SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域编码基因的体外转录及其在293T细胞中的表达

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作者 周雪 高磊 +3 位作者 张瑾宬 袁思凌 操蓉 刘丽娜 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期123-129,共7页

为获得能表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突蛋白受体结合结构域(RBD)的体外转录mRNA,将设计、优化并合成的RBD基因片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-RBD;重组质粒转染哺乳动物细胞293T后,We... 为获得能表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突蛋白受体结合结构域(RBD)的体外转录mRNA,将设计、优化并合成的RBD基因片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-RBD;重组质粒转染哺乳动物细胞293T后,Western blot检测重组蛋白RBD的表达;以表达RBD的重组质粒为模板,PCR扩增包含T7启动子的RBD基因片段作为体外转录模板,之后利用T7转录试剂盒体外转录获得修饰的RBD mRNA,添加多聚腺苷酸尾后使用RNA纯化试剂盒进行纯化,纯化后的RBD mRNA转染至293T细胞中,利用Western blot进行目的蛋白表达鉴定。结果显示,编码RBD的重组质粒构建成功并能在293T细胞中表达外源蛋白,体外转录获得修饰的RBD mRNA能在哺乳动物细胞中翻译,表达的RBD蛋白能与抗RBD的单克隆抗体反应,具有免疫反应原性,为SARS-CoV-2 RBD mRNA疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 刺突蛋白 受体结合结构域 体外转录 真核表达

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A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

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作者 林维鹏 崔鹏飞 +2 位作者 王思文 邓国华 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期107-112,139,共7页

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源... A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。 展开更多

关键词 A型流感病毒 PB2蛋白 帽子结合结构域 原核表达 纯化

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钙结合和卷曲螺旋结构域2对血管紧张素Ⅱ诱导的房颤动物模型心房重构的影响及其机制

3

作者 桑婉玥 王璐 +2 位作者 简易 汤宝鹏 李耀东 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期2059-2066,共8页

目的:探讨钙结合和卷曲螺旋结构域2(calcium binding and coiled-coil domain 2,CALCOCO_(2))在心房颤动(atrial fibrillation,AF)动物模型的表达及其逆转AF小鼠心房重构的作用及机制。方法:将12只大鼠及12只小鼠各随机分为2组(n=6):盐... 目的:探讨钙结合和卷曲螺旋结构域2(calcium binding and coiled-coil domain 2,CALCOCO_(2))在心房颤动(atrial fibrillation,AF)动物模型的表达及其逆转AF小鼠心房重构的作用及机制。方法:将12只大鼠及12只小鼠各随机分为2组(n=6):盐水对照组(saline组)和血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导的AF组(Ang Ⅱ组)。利用Western blot及免疫组化检测CALCOCO_(2)在大、小鼠心房肌的表达。将另外24只小鼠按随机数字法均分为4组(n=6):saline-oeNC组、Ang Ⅱ-oeNC组、saline-oeCALCOCO_(2)组和Ang Ⅱ-oeCALCOCO_(2)组。利用腺相关病毒实现小鼠心肌CALCOCO_(2)过表达。经胸超声心动图和心内电生理检测小鼠心功能;Western blot和TUNEL染色评估CALCOCO_(2)对AF心肌细胞凋亡的影响;免疫组化评估CALCOCO_(2)对AF心房肌组织氧化应激[NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2,NOX2)和NOX4]及纤维化相关蛋白[I型胶原(collagen type I,Col I)、缝隙连接蛋白40(connexin 40,Cx40)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)]的调控作用。结果:Western blot及免疫组化结果显示,与saline组相比,Ang Ⅱ组大、小鼠心房肌CALCOCO_(2)水平显著降低(0.19±0.01 vs 0.32±0.03,0.37±0.10 vs 1.00±0.10,P<0.01)。心脏超声显示,与Ang Ⅱ-oeNC组相比,Ang Ⅱ-oeCALCOCO_(2)组小鼠左房内径显著缩小,AF持续时间显著缩短,射血分数显著提升(P<0.05)。TUNEL染色半定量分析显示,与Ang Ⅱ-oeNC组相比,Ang Ⅱ-oe-CALCOCO_(2)组小鼠心房肌细胞凋亡率显著降低(0.30±0.06 vs 0.61±0.03,P<0.01),这与BAX(1.94±0.34 vs 3.14±0.34)、cleaved caspase-3(2.19±0.41 vs 3.52±0.55)等凋亡相关蛋白的表达趋势一致(P<0.05)。免疫组化结果显示,与saline-oeNC组相比,Ang Ⅱ-oeNC组氧化应激相关蛋白NOX2和NOX4及纤维化相关蛋白Col I和α-SMA水平显著升高,Cx40水平显著降低,而在CALCOCO_(2)过表达后这些蛋白水平被显著逆转(P<0.05)。结论:CALCOCO_(2)过表达可通过抑制小鼠心房氧化应激、凋亡及纤维化来逆转AF心房电重构和结构重构。 展开更多

