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拟南芥受体激酶At CERK1胞外结构域互作蛋白的筛选与验证
1
作者 史文炯 付振超 曾洪梅 《植物保护》 北大核心 2025年第3期113-121,134,共10页
几丁质激发子受体激酶1(chitin elicitor receptor kinase 1,CERK1)是一种含有溶素基序(lysin motif,LysM)的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),在植物免疫响应过程中起重要作用。目前发现CERK1识别的激发子主要为碳水化... 几丁质激发子受体激酶1(chitin elicitor receptor kinase 1,CERK1)是一种含有溶素基序(lysin motif,LysM)的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),在植物免疫响应过程中起重要作用。目前发现CERK1识别的激发子主要为碳水化合物,是否识别蛋白类配体还不清楚。禾谷镰刀菌Fusarium graminearum是众所周知的真菌病原体,可以侵染谷物也可以侵染拟南芥。为了确定CERK1的新功能并筛选获得新的激发子,我们以拟南芥几丁质激发子受体激酶胞外结构域(Arabidopsis thaliana chitin elicitor receptor kinase 1 extra cellular domain,At CERK1-ECD)为诱饵,通过酵母双杂交(yeast-two-hybrid,Y2H)筛选禾谷镰刀菌cDNA文库,获得候选互作蛋白内切葡聚糖酶5(Fg-endoglucanase-5)。内切葡聚糖酶是一类参与植物免疫反应及微生物侵染、定殖、共生的蛋白,Fg-endoglucanase-5是其中的一种。进一步,通过谷胱甘肽S-转移酶下拉(GST pull-down)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验验证了At CERK1-ECD与Fg-endoglucanase-5的相互作用,并分析了Fg-endoglucanase-5的功能。本研究获得了At CERK1-ECD的互作蛋白Fg-endoglucanase-5并阐明了它们在植物-微生物相互作用中的功能,有助于开发新型激发子并找到植物病害防治的新策略。 展开更多
关键词 拟南芥 几丁质激发子受体激酶胞外结构域 酵母双杂交 互作蛋白
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细菌四类胞外感觉结构域的概述
2
作者 许阳阳 袁文肃 《湖北农业科学》 2022年第11期149-157,共9页
细菌通过信号转导网络系统感知外界的环境变化,并通过调节自身基因表达,控制菌体的行为、代谢以及发育等。细菌和古细菌大多数使用双组分转导系统和化学传感系统感知环境变化。基于基因组研究发现在细菌的双组份转导系统和化学传感系统... 细菌通过信号转导网络系统感知外界的环境变化,并通过调节自身基因表达,控制菌体的行为、代谢以及发育等。细菌和古细菌大多数使用双组分转导系统和化学传感系统感知环境变化。基于基因组研究发现在细菌的双组份转导系统和化学传感系统中存在多种不同的胞外结构域,这些胞外结构域能感知胞外信号,对细菌的各种生理功能具有重要作用。介绍了Cache结构域、CHASE结构域、NIT结构域以及4HB结构域这4类胞外感觉结构域的结构特性以及功能,为胞外感觉结构域的分类以及识别信号的位点提供借鉴。 展开更多
关键词 信号转导 双组份系统 化学传感系统 胞外感觉结构域
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人胰岛素样生长因子1受体β结构域蛋白的原核表达及活性检测 被引量：1
3
作者 郭靖 冯滢滢 +5 位作者 王涛 张柯 李玲 冀全博 徐小洁 叶棋浓 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1211-1215,共5页
目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PK... 目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体。重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,最后用GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知蛋白表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)的相互作用。结果构建得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序后与目的序列一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,并经过Western blot检测,融合蛋白成功表达;纯化得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD两个融合蛋白,GST pull-down证明蛋白GST-IGF1Rβ-PKD可以和MEMO相互作用。结论成功克隆GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因,并获得活性良好的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD蛋白。 展开更多
