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结核分枝杆菌聚合酶螺旋反应检测方法的建立及效果评价 被引量：2
1
作者 马晓光 石洁 +6 位作者 徐行勇 朱岩昆 王少华 郑丹薇 孙国清 孙定勇 苏茹月 《中国防痨杂志》 CAS CSCD 2020年第10期1121-1127,共7页
目的建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果。方法针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测。提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入Bst DNA聚合酶的RM2X反应液中,在荧光定量PCR仪... 目的建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果。方法针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测。提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入Bst DNA聚合酶的RM2X反应液中,在荧光定量PCR仪上于63℃反应45 min,通过荧光信号进行检测。通过对引物序列进行优化,筛选出最佳引物序列,并对其检测特异性和最低检出限进行评估。于2019年5—8月间从郑州市第六人民医院连续收集200例肺结核患者痰液样本(同一患者收集3份),对痰标本进行痰涂片、固体痰培养和PSR检测。以痰培养结果为参照,评价PSR对结核病患者的检测效能。结果通过引物序列优化,筛选出一套对结核分枝杆菌检测的PSR引物,使用该引物进行PSR的最低检出限可达到10~3菌落形成单位(CFU)/ml;检测特异性实验表明该方法与15株非结核分枝杆菌无交叉反应。200例肺结核患者中,痰涂片检测阳性48例,阳性检出率为24.0%(48/200);痰培养检测阳性83例,阳性检出率为41.5%(83/200);PSR方法检测阳性87例,阳性检出率为43.5%(87/200)。以痰培养结果为标准,PSR检测结核病的敏感度和特异度分别为96.4%(80/83)、94.0%(110/117),阳性预测值为92.0%(80/87),阴性预测值为97.3%(110/113),与痰培养检测方法基本一致(Kappa值为0.898)。结论PSR检测适用于结核分枝杆菌的快速筛查。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 痰 聚合酶螺旋反应 诊断 实验室技术和方法
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猫细小病毒聚合酶螺旋反应检测方法的建立及应用 被引量：3
2
作者 刘金波 魏衍全 +3 位作者 薛惠文 邢小勇 孙鹏 张勇 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1068-1073,共6页
为建立一种快速、简便检测猫细小病毒(FPV)的聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增方法,本研究参考GenBank中登录的FPV基因序列(MG924893.1),以其保守基因NS1为靶基因设计并合成分别用于普通PCR和PSR方法的2对特异性引物,以及一对加速引物,经反... 为建立一种快速、简便检测猫细小病毒(FPV)的聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增方法,本研究参考GenBank中登录的FPV基因序列(MG924893.1),以其保守基因NS1为靶基因设计并合成分别用于普通PCR和PSR方法的2对特异性引物,以及一对加速引物,经反应条件优化,建立了检测FPV的PSR方法。优化结果显示,体系内包含6 mmol/LMgSO_(4)、0.8 mol/L甜菜碱,67℃恒温反应45 min结束反应,然后加入终浓度为20×SYBRGreenI染料,肉眼在可见光下观察颜色变化即可判定检测结果。利用该方法检测猫冠状病毒(FCoV)、猫诺如病毒(FNoV)cDNA和FPV,结果显示除了FPV外,与其他病原均无交叉反应,特异性强;将提取的FPV基因组DNA 10倍倍比稀释,利用建立的PSR方法进行敏感性试验,结果显示,该方法对FPV基因组的最低检测限为6.75×10^(3)拷贝/μL,比普通PCR方法检测下限低10倍,敏感性可接受;利用本方法进行组内组间重复试验,结果显示组内与组间重复性试验检测结果一致,均为阳性,重复性好。利用建立的PSR方法对110份疑似感染FPV的猫粪便样品进行检测,结果显示PSR方法与常规PCR方法的检测结果基本一致,二者的总符合率为98.18%,表明本研究建立的PSR方法可用于检测临床样品。本研究首次建立的FPVPSR方法仅需2对引物在67℃下完成,无需复杂的变温仪器,反应后加入染料肉眼即可判定结果,整个过程在45 min内结束,设计引物简单,操作步骤少,用时较短,适合市县级宠物医院FPV感染的快速诊断。 展开更多
关键词 猫细小病毒 聚合酶螺旋反应 恒温扩增 快速诊断
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聚合酶螺旋反应(PSR)在病原微生物快速检测中的研究进展 被引量：3
3