关键词 钙结合和卷曲螺旋结构域2 心房颤动 心房重构 细胞凋亡

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人基质蛋白酶2(MMP-2)血红素结合蛋白样结构域原核表达、复性及生物学活性验证

4

作者 李彦杰 刘仁华 +2 位作者 杨俊年 王保莉 郭蔼光 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期204-207,共4页

用RT-PCR从人神经胶质瘤U87细胞扩增人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)血红素结合蛋白样结构域(PEX)基因,克隆到pMD18-T载体然后测序;将PEX定向克隆到PET-25b(+)中构建原核表达载体PET-PEX,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达产生表达量近40%的包... 用RT-PCR从人神经胶质瘤U87细胞扩增人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)血红素结合蛋白样结构域(PEX)基因,克隆到pMD18-T载体然后测序;将PEX定向克隆到PET-25b(+)中构建原核表达载体PET-PEX,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达产生表达量近40%的包涵体蛋白,表达蛋白分子量大小约28.0KD,与预期大小相符。包涵体经优化洗涤,8 mol/L尿素变性,采用透析法进行复性。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验显示复性后的PEX蛋白能显著抑制鸡胚新生血管生成(P<0.05),并且其抑制作用表现出一定的剂量依赖性。 展开更多

关键词 人基质金属蛋白酶-2 血红素结合蛋白样结构域 复性 血管生成

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氨基酸组成及分子表面属性对胶原与盘状结构域受体DDR2结合能力的影响

5

作者 韩庆秋 寇慧芝 +3 位作者 未本美 许承志 侯袁静 汪海波 《材料导报》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第20期265-271,共7页

本工作利用ELISA实验和细胞黏附实验研究了不同物种来源的胶原样本与盘状结构域受体DDR2及人舌鳞癌细胞CAL-27的结合能力,并进一步探讨了氨基酸组成对胶原与细胞受体DDR2结合能力的影响。结果表明,不同来源的胶原样本与DDR2及CAL-27细... 本工作利用ELISA实验和细胞黏附实验研究了不同物种来源的胶原样本与盘状结构域受体DDR2及人舌鳞癌细胞CAL-27的结合能力,并进一步探讨了氨基酸组成对胶原与细胞受体DDR2结合能力的影响。结果表明,不同来源的胶原样本与DDR2及CAL-27细胞的结合能力存在显著性差异,其中,哺乳动物胶原的结合能力明显大于鱼类胶原,各鱼类胶原之间也存在差异性。通过分析胶原蛋白的氨基酸组成与胶原-受体DDR2结合能力之间的相关性可知,胶原-DDR2结合能力与天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、酸性氨基酸、带电荷极性氨基酸、非极性氨基酸呈负相关,与羟脯氨酸、亚氨基酸、羟基化率(%)、不带电荷极性氨基酸、总极性氨基酸呈正相关(P<0.05)。与此同时,进一步研究了胶原蛋白分子的表面属性对胶原-受体DDR2结合能力的影响。分析表明,较低的Zeta电位绝对值或较高的亲水性均有助于胶原与DDR2的结合。 展开更多

关键词 胶原蛋白 盘状结构域受体DDR2 氨基酸 结合能力

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甲基-CpG结合结构域蛋白2抑制PRRSV复制的研究 被引量：2

6

作者 赵慧君 赵旭阳 +7 位作者 史西保 陈静 范小敏 王丽 李青梅 常晓博 邓瑞广 张改平 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期903-911,917,共10页

为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36... 为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36、48 h后分别取样,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blots试验进行检测。结果表明,PRRSV感染下调MBD2的mRNA和蛋白的表达水平。用真核表达载体pcDNA3.1-Flag构建了MBD2的真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-MBD2,用pcDNA3.1-Flag-MBD2转染MARC-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后收获细胞。TCID50的试验结果表明,过表达MBD2能降低PRRSV滴度,而qRT-PCR和Western blots的结果则表明MBD2能降低PRRSV的载量;相反,MBD2的siRNA试验表明,下调表达有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。通过基因缺失试验,构建MBD2部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制起关键的作用。研究结果表明,MBD2是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 甲基-CpG结合结构域蛋白2 miR-373

