丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联途径广泛参与植物的生理调控过程。胰蛋白酶作为诱抗剂可显著提高黄瓜的贮藏品质,但胰蛋白酶如何通过MAPK途径调控苯丙烷化合物的合成,从而影响果实抗性尚待阐明。为了...丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联途径广泛参与植物的生理调控过程。胰蛋白酶作为诱抗剂可显著提高黄瓜的贮藏品质,但胰蛋白酶如何通过MAPK途径调控苯丙烷化合物的合成,从而影响果实抗性尚待阐明。为了研究胰蛋白酶诱导黄瓜抗性的分子机制,该研究进行了转录组学分析和广泛靶向代谢组学联合分析,并通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)进行验证。转录组结果显示,共有83个差异表达显著基因富集在MAPK途径上,其中48个基因显著下调,35个基因显著上调。基因集富集分析进一步从领头亚集中筛选出CsWRKY33转录因子。与拟南芥、烟草等植物的多序列比对结果显示,明确该转录因子属于WRKY家族,在N端有一个高度保守WRKY结构域。该研究将转录组与广泛靶向代谢组学联合分析发现,香兰素、二氢查尔酮-4′-O-葡萄糖苷、2-羟基-3-苯基丙酸等物质的合成显著上调。共表达网络分析结果显示,上述关键代谢物应受CsWRKY33的负调控。VIGS结果显示,CsWRKY33沉默后能够提高果实的抗性,延长保存时间。该研究发现,胰蛋白酶能够下调CsWRKY33的表达,促进香兰素、二氢查尔酮-4′-O-葡萄糖苷、2-羟基-3-苯基丙酸等具有较高抗氧化抗菌活性的化合物的合成,提高果实抗病性,延缓果实衰老腐败。展开更多
凡纳滨对虾的虾头中类胰蛋白酶活性高,死后自溶引起的组织软化大大降低了其商品价值。为了减少品质下降带来的不利影响,通过大豆胰蛋白酶抑制剂来抑制凡纳滨对虾的类胰蛋白酶从而达到提高品质的目的。首先,通过30%～80%硫酸铵沉淀、Q-Se...凡纳滨对虾的虾头中类胰蛋白酶活性高,死后自溶引起的组织软化大大降低了其商品价值。为了减少品质下降带来的不利影响,通过大豆胰蛋白酶抑制剂来抑制凡纳滨对虾的类胰蛋白酶从而达到提高品质的目的。首先,通过30%～80%硫酸铵沉淀、Q-Sepharose F.F阴离子交换层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析从凡纳滨对虾中提取了类胰蛋白酶,其分子质量为32.6 k Da。通过粉碎、脱脂、0.15 mol/L Na Cl提取,再进行热变性、超滤、Sephacryl S-100凝胶过滤层析纯化得到大豆胰蛋白酶抑制剂,该抑制剂分子量为16 k Da,得率为28.95%,纯化倍数达12.51,为电泳纯。实验结果表明,该抑制剂能抑制凡纳滨对虾类胰蛋白酶的活性,其抑制类型为不可逆抑制。展开更多
胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,可特异切割精氨酸及赖氨酸C端肽键。重组人源阳离子胰蛋白酶(recombinant human cationic trypsin:rht1)的稳定性明显高于重组人源阴离子胰蛋白酶(recombinant human anionic trypsin:rht2)。比较ht1和ht2...胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,可特异切割精氨酸及赖氨酸C端肽键。重组人源阳离子胰蛋白酶(recombinant human cationic trypsin:rht1)的稳定性明显高于重组人源阴离子胰蛋白酶(recombinant human anionic trypsin:rht2)。比较ht1和ht2的氨基酸序列和三维结构,二者的氨基酸序列同源性为95%,rht1比rht2多1对二硫键Cys139-Cys206。为解释该二硫键对其稳定性的作用,构建rht1的Cys139-Cys206二硫键缺失突变体rht1-dC139S-C206S和rht2的增加该对二硫键的突变体rht2-S139C-S206C。进行了重组表达和纯化,并测定rht1、rht2及两个突变体的酶学性质,对比其稳定性。结果发现,与野生型rht1、rht2相比,突变体的酶学动力学参数km和kcat值与最适pH均未有较大差异。但在pH3~12条件下的稳定性,rht1-dC139S-C206S比rht1低46.6%;rht2-S139C-S206C比rht2高30.3%。对比其热稳定性,40℃保温4 h,rht1残余活性为92.4%,而rht1-dC139S-C206S降为60%。60℃保温4 h,rht2-S139C-S206C残余活性为83.3%,而rht2完全失活。表明了该二硫键Cys139-Cys206对人胰蛋白酶稳定性的重要性。进一步进行结构模拟和分析,解释了该对二硫键对稳定性影响的机制。展开更多
