH-LBP Fab抗体的制备和初步鉴定 被引量:2
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作者 葛晓冬 邹佳 +2 位作者 刘友生 杨艳丽 段光杰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期359-362,共4页
目的构建人源抗脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)Fab抗体的原核表达载体,并制备高稳定性Fab抗体。方法用PCR方法,从可溶性表达抗NH-LBP抗体的重组质粒pComb3H-Fab中扩增出VH链和VL链基因序列,分别构建表达质粒pET-28a(+)-VH和pET-28a(+... 目的构建人源抗脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)Fab抗体的原核表达载体,并制备高稳定性Fab抗体。方法用PCR方法,从可溶性表达抗NH-LBP抗体的重组质粒pComb3H-Fab中扩增出VH链和VL链基因序列,分别构建表达质粒pET-28a(+)-VH和pET-28a(+)-VL,并于工程菌BL21(DE3)star中分别表达及TALON柱芯亲和纯化,将抗体片段VH和VL共同复性,通过二硫键形成Fab抗体,再采用ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果扩增出VL链和VH基因片段长约为650bp和700bp,经BL21star表达出相对分子质量(Mr)约为28000和30000的目的蛋白,共同折叠后所获得Fab抗体与NH-LBP具有较高的结合力。结论成功地制备抗NH-LBPFab抗体,为临床抗炎研究提供了条件。 展开更多
关键词 脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP) 人源抗体Fab 高效表达
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人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定 被引量:11
6
作者 葛晓冬 刘友生 +3 位作者 王晓东 王长松 邓军 李红 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期180-184,共5页
 目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BA...  目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BAC杆状病毒表达系统来表达NH -LBP。再以NH -LBP为抗原, 从人源噬菌体抗体库中筛选可产生抗NH- LBPmAb的菌株并进行鉴定。结果: 昆虫细胞sf21可表达人源NH- LBP, 经亲和纯化柱芯 (TALON)有效纯化后, 获得约8mg的NH- LBP。成功地建立人源噬菌体抗体库, 库容达5. 0×108 CFU。经 8轮筛选后, 抗体库被富集 1. 85×104 倍。经ELISA法鉴定, 获得 3株可产生抗NH -LBPmAb的菌株(核酸序列及氨基酸序列见GenBank中的: AY337713,AY337714 )。结论: 以昆虫细胞sf21表达NH LBP及以其为抗原制备噬菌体mAb是可行的。本研究为进一步建立抗NH- LBP的二硫键稳定的Fv抗体 ( disulfidestabilizedFvfrag ments, dsFv), 研究人体内LBP的变化规律和过度炎症反应的防治奠定了基础。 展开更多
关键词 多糖结合蚩白氨基片段 人源噬菌体抗体库 昆虫细胞
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