关键词 胰岛素样生长因子1受体(IGF1R) β亚基胞外结构域 β亚基胞内蛋白激酶结构域 原核表达 纯化 表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)
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拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLV1胞外域的可溶性表达与纯化
4
作者 李锋 严孝金 +3 位作者 韩翠晓 冯舵 李倩倩 高伟 《湖北农业科学》 北大核心 2011年第11期2259-2263,共5页
大肠杆菌NusA蛋白与拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLAVATA1(CLV1)胞外结构域(Ectodomain,ECD)融合表达,实现了蛋白CLV1-ECD的可溶性表达;CLV1-ECD与其配体蛋白CLAVATA3(CLV3)共表达,可以明显提高它的水溶性。该实验方法快速简易地获得了大量纯... 大肠杆菌NusA蛋白与拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLAVATA1(CLV1)胞外结构域(Ectodomain,ECD)融合表达,实现了蛋白CLV1-ECD的可溶性表达;CLV1-ECD与其配体蛋白CLAVATA3(CLV3)共表达,可以明显提高它的水溶性。该实验方法快速简易地获得了大量纯化的CLV1-ECD蛋白,避免了包涵体变性与复性的复杂过程,为植物CLAVATA信号系统的进一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 亮氨酸重复序列 CLAVATA1(CLV1) 可溶性表达 胞外结构域 共表达
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HER2胞外段的克隆与原核表达
5
作者 许银辉 郭晓芳 +5 位作者 邬仙华 钱晨旭 罗磊 徐莲花 冯紫雅 张小影 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期88-93,共6页
应用RT-PCR技术从人乳腺癌细胞系SK-BR-3中克隆出人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor 2,HER2)基因的胞外段,并插入到表达载体pET-30a中,得到重组表达载体pET30-HER2(Ex)。将该载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞... 应用RT-PCR技术从人乳腺癌细胞系SK-BR-3中克隆出人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor 2,HER2)基因的胞外段,并插入到表达载体pET-30a中,得到重组表达载体pET30-HER2(Ex)。将该载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,加入IPTG进行诱导表达,成功获得HER2胞外段蛋白。分别提取培养液上清、大肠杆菌周质腔、细胞质可溶性及不可溶性组分蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,确定目的蛋白定位于大肠杆菌细胞质包涵体中。通过改变诱导温度、诱导物浓度、诱导起始菌体密度和诱导时间,寻找最佳表达条件,使目的蛋白的表达量达到最高。结果表明,在37℃下,OD600达到1.0时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h,目的蛋白的表达量最高。将重组表达菌进行超声破碎,分离出包涵体组分,经Ni2+亲和层析纯化后获得了纯度>90%的HER2胞外段蛋白,从而为抗HER2抗体的制备及肿瘤疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人表皮生长因子受体2 胞外结构域 原核表达 pET-30a载体
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机械力调控PD-1介导的T细胞抑制
6
作者 陈辉 张勇 +3 位作者 崔蕾 范娟 陈伟 娄继忠 《医用生物力学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第S01期401-402,共2页