文摘丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联途径广泛参与植物的生理调控过程。胰蛋白酶作为诱抗剂可显著提高黄瓜的贮藏品质,但胰蛋白酶如何通过MAPK途径调控苯丙烷化合物的合成,从而影响果实抗性尚待阐明。为了研究胰蛋白酶诱导黄瓜抗性的分子机制,该研究进行了转录组学分析和广泛靶向代谢组学联合分析,并通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)进行验证。转录组结果显示,共有83个差异表达显著基因富集在MAPK途径上,其中48个基因显著下调,35个基因显著上调。基因集富集分析进一步从领头亚集中筛选出CsWRKY33转录因子。与拟南芥、烟草等植物的多序列比对结果显示,明确该转录因子属于WRKY家族,在N端有一个高度保守WRKY结构域。该研究将转录组与广泛靶向代谢组学联合分析发现,香兰素、二氢查尔酮-4′-O-葡萄糖苷、2-羟基-3-苯基丙酸等物质的合成显著上调。共表达网络分析结果显示,上述关键代谢物应受CsWRKY33的负调控。VIGS结果显示,CsWRKY33沉默后能够提高果实的抗性,延长保存时间。该研究发现,胰蛋白酶能够下调CsWRKY33的表达,促进香兰素、二氢查尔酮-4′-O-葡萄糖苷、2-羟基-3-苯基丙酸等具有较高抗氧化抗菌活性的化合物的合成,提高果实抗病性,延缓果实衰老腐败。
基金the National Key Scientific Program of China(2009CB941200)the National Natural Science Foundation of China(30670226)+3 种基金the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese ScholarsEducation Ministry of China(2006-331)Doctoral and Post-doctoral Research Foundation of Southwest University(2005-05)Three GorgesCorporation Research Project to Y.Li
文摘凡纳滨对虾的虾头中类胰蛋白酶活性高,死后自溶引起的组织软化大大降低了其商品价值。为了减少品质下降带来的不利影响,通过大豆胰蛋白酶抑制剂来抑制凡纳滨对虾的类胰蛋白酶从而达到提高品质的目的。首先,通过30%～80%硫酸铵沉淀、Q-Sepharose F.F阴离子交换层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析从凡纳滨对虾中提取了类胰蛋白酶,其分子质量为32.6 k Da。通过粉碎、脱脂、0.15 mol/L Na Cl提取,再进行热变性、超滤、Sephacryl S-100凝胶过滤层析纯化得到大豆胰蛋白酶抑制剂,该抑制剂分子量为16 k Da,得率为28.95%,纯化倍数达12.51,为电泳纯。实验结果表明,该抑制剂能抑制凡纳滨对虾类胰蛋白酶的活性,其抑制类型为不可逆抑制。
文摘胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,可特异切割精氨酸及赖氨酸C端肽键。重组人源阳离子胰蛋白酶(recombinant human cationic trypsin:rht1)的稳定性明显高于重组人源阴离子胰蛋白酶(recombinant human anionic trypsin:rht2)。比较ht1和ht2的氨基酸序列和三维结构,二者的氨基酸序列同源性为95%,rht1比rht2多1对二硫键Cys139-Cys206。为解释该二硫键对其稳定性的作用,构建rht1的Cys139-Cys206二硫键缺失突变体rht1-dC139S-C206S和rht2的增加该对二硫键的突变体rht2-S139C-S206C。进行了重组表达和纯化,并测定rht1、rht2及两个突变体的酶学性质,对比其稳定性。结果发现,与野生型rht1、rht2相比,突变体的酶学动力学参数km和kcat值与最适pH均未有较大差异。但在pH3~12条件下的稳定性,rht1-dC139S-C206S比rht1低46.6%;rht2-S139C-S206C比rht2高30.3%。对比其热稳定性,40℃保温4 h,rht1残余活性为92.4%,而rht1-dC139S-C206S降为60%。60℃保温4 h,rht2-S139C-S206C残余活性为83.3%,而rht2完全失活。表明了该二硫键Cys139-Cys206对人胰蛋白酶稳定性的重要性。进一步进行结构模拟和分析,解释了该对二硫键对稳定性影响的机制。
