绿色荧光蛋白转基因胚胎大鼠神经干细胞生物学特性研究 被引量：6

1

作者 刘勇 冯东福 +1 位作者 陈二涛 汪洋 《实用医学杂志》 CAS 2008年第5期709-712,共4页

目的:体外分离、培养、鉴定绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因胚胎大鼠神经干细胞,研究其体外活性与生物学性状,为在体分化示踪研究奠定基础。方法:采用机械分离,无血清传代培养法从GFP胚胎大鼠海马获得神经干细胞,免... 目的:体外分离、培养、鉴定绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因胚胎大鼠神经干细胞,研究其体外活性与生物学性状,为在体分化示踪研究奠定基础。方法:采用机械分离,无血清传代培养法从GFP胚胎大鼠海马获得神经干细胞,免疫荧光和免疫细胞化学法染色进行体外神经干细胞性质和分化活性鉴定,并利用流式细胞计数法行纯度检测。结果:成功从GFP胎鼠海马获得神经干细胞,体外生长情况与活性良好,能分化成神经元和胶质细胞;体外连续传代3次后绝大部分细胞Nestin表达阳性,且分化后细胞的GFP表达不受影响。结论:GFP胚胎大鼠来源神经干细胞具有普通胎鼠神经干细胞相同的自我更新和多向分化潜能,且能稳定表达GFP,因此它可以成为示踪神经干细胞研究的有效工具细胞。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白质类转 基因 胚胎 神经干细胞 生物学特性

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含绿色荧光蛋白基因的子宫内膜异位症体外模型的建立 被引量：1

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作者 刘斌 王宁宁 +6 位作者 洪珊珊 冯丽萍 谢洪哲 黄建昭 王子莲 梅卓贤 庄广伦 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1423-1425,共3页

目的由腺病毒介导绿色荧光蛋白基因转染子宫内膜细胞,构建子宫内膜异位症体外模型。方法取5例正常子宫内膜组织,分离子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,进行形态学观察和免疫荧光鉴定。用携带有绿色荧光蛋白基因的腺病毒转染细胞,比较转染... 目的由腺病毒介导绿色荧光蛋白基因转染子宫内膜细胞,构建子宫内膜异位症体外模型。方法取5例正常子宫内膜组织,分离子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,进行形态学观察和免疫荧光鉴定。用携带有绿色荧光蛋白基因的腺病毒转染细胞,比较转染后12、18、36、42h细胞的绿色荧光蛋白表达阳性率和凋亡率的差异。结果分离培养获得高纯度的子宫内膜腺上皮细胞(90%)和基质细胞(接近100%)。两种细胞均表达绿色荧光;与腺上皮细胞比较,基质细胞转染率明显增高(F=8.362,P=0.020),凋亡率明显降低(F=46.119,P<0.001);转染对细胞的凋亡率无明显影响(F=4.208,P=0.057)。结论利用腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因载体转染子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,可获得相对稳定的体外荧光子宫内膜异位症模型。 展开更多

关键词 子宫内膜异位症 绿色荧光蛋白质类 腺病毒科

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慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠角膜的效率及其毒性研究 被引量：3