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核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性体在2型糖尿病并发冠心病过程中的作用 被引量：4

7

作者 曹运兰 胡龙江 宋耀明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期801-806,共6页

目的探究核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性体在2型糖尿病并发冠心病过程中的作用。方法选取第三军医大学新桥医院心血管内科的住院患者共130例,分为... 目的探究核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性体在2型糖尿病并发冠心病过程中的作用。方法选取第三军医大学新桥医院心血管内科的住院患者共130例,分为单纯冠心病组(n=40)、单纯2型糖尿病组(n=20)、2型糖尿病并发冠心病组(n=40)及正常对照组(n=30)。分离外周血单个核细胞及血浆。采用RT-q PCR、Western blot分别检测各组外周血单个核细胞中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosisassociated speck-like protein,ASC)、半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)mRNA及蛋白表达情况,ELISA法检测各组血浆中IL-1β含量。结果单纯冠心病组、单纯2型糖尿病组及2型糖尿病并发冠心病组外周血单个核细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均较正常对照组显著增高(P<0.05),其中,2型糖尿病并发冠心病组ASC、Caspase-1 mRNA在外周血单个核细胞中的表达显著高于单纯冠心病组及单纯2型糖尿病组(P<0.05),而2型糖尿病并发冠心病组NLRP3蛋白在外周血单个核细胞中的表达显著高于单纯冠心病组及单纯2型糖尿病组(P<0.05)。同时,测得单纯冠心病组、单纯2型糖尿病组及2型糖尿病并发冠心病组血浆中IL-1β含量分别为(24.05±1.00)、(22.86±1.66)、(26.85±1.45)ng/L,较正常对照组(12.53±2.79)ng/L均显著升高(P<0.05),其中,2型糖尿病并发冠心病组血浆中IL-1β含量显著高于单纯冠心病组及单纯2型糖尿病组(P<0.05)。结论 NLRP3炎性体的异常激活可促进2型糖尿病并发冠心病病理过程的发生、发展,其可能成为防治2型糖尿病并发冠心病的新靶点。 展开更多

关键词 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 炎性体 冠心病 2型糖尿病 IL-1Β

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敲低YTH结构域N^6甲基腺嘌呤(m^6A)RNA结合蛋白2(YTHDF2)抑制宫颈癌细胞增殖并促进其凋亡 被引量：10

8

作者 李子玮 罗清雅 +4 位作者 王浩丞 刘毅 冯小玲 李真子 易萍 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期255-263,共9页

目的探讨敲低YTH结构域N^6甲基腺嘌呤(m^6A)RNA结合蛋白2(YTHDF2)对人宫颈癌细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法利用人蛋白图谱(Human Protein Atlas)数据库分析YTHDF2在宫颈癌中表达及与生存时间的关系。收集宫颈癌和正常宫颈组织各31例... 目的探讨敲低YTH结构域N^6甲基腺嘌呤(m^6A)RNA结合蛋白2(YTHDF2)对人宫颈癌细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法利用人蛋白图谱(Human Protein Atlas)数据库分析YTHDF2在宫颈癌中表达及与生存时间的关系。收集宫颈癌和正常宫颈组织各31例,采用免疫组织化学法检测YTHDF2的蛋白表达差异;利用敲低YTHDF2的短发夹RNA(shRNA)及空载质粒包装慢病毒,并感染至宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞,实时荧光定量PCR及Western blot法检测YTHDF2的mRNA及蛋白水平,敲低YTHDF2后,采用CCK-8法检测细胞增殖活性,集落形成实验检测细胞集落形成能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果检测数据库发现YTHDF2在宫颈癌中表达越高生存时间越短,与正常宫颈组织相比,YTHDF2在宫颈癌组织高表达。敲低YTHDF2后,抑制宫颈癌细胞增殖,促进细胞凋亡,使细胞阻滞于S期。结论YTHDF2在宫颈癌组织中高表达,敲低后抑制宫颈癌细胞增殖并促进其凋亡。 展开更多

