目的开发一种基于滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)技术的高灵敏度外周血G-四链体(guanine quadruplex,G4)检测方法,建立ATRX突变型脑胶质瘤的无创分子诊断体系,为临床早期筛查提供新型液体活检策略。方法采用shRNA慢病毒感...目的开发一种基于滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)技术的高灵敏度外周血G-四链体(guanine quadruplex,G4)检测方法,建立ATRX突变型脑胶质瘤的无创分子诊断体系,为临床早期筛查提供新型液体活检策略。方法采用shRNA慢病毒感染技术建立ATRX稳定敲低的原代脑胶质瘤细胞株(ATRX KD),通过硫黄素T(thioflavin T,ThT)荧光光谱法检测细胞上清液中G4的形成水平。构建ATRX敲低的原位脑胶质瘤小鼠模型,采用RCA变温扩增技术检测模型组与对照组外周血循环游离DNA(cfDNA)中G4的丰度,并对RCA变温扩增技术的程序进行优化。收集临床确诊的ATRX突变型和野生型胶质瘤患者,以及健康志愿者的血清样本,提取cfDNA后采用优化的RCA方案进行G4定量检测,并再次对检测程序进行优化。结果体外实验显示,ATRX敲低可显著促进G4结构的形成,ATRX KD组细胞上清液中ThT荧光强度较野生型显著增加。建立RCA变温扩增方案检测ATRX突变型胶质瘤小鼠模型外周血cfDNA中G4结构的实验条件:以50 ng cfDNA为起始模板、进行10个循环扩增。临床样本验证显示,优化后的RCA变温扩增方案较传统恒温扩增效率提升,能够有效区分ATRX突变型与野生型胶质瘤患者及健康人群。结论成功建立了基于RCA变温扩增的外周血G4高灵敏度检测方案,该技术首次实现ATRX突变状态的液体活检分子分型,为胶质瘤早期筛查提供具有临床应用前景的无创诊断方法。展开更多
文摘目的开发一种基于滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)技术的高灵敏度外周血G-四链体(guanine quadruplex,G4)检测方法,建立ATRX突变型脑胶质瘤的无创分子诊断体系,为临床早期筛查提供新型液体活检策略。方法采用shRNA慢病毒感染技术建立ATRX稳定敲低的原代脑胶质瘤细胞株(ATRX KD),通过硫黄素T(thioflavin T,ThT)荧光光谱法检测细胞上清液中G4的形成水平。构建ATRX敲低的原位脑胶质瘤小鼠模型,采用RCA变温扩增技术检测模型组与对照组外周血循环游离DNA(cfDNA)中G4的丰度,并对RCA变温扩增技术的程序进行优化。收集临床确诊的ATRX突变型和野生型胶质瘤患者,以及健康志愿者的血清样本,提取cfDNA后采用优化的RCA方案进行G4定量检测,并再次对检测程序进行优化。结果体外实验显示,ATRX敲低可显著促进G4结构的形成,ATRX KD组细胞上清液中ThT荧光强度较野生型显著增加。建立RCA变温扩增方案检测ATRX突变型胶质瘤小鼠模型外周血cfDNA中G4结构的实验条件:以50 ng cfDNA为起始模板、进行10个循环扩增。临床样本验证显示,优化后的RCA变温扩增方案较传统恒温扩增效率提升,能够有效区分ATRX突变型与野生型胶质瘤患者及健康人群。结论成功建立了基于RCA变温扩增的外周血G4高灵敏度检测方案,该技术首次实现ATRX突变状态的液体活检分子分型,为胶质瘤早期筛查提供具有临床应用前景的无创诊断方法。
