DNA shuffling是蛋白质定向进化的一种常用策略,其优点是可以快速积累多突变效果,但同时由于突变数较多,其中真正发挥作用的突变及其结构基础往往不清楚。β-葡萄糖苷酶是纤维素高效降解的限速酶,良好的热稳定性是影响其实际催化效率的...DNA shuffling是蛋白质定向进化的一种常用策略,其优点是可以快速积累多突变效果,但同时由于突变数较多,其中真正发挥作用的突变及其结构基础往往不清楚。β-葡萄糖苷酶是纤维素高效降解的限速酶,良好的热稳定性是影响其实际催化效率的关键因素。该研究以DNA shuffling策略产生的热稳定性β-葡萄糖苷酶突变体Bgl3-6511(含60个突变,T_(50)值比野生型提高4.6℃)为研究对象,通过序列比对、定点突变和热稳定性测定,对其中的有益突变进行鉴定。结果显示,6个单点突变Y50F、R52H、R56K、V65I、T67A和P143A分别将该酶的T_(50)值提高2.9、4.2、1.5、2.8、3.2、1.2℃。同时,鉴定到5个有害突变将该酶的T_(50)值降低1.0~3.4℃。将获得单点有益突变进行组合,获得T_(50)值提高13.4℃的M6(Y50F/R52H/R56K/V65I/T67A/P143A),说明DNA shuffling策略积累的有害突变确实损害了性能优化。结构分析和分子动力学模拟显示,有益突变主要是通过增强分子内氢键、π-π键和稳定二级结构发挥作用。该研究对Bgl3-6511中的单点有益突变进行鉴定,对其结构基础进行了分析,并获得了热稳定性更加优良的突变酶,相关信息可为其他酶的分子改造提供有益借鉴。展开更多