关键词 YTH结构域N^6甲基腺嘌呤RNA结合蛋白2(YTHDF2) 宫颈癌 HeLa/SiHa细胞 细胞增殖 细胞凋亡

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结核分枝杆菌H37Ra诱导核苷酸结合寡聚结构域2基因敲除(NOD2-/-)小鼠的1型辅助T（Th1）细胞型免疫应答 被引量：4

9

作者 陈少红 张倩 +3 位作者 刘俊彤 汤业珍 韩怀钦 梁锦屏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期577-582,共6页

目的探讨1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)及多功能T细胞在感染结核分枝杆菌H37Ra的核苷酸结合寡聚结构域2基因敲除(NOD2-/-)小鼠中的作用.方法NOD2-/-小鼠与野生型C57BL/6小鼠气管分别滴入MTB减毒... 目的探讨1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)及多功能T细胞在感染结核分枝杆菌H37Ra的核苷酸结合寡聚结构域2基因敲除(NOD2-/-)小鼠中的作用.方法NOD2-/-小鼠与野生型C57BL/6小鼠气管分别滴入MTB减毒株H37Ra建立肺部感染模型并设立生理盐水对照组,每组10只.4周后,取肺组织进行HE染色及病理评分;ELISA检测肺组织匀浆中TNF-α和IFN-γ含量;流式细胞术检测脾细胞中多功能CD4+T/CD8+T细胞的比例.结果NOD2-/-小鼠感染H-37Ra后肺组织炎症加重,肺组织TNF-α和IFN-γ含量增加.与生理盐水组相比,两种小鼠感染后,CD4+/CD8+T细胞中TNF-α+、IFN-γ+单阳性细胞及TNF-α+IFN-γ+细胞均显著增加;与C57BL/6小鼠感染组相比,NOD2-/-小鼠感染组体内TNF-α+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞及IFN-γ+CD8+T细胞显著增加.结论H37Ra可诱导NOD2-/-小鼠的Th1细胞型免疫应答反应. 展开更多

关键词 结核分枝杆菌(MTB) 核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2) 肿瘤坏死因子α(TNF-α) γ干扰素(IFN-γ) 多功能T细胞

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转录因子E2F-1的DNA结合结构域与GST的融合表达和纯化

10

作者 姜勇 徐应琪 +2 位作者 涂晓明 陈妍 施蕴渝 《中国科学技术大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第6期669-673,共5页

通过聚合酶链式反应方法扩增转录因子Ｅ２Ｆ－１中ＤＮＡ结合结构域的基因片段，并将其克隆到ｐＧＥＸ－２Ｔ表达载体中，转化ＢＬ２１菌株．经ＩＰＴＧ诱导，目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，其表达量达１５％．经ＧＳＴ－Ａｇａｒ... 通过聚合酶链式反应方法扩增转录因子Ｅ２Ｆ－１中ＤＮＡ结合结构域的基因片段，并将其克隆到ｐＧＥＸ－２Ｔ表达载体中，转化ＢＬ２１菌株．经ＩＰＴＧ诱导，目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，其表达量达１５％．经ＧＳＴ－Ａｇａｒｏｓｅ亲合层析，目的蛋白得到了高度纯化．经胶迁移率改变实验（ｇｅｌｓｈｉｆｔｍｏｂｉｌｉｔｙａｓａｙ）证明目的蛋白具有与腺病毒Ｅ２启动子ＤＮＡ片段结合的能力． 展开更多

关键词 转录因子 E2F-1 DNA结合结构域 GST 纯化

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OSBPL2介导RhoA/ROCK2信号通路调控听觉细胞肌动蛋白细胞骨架

11

作者 张城 杨倩 +1 位作者 姚俊 曹新 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2023年第5期648-654,共7页