作者 焉鑫 刘蒙达 +3 位作者 张力 李岩 孙淑芳 樊晓旭 《中国动物检疫》 CAS 2022年第9期105-109,114,共6页
聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)是基于环介导等温扩增技术(LAMP)和聚合酶链式反应(PCR)建立的一种新型恒温体外核酸扩增技术,其利用混合引物的设计思路和BstDNA聚合酶的链置换活性,实现了在体外等温条件下的核酸扩增,... 聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)是基于环介导等温扩增技术(LAMP)和聚合酶链式反应(PCR)建立的一种新型恒温体外核酸扩增技术,其利用混合引物的设计思路和BstDNA聚合酶的链置换活性,实现了在体外等温条件下的核酸扩增,表现出灵敏性及特异性较PCR显著提高,引物设计较LAMP简单等优点,在保证检测灵敏、特异的同时,耗时相对较短,且操作简便,对仪器设备要求低,可肉眼直观判定结果,特别适用于公共卫生、动物健康、食品安全和生物防御等领域的快速诊断。本文介绍了PSR技术的原理及其在病原微生物检测方面的应用,以期为相关领域的检测技术研究提供参考。 展开更多
关键词 聚合酶螺旋反应 病原微生物 快速检测
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猪源沙门氏菌聚合酶螺旋反应方法的建立与应用 被引量：2
4
作者 胡瑞鸿 从秋实 李艳飞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1227-1232,共6页
为建立一种快速、高效地检测猪源沙门氏菌的聚合酶螺旋反应(PSR)方法,本研究针对猪源沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因设计3套特异性扩增引物,通过优化孵育温度、dNTPs和Mg2+浓度、Bst聚合酶浓度和反应时间初步建立了猪源沙门氏菌PSR方法。... 为建立一种快速、高效地检测猪源沙门氏菌的聚合酶螺旋反应(PSR)方法,本研究针对猪源沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因设计3套特异性扩增引物,通过优化孵育温度、dNTPs和Mg2+浓度、Bst聚合酶浓度和反应时间初步建立了猪源沙门氏菌PSR方法。结果显示:该方法可以特异性扩增2株猪沙门氏菌,而对其它12株病原菌无扩增,特异性较强;以沙门氏菌标准株CMCC 50094为模板,并经一系列的稀释,对PSR、LAMP和qRCR方法的敏感性进行检测和比较,结果显示PSR方法和qPCR方法对菌液的最小检出量均为5×101 cfu/mL,敏感性为LAMP方法的10倍,敏感性较高;临床样品检测结果显示,经PSR方法在132份仔猪腹泻样本中共检测出猪源沙门氏菌阳性样品18份,与常规培养方法鉴定结果一致,检出率均为13.64%。本研究建立的PSR法为猪源沙门氏菌的快速检测提供了一种可行方法。 展开更多
关键词 沙门氏菌 聚合酶螺旋反应 等温扩增技术 临床检测
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产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌聚合酶交联螺旋反应快速检测方法的建立
5
作者 王璊 孟祥宇 +1 位作者 程静 庞梦婷 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期716-722,共7页
为建立一种快速检测产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌(emetic Bacillus cereus)的新型、敏感且可视化的聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)方法,本实验根据该菌结构性合成酶基因cesB设计特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,初步建立了检测emetic ... 为建立一种快速检测产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌(emetic Bacillus cereus)的新型、敏感且可视化的聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)方法,本实验根据该菌结构性合成酶基因cesB设计特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,初步建立了检测emetic B.cereus的PCLSR方法。结果显示,PCLSR方法在64℃反应50 min、dNTP浓度为0.3 mol/L、Bst聚合酶浓度为8 U/管时获得最佳扩增效果。以5株emetic B.cereus和12株临床常见菌的DNA作为模板,经本研究建立的该PCLSR方法检测,结果显示,PCLSR法能有效检测5株emetic B.cereus,而对其他相关细菌的检测结果均为阴性,表明该方法特异性较强。将emetic B.cereus 10倍倍比稀释(1×10^(7)cfu/mL~1×10^(0)cfu/mL)后采用该PCLSR法、LAMP法和荧光定量PCR(qPCR)方法检测,结果显示,PCLSR法和qPCR方法的检测限均达1×10^(2)cfu/mL,LAMP法的检测限为1×10^(3)cfu/mL,表明本研究建立的PCLSR法的敏感性较高。