3

作者 刘立 赵敏 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期307-310,共4页

目的观察慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(LV-EGFP)经不同浓度和途径转染大鼠角膜的转染效率及毒性,探讨慢病毒转染角膜的最佳途径。方法 25只SD大鼠,随机分为5组。A组为感染复数(MOI)=5点眼组,B组为MOI=5结膜下注射组,C组为MOI=10... 目的观察慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(LV-EGFP)经不同浓度和途径转染大鼠角膜的转染效率及毒性,探讨慢病毒转染角膜的最佳途径。方法 25只SD大鼠,随机分为5组。A组为感染复数(MOI)=5点眼组,B组为MOI=5结膜下注射组,C组为MOI=10点眼组,D组为MOI=10结膜下注射组,E组为MOI=10离体转染组,各组予以相应浓度LV-EGFP。7d后取转染后角膜于荧光显微镜下观察荧光分布,并分析荧光强度;HE染色观察转染后角膜细胞病理改变。结果荧光显微镜观察显示,相同MOI组之间比较,点眼方式的角膜荧光分布较结膜下注射方式均匀。各组相对荧光强度值分别为:A组0.1803±0.0440,B组0.1061±0.0434,C组0.2369±0.0157,D组0.2002±0.0307,E组0.2434±0.0173,点眼方式的角膜荧光强度高于结膜下注射方式(P<0.05),且MOI增加时EGFP表达增强(P<0.05)。E组荧光强度明显高于A、B、D组(P<0.05),但与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色显示各组角膜细胞形态正常,未见明显凋亡细胞。离体转染角膜经过7d培养液转染后,角膜内皮细胞生长良好,未出现皱缩、变形及缺失等病理改变。结论 LV-EGFP可在较低MOI下有效转染大鼠角膜,且持续转染的安全性良好;点眼方式的转染效率高于比结膜下注射,提高MOI能提高角膜转染的效率。 展开更多

关键词 慢病毒 角膜 绿色荧光蛋白质类

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表达载脂蛋白E-增强型绿色荧光蛋白的细胞系支持感染性丙型肝炎病毒的组装

4

作者 杨再立 赵凡凡 +1 位作者 王刚 龙钢 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1470-1474,共5页

目的探讨表达载脂蛋白E-增强型绿色荧光蛋白(apolipoprotein E-enhanced green fluorescence protein,apoEEGFP)的细胞系是否支持感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的组装。方法利用shRNA基因沉默技术建立apoE稳定下调的Huh7.5.1细胞系,然后... 目的探讨表达载脂蛋白E-增强型绿色荧光蛋白(apolipoprotein E-enhanced green fluorescence protein,apoEEGFP)的细胞系是否支持感染性丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的组装。方法利用shRNA基因沉默技术建立apoE稳定下调的Huh7.5.1细胞系,然后通过基因工程技术在该细胞系中建立稳定表达apoE-EGFP融合蛋白的细胞系。将HCV RNA转染进入野生型细胞(Huh7.5.1细胞)、对照组sh-NT细胞(转导非靶向野生型细胞基因的shRNA质粒的细胞)、apoE下调的Huh7.5.1细胞(sh-apoE细胞)以及表达apoE-EGFP融合蛋白的sh-apoE细胞(apoE-EGFP细胞)中,收集病毒液;通过半数组织培养感染剂量(TCID50)方法检测释放到Huh7.5.1、sh-NT、sh-apoE和apoE-EGFP细胞培养上清液中的HCV的滴度。利用免疫荧光技术检测apoE与HCV的结构蛋白E2的相互作用,利用蛋白质印迹法检测用具有特异亲和性FLAG-gel纯化的HCV颗粒表面的apoE-EGFP的表达。结果 apoE-EGFP融合蛋白在apoE-EGFP细胞系中高效表达;apoE-EGFP细胞来源的HCV的感染性与Huh7.5.1、sh-NT细胞相比差异无统计意义;在apoE-EGFP细胞系中,apoE-EGFP融合蛋白与HCV结构蛋白E2存在共定位,并且可以在HCV颗粒表面上检测到apoE-EGFP融合蛋白。结论 apoE-EGFP融合蛋白是HCV颗粒的组分,apoE-EGFP细胞系支持感染性HCV颗粒的组装。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 载脂蛋白E 绿色荧光蛋白质类 细胞系

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携带增强绿色荧光蛋白基因的人14-3-3σ真核表达载体的构建及其在转染乳腺癌MCF-7细胞的表达

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作者 郝苗 齐凤杰 马玲 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期1342-1345,共4页