目的:探索氧化固醇结合蛋白样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)对听觉细胞肌动蛋白骨架形态和功能的影响及其相关分子机制。方法:采用OSBPL2基因敲除(Osbpl2-KO)HEI-OC1细胞探讨OSBPL2缺陷对听觉细胞肌动蛋白细胞骨架形... 目的:探索氧化固醇结合蛋白样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)对听觉细胞肌动蛋白骨架形态和功能的影响及其相关分子机制。方法:采用OSBPL2基因敲除(Osbpl2-KO)HEI-OC1细胞探讨OSBPL2缺陷对听觉细胞肌动蛋白细胞骨架形态和功能的影响;扫描电镜观察Osbpl2-KO小鼠毛细胞静纤毛形态;Western blot实验检测HEI-OC1细胞和耳蜗内Rho/ROCK信号通路关键效应因子Rho激酶2(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 2,ROCK2)、Lim激酶1(LIM domain kinase 1,LIMK1)、肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白1(actin depolymerizing factor/cofilin 1,ADF/CFL-1)的表达水平。结果:Osbpl2-KO HEI-OC1细胞微丝骨架中纤维肌动蛋白(F-actin)的分布明显减少,细胞外周微刺突和丝状伪足明显减少,细胞迁移能力明显减弱;扫描电镜下观察发现Osbpl2敲除导致小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛变短且排列紊乱;Western blot检测结果表明,在HEI-OC1细胞和小鼠耳蜗中OSBPL2-KO均导致RhoA/ROCK2信号通路的抑制。结论:在听觉细胞中OSBPL2介导的RhoA/ROCK2信号通路在维持肌动蛋白细胞骨架形态和功能的过程中发挥重要的调控作用。 展开更多

关键词 氧化固醇结合蛋白样蛋白2 肌动蛋白细胞骨架 RhoA/ROCK2信号通路 肌动蛋白解聚因子 丝切蛋白1

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Eps15同源结构域包含蛋白2通过调控Cyclin D1-CDK4-pRb信号轴影响食管鳞癌细胞的增殖 被引量：1

12

作者 张知达 邓丹霞 +7 位作者 文兵 彭柳 董科 潘德渊 郑海香 廖连娣 许丽艳 李恩民 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期1174-1192,共19页

微丝结合蛋白是微丝细胞骨架的重要组成成分,它们通过促进微丝的聚合和解聚来影响微丝的动力学。大量研究已经表明,微丝和微丝结合蛋白参与细胞癌变的所有阶段。我们通过对食管癌蛋白质组数据挖掘结果显示,微丝结合蛋白Eps15同源结构域... 微丝结合蛋白是微丝细胞骨架的重要组成成分,它们通过促进微丝的聚合和解聚来影响微丝的动力学。大量研究已经表明,微丝和微丝结合蛋白参与细胞癌变的所有阶段。我们通过对食管癌蛋白质组数据挖掘结果显示,微丝结合蛋白Eps15同源结构域包含蛋白2(EHD2)在食管癌组织中低表达,且EHD2低表达的食管癌患者预后不良。以往的研究已经证明,EHD2参与调控糖代谢、自噬和肿瘤迁移。然而,EHD2在食管癌进展中的作用和机制仍不清楚。本研究旨在探究EHD2在食管鳞癌细胞中的影响及其作用机制。免疫荧光和细胞组分分离结果显示,EHD2不仅定位于细胞膜和细胞质,还存在于细胞核中。使用克隆形成实验、EdU细胞增殖实验和细胞流式术检测EHD2对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。结果显示,过表达EHD2和EHD2-3×NLS(核定位信号)抑制食管鳞癌细胞增殖和细胞周期G_(1)/S转换;同时,双荧光素报告基因结果显示,过表达EHD2和EHD2-3×NLS抑制Wnt信号通路活性。而siRNA敲降则获得相反的结果。免疫共沉淀和Duolink-PLA实验证明,EHD2与Wnt信号通路关键分子β-连环蛋白(β-catenin)和T细胞因子3(T-cell factor 3,TCF3)相互作用。蛋白质印迹和荧光定量PCR结果证实,过表达EHD2和EHD2-3×NLS抑制TCF3下游与增殖和细胞周期相关的靶基因的转录,以及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白激酶4(CDK4)和pRb的蛋白质表达。以上结果表明,核EHD2与β-catenin和TCF3复合体相互作用,通过Cyclin D1-CDK4-pRb信号轴来调控食管鳞癌细胞的增殖和细胞周期进程。 展开更多

关键词 微丝结合蛋白 Eps15同源结构域包含蛋白2(EHD2) 细胞增殖 T细胞因子3 食管鳞癌

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水稻OsGAP1 C2结构域中对钙离子的结合能力强于对钾离子

13

作者 张凡 张娜 +7 位作者 袁伟 李瑛 张仟 张英娇 许飞云 刘建平 苗锐 许卫锋 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期1258-1265,共8页