目的PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合后,可以抑制TCR信号、阻止T细胞活化,是抗肿瘤免疫疗法中广泛应用的检查点分子。然而PD-1信号转导的分子机制目前还不清楚,本研究希望从生物力学角度出发研究PD-1与其配体之间的相互作用,进而明晰PD-1... 目的PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合后,可以抑制TCR信号、阻止T细胞活化,是抗肿瘤免疫疗法中广泛应用的检查点分子。然而PD-1信号转导的分子机制目前还不清楚,本研究希望从生物力学角度出发研究PD-1与其配体之间的相互作用,进而明晰PD-1抑制T细胞的分子机制,为基于PD-1的抗肿瘤免疫疗法开发提供指导。方法综合利用生物膜力探针、分子动力学模拟、超分辨成像技术以及传统的免疫学手段研究了PD-1与其配体在力加载条件下的相互作用以及机械力对PD-1信号的调控。结果PD-1与配体形成逆锁键,复合体结构除了在晶体结构中观察到的不受力的构象外,还存在一个力诱导以及力稳定的构象,而稳定这两种构象的相应残基的突变会削弱逆锁键并降低PD-1的抑制功能。基于DNA力探针的T细胞活化实验也证明机械力加载是导致PD-1信号活化以及T细胞抑制的重要因素。PD-L1的可溶性胞外结构域可以结合PD-1同时不提供外力,能与细胞表面表达的PD-L1竞争,从而削弱PD-1对T细胞活化的抑制作用,抑制小鼠肿瘤生长。结论PD-1与其配体相互作用介导的T细胞抑制受机械力调控,PD-L1可溶性胞外结构域由于能结合PD-1同时不提供外力刺激,因此是一种潜在的PD-1阻断剂。 展开更多
关键词 T细胞活化 小鼠肿瘤 生物力学 检查点 胞外结构域 阻断剂 抑制功能 超分辨成像
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三疣梭子蟹PtToll-1受体的原核表达及组织、细胞分布研究
7
作者 张丹枫 王国良 +3 位作者 杨宁 张鑫 周素明 刘顺 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期300-306,共7页
为深入研究三疣梭子蟹Toll受体的功能,在前期工作的基础上构建了Pt Toll-1胞外结构域原核表达载体,并成功获得其重组蛋白。将获得的重组蛋白免疫小鼠获得抗此重组蛋白免疫抗血清用于后续研究。SDSPAGE结果表明,体外诱导表达重组蛋白r Pt... 为深入研究三疣梭子蟹Toll受体的功能,在前期工作的基础上构建了Pt Toll-1胞外结构域原核表达载体,并成功获得其重组蛋白。将获得的重组蛋白免疫小鼠获得抗此重组蛋白免疫抗血清用于后续研究。SDSPAGE结果表明,体外诱导表达重组蛋白r Pt Toll-1以包涵体的形式出现在大肠杆菌裂解液的沉淀中,分子量大小约为87.18 k D;Western-Blot分析表明,小鼠抗血清能与r Pt Toll-1特异性结合。利用免疫荧光及细胞免疫化学方法对三疣梭子蟹Pt Toll-1在消化道、肝胰腺、鳃、心脏和肌肉等组织及血淋巴细胞中的分布进行研究。此外成功构建Pt Toll-1完整蛋白的真核表达载体p EGFP-N2-Pt Toll-1,并转染HEK293T细胞研究其在哺乳动物细胞HEK293中的表达。组织免疫荧光结果显示,Pt Toll-1在三疣梭子蟹消化道、肝胰腺、鳃、心脏及肌肉等组织中均有分布,但在鳃及消化道的组织结构中表达较强;细胞免疫荧光及免疫化学结果均表明Pt Toll-1主要分布在血淋巴的细胞膜上;激光共聚焦显微技术观察发现,p EGFP-Pt Toll-1融合蛋白也主要在HEK-293T细胞膜上表达。研究结果将为三疣梭子蟹Toll受体蛋白的免疫学功能的研究奠定基础。 展开更多
关键词 三疣梭子蟹 TOLL受体 胞外结构域 原核表达 组织分布 真核表达 细胞定位
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人源γ-分泌酶的三维结构
8
作者 Peng Z Zhu Y +3 位作者 Wang Q 韩鸿雁 许春伟 李晓兵 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1236-1236,共1页
人源γ-分泌酶与阿尔茨海默病（Alzheimer＇s disease,AD）发病直接相关,其组成复杂,由早老素-1（PS1）、PEN-2、APH-1和nicastrin四个亚基组成。AD属于膜嵌入式蛋白酶,通过底物切割控制着许多重要的细胞功能。异常切割淀粉样前体蛋白AP... 人源γ-分泌酶与阿尔茨海默病（Alzheimer＇s disease,AD）发病直接相关,其组成复杂,由早老素-1（PS1）、PEN-2、APH-1和nicastrin四个亚基组成。AD属于膜嵌入式蛋白酶,通过底物切割控制着许多重要的细胞功能。异常切割淀粉样前体蛋白APP产生过量的淀粉样蛋白（Aβ）。Aβ易在脑部发生沉积,从而诱发AD。本组通过低温电子显微镜单颗粒分析, 展开更多
关键词 Γ-分泌酶 淀粉样前体蛋白 阿尔茨海默病 三维结构 颗粒分析 胞外结构域 作用机制 跨膜结构域 羧肽酶
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有望研制禽流感-新城疫蛋内接种二联疫苗
9
作者 Vaccine 《中国家禽》 北大核心 2008年第2期64-64,共1页
针对家禽高致病性禽流感和新城疫，实施疫苗免疫是获得保护的一种方法。先前的研究已经实现了重组流感病毒的表达，对病毒进行的处理为去除多碱基切割肽的H5凝集素，采用新城疫病毒的血凝素和神经氨酸酶的胞外结构域代替流感病毒神经氨... 针对家禽高致病性禽流感和新城疫，实施疫苗免疫是获得保护的一种方法。先前的研究已经实现了重组流感病毒的表达，对病毒进行的处理为去除多碱基切割肽的H5凝集素，采用新城疫病毒的血凝素和神经氨酸酶的胞外结构域代替流感病毒神经氨酸酶的胞外域。美国西奈山医学院的科研人员将这个重组病毒在人支气管上皮原始细胞中进行培养，从而获得了减毒病毒株。 展开更多
关键词 高致病性禽流感 新城疫病毒 二联疫苗 神经氨酸酶 接种 流感病毒 重组病毒 胞外结构域
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