目的构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人14-3-3σ真核表达载体pEGFP-GV142-SFN并转染至人乳腺癌MCF-7细胞,鉴定所表达的蛋白活性。方法通过逆转录-聚合酶链反应从胎脑组织中获得编码14-3-3σ的全长cDNA,定向克隆至真核表达载体GV142中,... 目的构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人14-3-3σ真核表达载体pEGFP-GV142-SFN并转染至人乳腺癌MCF-7细胞,鉴定所表达的蛋白活性。方法通过逆转录-聚合酶链反应从胎脑组织中获得编码14-3-3σ的全长cDNA,定向克隆至真核表达载体GV142中,鉴定正确后与带有增强绿色荧光蛋白的pEGFP-N1-SFN酶切后连接,重组携带14-3-3σ的表达载体pEGFP-GV142-SFN。将pEGFP-GV142-SFN质粒转染至乳腺癌MCF-7细胞,观察荧光蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切分析、聚合酶链反应和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察发现:转染24 h后,乳腺癌MCF-7细胞内可见增强绿色荧光蛋白表达,48 h表达最稳定,72 h可见荧光蛋白淬灭,细胞形态逐渐消失。结论成功构建了14-3-3σ真核表达载体pEGFP-GV142-SFN并转染至乳腺癌MCF-7细胞,观察和检测到绿色荧光蛋白表达。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤 基因 绿色荧光蛋白质类

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慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定 被引量：3

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作者 李秀梅 尤玉琴 +5 位作者 刘光泽 黎经纬 陈媚娟 陈文吟 周军辉 孔祥平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期964-966,共3页

目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的... 目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度。采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠。出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况。结果病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光。包装出的慢病毒滴度为106U/ml,经浓缩后可达108U/ml。PCR检测显示,F0代小鼠GFP PCR阳性率为70.27%(26/37)。荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当。F0代、F1代中GFP均呈广泛表达。结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台。 展开更多

关键词 慢病毒属 绿色荧光蛋白质类 小鼠 转基因 转染

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HLA—A0201与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在K562细胞的表达和定位 被引量：3

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作者 何贤辉 徐丽慧 +2 位作者 刘毅 蔡小嫦 曾耀英 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期705-710,共6页

目的 :构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)与HLA -A 0 2 0 1(A 0 2 0 1)融合蛋白哺乳动物细胞表达载体 ,分析其在K5 6 2细胞中的表达和亚细胞定位。方法 :以RT -PCR方法克隆A 0 2 0 1cDNA ,构建A 0 2 0 1-EGFP融合蛋白表达载体 ,转染K5 6 2... 目的 :构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)与HLA -A 0 2 0 1(A 0 2 0 1)融合蛋白哺乳动物细胞表达载体 ,分析其在K5 6 2细胞中的表达和亚细胞定位。方法 :以RT -PCR方法克隆A 0 2 0 1cDNA ,构建A 0 2 0 1-EGFP融合蛋白表达载体 ,转染K5 6 2细胞 ,以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果 :从两个HLA -A2阳性供者外周血细胞中克隆到A 0 2 0 1cDNA编码区全长序列。通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并删除终止密码 ,成功构建A 0 2 0 1-EGFP融合蛋白表达载体。以该质粒转染K5 6 2细胞 ,5h后A 0 2 0 1和EGFP的表达百分率分别为 2 5 12± 2 2 6、2 7 37± 3 5 9,2 4h后表达水平无明显提高。表达的融合蛋白主要分布于细胞膜上 ,胞内分布较少。相反 ,转染空载体的细胞不表达A 0 2 0 1分子 ,仅表达EGFP ,且其在细胞内呈弥散样分布。结论 :成功构建A 0 2 0 1-EGFP融合蛋白表达载体 ,并在K5 6 2细胞中得到表达 ,表达产物主要分布于细胞膜表面 ,提示表达该融合蛋白的K5 6 2细胞是潜在的人工抗原提呈细胞。 展开更多

关键词 HKA—A2抗原 绿色荧光蛋白质类 融合蛋白质类 显微镜检查 共焦

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荧光标记人卵巢癌细胞株的建立

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作者 张小梅 方廖琼 王智彪 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期950-953,共4页