钙离子作为植物细胞的第二信使,广泛参与植物应对不同逆境胁迫的信号调控过程。水稻G蛋白促进蛋白1(Oryza sativa GTPase-activating protein 1,OsGAP1)包含1个C2结构域,而含C2结构域的蛋白质是一类钙离子结合蛋白质,受钙信号的调控。... 钙离子作为植物细胞的第二信使,广泛参与植物应对不同逆境胁迫的信号调控过程。水稻G蛋白促进蛋白1(Oryza sativa GTPase-activating protein 1,OsGAP1)包含1个C2结构域,而含C2结构域的蛋白质是一类钙离子结合蛋白质,受钙信号的调控。本研究鉴定了水稻OsGAP1的由5个保守性天冬氨酸残基组成的阳离子结合区域。该区域可结合2个钙离子或者钾离子,且其结合钙离子的强度高于其结合钾离子的强度,但是不能结合镁离子。当将其中2个保守的天冬氨酸残基(Asp-23和Asp-28)突变为丙氨酸后,其对钙离子的结合能力减弱。对OsGAP1 C2结构域阳离子结合区域结合金属离子能力的研究,有助于加深对钙信号调控蛋白质的认识,为其在农业生产中的应用提供理论依据。 展开更多

关键词 C2结构域蛋白质 水稻G蛋白促进蛋白1 阳离子结合区域 天冬氨酸 点突变

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His-tag的人胞浆磷脂酶A_2的C2结构域的表达、纯化及性质

14

作者 谭波 张文河 张洪杰 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期502-506,共5页

带有His tag的人胞浆磷脂酶A2 的C2结构域高效表达 ,用内源荧光的变化测定了其稳定性和其与钙离子结合的结合常数 .结果表明 ,带有His tag的C2结构域仍可有效用于研究其折叠及其与钙离子的协同性结合 ,温度从 2 2℃升高到 35℃时 ,C2结... 带有His tag的人胞浆磷脂酶A2 的C2结构域高效表达 ,用内源荧光的变化测定了其稳定性和其与钙离子结合的结合常数 .结果表明 ,带有His tag的C2结构域仍可有效用于研究其折叠及其与钙离子的协同性结合 ,温度从 2 2℃升高到 35℃时 ,C2结构域和钙离子结合的协同性程度显著增强 . 展开更多

关键词 C2结构域 人胞浆磷脂酶A2 去折叠 钙离子结合 协同性

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内含子编码蛋白Mg2+结合位点功能分析及验证 被引量：3

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作者 崔古贞 陈相好 +3 位作者 洪伟 张峥嵘 綦廷娜 陈峥宏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期165-172,共8页

旨为筛选并构建II型内含子编码蛋白Mg2+结合位点突变体,验证该位点突变对II型内含子“归巢”效率的影响。利用生物信息学技术筛选关键位点,利用定点突变技术构建突变体,利用Targetron及蓝白斑计数法验证其“归巢”效率。结果显示,筛选到... 旨为筛选并构建II型内含子编码蛋白Mg2+结合位点突变体,验证该位点突变对II型内含子“归巢”效率的影响。利用生物信息学技术筛选关键位点,利用定点突变技术构建突变体,利用Targetron及蓝白斑计数法验证其“归巢”效率。结果显示,筛选到D308和D309两个位点是II型内含子编码蛋白Mg2+结合的核心催化位点,并成功构建该位点的三种突变体,包括两个单点突变体(D308A和D309A)和一个双点突变体(D308A/D309A),大肠杆菌体内实验结果表明,三种突变体均完全失活了II型内含子的“归巢”功能。证实了II型内含子编码蛋白Mg2+结合位点是其发挥功能的核心催化位点。 展开更多

关键词 Ⅱ型内含子 内含子编码蛋白 Mg2+结合位点 Targetron 反转录结构域

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电针对急性心肌梗死小鼠心肌炎症和嘌呤能2X7受体信号通路的影响

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作者 钱丹颖 闫煜杭 +3 位作者 刘肖儿 鲁晓涵 白桦 卢圣锋 《世界中医药》 北大核心 2025年第11期1970-1975,共6页