采用“国标”中的细菌培养法、PCLSR法、qPCR法及环介导等温扩增(LAMP)法同时检测50份人工污染emetic B.cereus的饲料及灭菌牛奶样品,结果显示,PCLSR法与qPCR法检测emetic B.cereus的阳性率为30%(15/50),阴性率为70%(35/50),二者的符合率均达100%;细菌培养法和LAMP法检测emetic B.cereus的阳性率为24%(12/50),阴性率为76%(38/50),二者与PCLSR法的总符合率均为80%。综上所述,本研究建立的PCLSR法具有较强的特异性、较高的敏感性,且不需要复杂设备和昂贵试剂即可在短时间内完成对emetic B.cereus的检测,该方法的建立为基层部门对emetic B.cereus的检测及该菌的流行病学调查提供了新的技术手段。 展开更多
关键词 蜡样芽孢杆菌 聚合酶交联螺旋反应 检测
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基于可视化聚合酶交联螺旋反应快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立 被引量：3
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作者 冯瑜菲 袁超文 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期737-742,共6页
为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)的新型可视化方法,本研究以S.aureus耐热核酸酶基因(nuc)为靶序列设计特异性引物,对其反应条件进行优化,建立聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)可视化检测方法,结果显示,PCLSR法在反应温度62℃,孵... 为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)的新型可视化方法,本研究以S.aureus耐热核酸酶基因(nuc)为靶序列设计特异性引物,对其反应条件进行优化,建立聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)可视化检测方法,结果显示,PCLSR法在反应温度62℃,孵育时间60 min、dNTPs浓度为3.0 mmol/L、Bst-DNA聚合酶浓度为10 U/管时扩增效果最佳。提取14株金黄色葡萄球菌和9株非金黄色葡萄球菌基因组为模板,利用该方法进行特异性试验,结果显示,PCLSR法能有效检测到14株S.aureus,而对其他9株非S.aureus检测结果均为阴性,特异性良好。10倍倍比稀释S.aureus菌液(1×10^(7)cfu/m L~1×10^(0)cfu/m L)后提取基因组作为模板,进行敏感性试验,结果显示,PCLSR法与荧光定量PCR法具有相同的敏感性,检测下限均达到1×10^(2)cfu/m L,而环介导等温扩增(LAMP)敏感性为1×10^(3)cfu/m L,可见该PCLSR敏感性较高。利用该PCLSR、LAMP、细菌培养法和荧光定量PCR法同时检测46份人工污染的生猪肉、灭菌纯牛奶样品中金黄色葡萄球菌,以评价该方法的检测性能,结果显示,PCLSR与荧光定量PCR检测结果与样品符合率为100%,而细菌培养法和LAMP法与样品的符合率仅均为91.67%,可见该PCLSR可以用于临床样品的检测。本研究为动物疾病预防和食品卫生检验等领域快速检测S.aureus提供了新型检测方法。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 聚合酶交联螺旋反应 可视化 快速检测
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米面制品中微生物的活但不可培养状态检测研究进展 被引量：6
7
作者 徐振波 林欣 +4 位作者 徐行勇 李琳 陈玲 李晓玺 苏健裕 《粮油食品科技》 2020年第2期30-35,共6页
米面制品是我国主要的食品,含有丰富的营养物质与充足的水分,适合微生物生长繁殖。腐败微生物会引起食品货架期缩短或在保质期内腐败变质,而致病微生物的存在则可引起食物中毒事件。近年来对食品微生物的快速检测技术主要包括传统法与... 米面制品是我国主要的食品,含有丰富的营养物质与充足的水分,适合微生物生长繁殖。腐败微生物会引起食品货架期缩短或在保质期内腐败变质,而致病微生物的存在则可引起食物中毒事件。近年来对食品微生物的快速检测技术主要包括传统法与核酸扩增法,其中聚合酶螺旋反应(PSR)技术具有较高的灵敏度、特异性与重现性,具有较大应用前景。此外,活但不可培养状态(VBNC)因具有不可培养特性,会造成微生物检测"金标准"培养法获得"假阴性"结果,是食品微生物安全中的重要威胁。通过研究分析污染米面制品的主要微生物和相应快速检测方法,以及活但不可培养状态的生物学特性和检测方法,为进一步实现对米面制品中微生物安全控制提供重要依据。 展开更多
关键词 米面 微生物致病菌 聚合酶螺旋反应 核酸检测 活但不可培养状态
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