目的建立稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人卵巢癌细胞株。方法采用基因转染的方法,将EGFP基因导入人卵巢癌细胞HO8910PM中,通过G418筛选、亚克隆扩增获得稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-HO8910PM细胞株,并用流式细胞术检测所获细胞... 目的建立稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人卵巢癌细胞株。方法采用基因转染的方法,将EGFP基因导入人卵巢癌细胞HO8910PM中,通过G418筛选、亚克隆扩增获得稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-HO8910PM细胞株,并用流式细胞术检测所获细胞株的EGFP表达率,通过细胞生长曲线、黏附实验、侵袭迁移实验比较EGFP-HO8910PM细胞和HO8910PM细胞的生物学行为。结果筛选出的EGFP-HO8910PM细胞经流式细胞仪检测EGFP阳性表达率达99%以上,EGFP-HO8910PM细胞和HO8910PM细胞生长、黏附及侵袭迁移能力无统计学差异。结论成功建立了稳定表达EGFP且保持母株细胞特性的人卵巢癌细胞株EGFP-HO8910PM,为人卵巢癌整体活体应用中可视化研究打下基础。 展开更多

关键词 卵巢肿瘤 HO8910PM细胞株 绿色荧光蛋白质类 转染

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水通道蛋白4重组质粒的构建及其在体外对低糖反应的观察

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作者 俞晓燕 邓江山 赵玉武 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2015年第5期700-704,共5页

目的:构建大鼠水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)重组质粒,检测融合蛋白在CTX-TNA2星形胶质细胞上的表达,同时观察低浓度葡萄糖条件下AQP4对细胞的影响。方法:通过RT-PCR方法从大鼠脑部获取AQP4基因,插入p EGFP-C2质粒中得到p EGFP-C2-AQP4-... 目的:构建大鼠水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)重组质粒,检测融合蛋白在CTX-TNA2星形胶质细胞上的表达,同时观察低浓度葡萄糖条件下AQP4对细胞的影响。方法:通过RT-PCR方法从大鼠脑部获取AQP4基因,插入p EGFP-C2质粒中得到p EGFP-C2-AQP4-M23重组质粒,同时转染CTX-TNA2细胞后用不同浓度葡萄糖处理,通过激光共聚焦显微镜检测AQP4在细胞中的表达及低糖条件下对细胞的影响。结果:PCR和酶切鉴定结果显示插入的AQP4基因大小正确,测序结果证实成功构建了p EGFP-C2-AQP4-M23重组质粒;在激光共聚焦显微镜下观察到AQP4主要位于CTX-TNA2细胞膜上;低糖时转染AQP4的星形胶质细胞平均表面积明显高于对照组。结论:本研究成功构建了AQP4重组质粒并在CTX-TNA2细胞上成功表达,同时证实低糖时AQP4参与了星形胶质细胞水肿的形成。 展开更多

关键词 水通道蛋白质4 绿色荧光蛋白质类 转染 细胞水肿

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阿片受体δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达 被引量：1

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作者 胡子有 漆松涛 +2 位作者 张遐 颜晓慧 吴炳义 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1442-1444,共3页

目的构建带FLAG标签的大鼠δ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(δ-FLAG-pIRES2-EGFP),并实现其在CHO细胞中的表达。方法以含大鼠全长δ阿片受体基因的δ-pMD20-T载体为模板,设计引物并行PCR扩增,在δ基因C端引入FLAG标签,AT克隆至pMD20-... 目的构建带FLAG标签的大鼠δ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(δ-FLAG-pIRES2-EGFP),并实现其在CHO细胞中的表达。方法以含大鼠全长δ阿片受体基因的δ-pMD20-T载体为模板,设计引物并行PCR扩增,在δ基因C端引入FLAG标签,AT克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切连接入pIRES2-EGFP中,将获得的δ-FLAG-pIRES2-EGFP载体转染CHO细胞,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹法检测δ-FLAG的表达。结果测序及酶切结果表明获得了带FLAG标签的δ基因,成功构建δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光。应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的基因表达。结论成功构建了δ-FLAG-pIRES2-EGFP表达质粒,并在CHO细胞中实现了高效表达。 展开更多