目的:观察电针内关穴对急性心肌梗死(AMI)小鼠心肌炎症以及嘌呤能2X7受体/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(P2X7R/NLRP3)信号通路的影响,探讨电针改善心肌梗死的潜在机制。方法:将成年的C57BL/6J小鼠分为假手术组、模型组以及电针组... 目的:观察电针内关穴对急性心肌梗死(AMI)小鼠心肌炎症以及嘌呤能2X7受体/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(P2X7R/NLRP3)信号通路的影响,探讨电针改善心肌梗死的潜在机制。方法:将成年的C57BL/6J小鼠分为假手术组、模型组以及电针组。通过冠状动脉左前降支结扎法建立AMI模型。造模后30 min进行1次双侧内关穴电针干预,在第2、3天同一时间进行1次干预,共3次。干预结束后,采用心电图和酶联免疫吸附试验(ELISA)评估各组小鼠心肌损伤程度;超声心动图检测各组小鼠左心室功能;苏木精-伊红(HE)染色和ELISA评估各组小鼠心肌炎症水平;蛋白质印迹法(WB)检测各组小鼠心脏P2X7R/NLRP3信号通路的相对表达。结果:电针显著改善AMI小鼠的病理性Q波,降低心肌肌钙蛋白T(cTnT)水平,提高左心室射血分数(EF)和短轴收缩率(FS),减少心肌组织中免疫细胞浸润,降低白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)水平,并降低P2X7R、NLRP3蛋白的相对表达。结论:电针内关穴可以减轻AMI小鼠的心肌炎症反应并改善心功能,该效应可能是通过抑制P2X7R/NLRP3信号通路实现的。 展开更多

关键词 急性心肌梗死 心肌炎症反应 电针 内关穴 嘌呤能2X7受体 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 白细胞介素-1Β

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烟草丝束蛋白ABD2与微丝的体内体外相互作用

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作者 梁蒙 韩利波 +2 位作者 孙海涛 黄璐 陈志玲 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期894-898,共5页

微丝骨架在细胞的生命活动中具有重要的功能,而其动态的解聚聚合特性是其实现功能的前提.丝束蛋白(fimbrin/plastin)做为微丝结合蛋白质,是微丝骨架的重要调控因子之一,含有2个肌动蛋白结合结构域,目前对其结合微丝的机制并不清楚.本文... 微丝骨架在细胞的生命活动中具有重要的功能,而其动态的解聚聚合特性是其实现功能的前提.丝束蛋白(fimbrin/plastin)做为微丝结合蛋白质,是微丝骨架的重要调控因子之一,含有2个肌动蛋白结合结构域,目前对其结合微丝的机制并不清楚.本文以烟草丝束蛋白的肌动蛋白结合结构域2(NtFAbd2)为研究对象,通过原核细胞表达纯化NtFAbd2,利用体外沉淀法分析发现,NtFAbd2能够与微丝结合;利用激光共聚焦扫描显微镜分析发现,在烟草BY-2悬浮细胞内,NtAbd2-GFP与微丝共分布,这些结果为深入分析植物丝束蛋白的作用机制提供了新的数据. 展开更多

关键词 丝束蛋白 肌动蛋白结合结构域2 微丝 烟草BY-2悬浮细胞

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新型冠状病毒刺突蛋白及其受体的结构与功能 被引量：8

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作者 江明金 温金华 +3 位作者 潘德城 周健 吕燕妮 魏筱华 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期1497-1501,共5页

新型冠状病毒肺炎是一种由新型冠状病毒感染引发的急性传染病,已进入全球大流行状态。刺突蛋白(spike protein,S蛋白)是新型冠状病毒感染细胞的关键蛋白,在病毒的宿主嗜性和毒力等方面发挥重要作用。S蛋白三聚体结构自发呈现封闭和开放... 新型冠状病毒肺炎是一种由新型冠状病毒感染引发的急性传染病,已进入全球大流行状态。刺突蛋白(spike protein,S蛋白)是新型冠状病毒感染细胞的关键蛋白,在病毒的宿主嗜性和毒力等方面发挥重要作用。S蛋白三聚体结构自发呈现封闭和开放的构象状态对于受体的结合及膜融合构象变化的启动至关重要,其独特的弗林蛋白酶识别位点可能是导致高传染性的重要因素。因此,研究新型冠状病毒S蛋白及其受体的结构与功能,对进一步揭示新型冠状病毒入侵机制及相关靶向药物研发具有重要意义。 展开更多

关键词 新型冠状病毒 S蛋白 受体 血管紧张素转化酶2 受体结合结构域-血管紧张素转化酶2复合物 结构 功能 入胞途径

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基于NOD2介导的AMPK/mTOR信号通路探讨宫颈癌细胞恶性行为的机制

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作者 杜瑞亭 伍东月 +1 位作者 郭清民 靳冬梅 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第2期316-324,共9页

目的 基于核苷酸结合寡聚化结构域受体2(NOD2)介导的AMP活化蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路探讨宫颈癌(CC)细胞恶性行为的机制。方法 生物信息学分析确定NOD2在CC组织中的表达。将靶向NOD2(shNOD2)、shRNAs阴性对照(shNC... 目的 基于核苷酸结合寡聚化结构域受体2(NOD2)介导的AMP活化蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路探讨宫颈癌(CC)细胞恶性行为的机制。方法 生物信息学分析确定NOD2在CC组织中的表达。将靶向NOD2(shNOD2)、shRNAs阴性对照(shNC)以及NOD2过表达(NOD2)质粒和载体(Vec)转染CC细胞。通过CCK-8测定、集落形成和Transwell细胞侵袭测定来确定NOD2对CC细胞生长的影响。通过高通量RNA测序(RNA-Seq)进行转录组分析。Western blot试验检测细胞系中NOD2、AMPK/mTOR信号通路和自噬蛋白的表达。24只雌性BALB/c裸鼠随机分为4组,每组6只:载体组(Vec组)、NOD2过表达组(NOD2组)、shNC组和shNOD2组。构建小鼠远处转移模型,监测肺转移的荧光强度,计数肺转移结节的数量。结果 在线数据库分析显示,NOD2在CC组织中表达明显高于正常组织,并且不同分期的CC中NOD2的mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。此外,NOD2的高表达与较差的总生存期和无病生存期相关(P<0.05)。NOD2过表达对CC细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭具有促进作用,而NOD2敲低则相反。与体外结果一致,在转移的小鼠尾静脉注射模型中,NOD2组CC细胞的肺定殖、肺转移灶较Vec组增加(P<0.05),而shNOD2组CC细胞的肺定殖、肺转移灶较shNC组减少(P<0.05)。RNA-Seq结果显示NOD2表达与AMPK信号激活、mTOR信号抑制、自噬调节途径激活和自噬体形成显著相关。与shNC组相比,shNOD2组磷酸化AMPK、LC3蛋白表达水平减少(P<0.05),磷酸化mTOR、p62蛋白表达水平增加(P<0.05);与Vec组相比,NOD2组LC3、AMPK蛋白表达水平增加(P<0.05),磷酸化mTOR、p62蛋白表达水平减少(P<0.05)。与shNC组相比,shNOD2组GFP-mRFP-LC3的点积累减少(P<0.05);与Vec组相比,GFP-mRFP-LC3的点积累增加(P<0.05)。结论 NOD2可能通过AMPK/mTOR信号促进CC增殖、迁移和侵袭,其作用机制部分涉及自噬激活。 展开更多

关键词 核苷酸结合寡聚化结构域受体2 AMP活化蛋白激酶 雷帕霉素靶蛋白 宫颈癌细胞 自噬

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浸润性乳腺癌组织肝配蛋白A型受体2(EphA2)高表达且与细胞焦亡负相关 被引量：2

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作者 刘昆 吴立刚 +6 位作者 揭育祯 纳莉 张晴 田荣 李桂忠 卢冠军 马胜超 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期981-986,共6页

目的探讨肝配蛋白A型受体2(EphA2)参与浸润性乳腺癌中细胞焦亡(pyroptosis)的机制。方法采用Western blot法检验乳腺癌患者癌组织、癌旁组织和正常乳腺组织EphA2、含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶... 目的探讨肝配蛋白A型受体2(EphA2)参与浸润性乳腺癌中细胞焦亡(pyroptosis)的机制。方法采用Western blot法检验乳腺癌患者癌组织、癌旁组织和正常乳腺组织EphA2、含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、白细胞介素1β(IL-1β)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的蛋白表达水平;采用免疫荧光技术检测45例乳腺癌患者癌组织和癌旁组织中EphA2表达情况;用Pearson相关系数对患者癌组织EphA2的蛋白表达与细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β进行相关性分析。结果与正常乳腺组织及癌旁组织相比,乳腺癌组中NLRP3、caspase-1、IL-1β和ICAM-1的蛋白表达水平明显降低,EphA2蛋白表达明显升高;EphA2水平与细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β均呈负相关性。结论乳腺癌组织EphA2高表达,且与细胞焦亡呈负相关。 展开更多

关键词 乳腺癌 细胞焦亡(pyroptosis) 炎性体 含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3) 肝配蛋白A型受体2(EphA2)

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