关键词 受体 阿片样 δ 绿色荧光蛋白质类 CHO细胞

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重组1和2型腺相关病毒载体在小鼠心脏转导研究 被引量：1

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作者 米亚非 李小鹰 +2 位作者 王教辰 付治卿 周声安 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2007年第4期255-257,共3页

目的探讨重组1和2型腺相关病毒(rAAV1和rAAV2)载体向小鼠心脏转导效果。方法14只昆明小鼠应用经腹心包腔内注射术,分别将携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(LUC)报告基因的rAAV1(rAAV1-EGFP组6只,rAAV1-LUC组1只)r、AAV2(rAAV2-EGFP... 目的探讨重组1和2型腺相关病毒(rAAV1和rAAV2)载体向小鼠心脏转导效果。方法14只昆明小鼠应用经腹心包腔内注射术,分别将携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(LUC)报告基因的rAAV1(rAAV1-EGFP组6只,rAAV1-LUC组1只)r、AAV2(rAAV2-EGFP组6只,rAAV2-LUC组1只)分别转导入小鼠的心包腔内,使用共聚焦显微镜观察EGFP在心肌的表达,冷光CCD相机体内监测LUC在心肌表达。结果rAAV1-EGFP组绿色荧光出现于心肌组织全层;rAAV2-EGFP组绿色荧光仅局限于心外膜下少数心肌细胞。rAAV1-EGFP组小鼠心肌细胞的表达范围和强度优于rAAV2-EGFP组。rAAV1-LUC组小鼠心肌组织表达强度、持续表达时间优于rAAV2-LUC组。结论在小鼠心脏中,rAAV1是一种比rAAV2更为有效的转基因载体。 展开更多

关键词 依赖病毒 绿色荧光蛋白质类 荧光素 转染

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EGFP-CD40L融合基因的构建、表达及功能鉴定 被引量：1

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作者 马晶莹 谭晓华 +1 位作者 陈媛媛 邱实 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1261-1266,共6页

目的构建编码增强型绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,EGFP)和人CD40L胞外段(hecdCD40L)组成的融合基因真核表达载体,并探讨表达后的融合蛋白对人树突状细胞(dendritic cells,DCs)表型和功能的影响。方法以RT-PCR方法从健康人外... 目的构建编码增强型绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,EGFP)和人CD40L胞外段(hecdCD40L)组成的融合基因真核表达载体,并探讨表达后的融合蛋白对人树突状细胞(dendritic cells,DCs)表型和功能的影响。方法以RT-PCR方法从健康人外周血单个核细胞中克隆hecdCD40L基因片段。小鼠血管内皮细胞生长因子受体2信号肽序列(SigmKDR)和EGFP与hecdCD40L基因片段融合或不融合,插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1SigmKDR-EGFP(sEGFP)和pcDNA3.1sEGFP-hecdCD40L。用脂质体将表达载体转染至体外培养的COS-7细胞后,G418抗性筛选,流式细胞仪分选并检测EGFP和/或CD40L的表达。Western blot检测融合蛋白在COS-7细胞及其上清中的表达,用镍柱和超滤离心管获取纯化浓缩的sEGFP-hecdCD40L和sEGFP融合蛋白与人DCs共孵育,流式细胞仪和ELISA分析DCs对2种融合蛋白的摄取率、DCs表型变化以及细胞因子IL-12的分泌。结果 pcDNA3.1sEGFP或pcDNA3.1sEGFP-hecdCD40L转染COS-7细胞后,经G418抗性筛选和流式细胞仪分选筛选获得高效表达融合蛋白的单克隆细胞株,EGFP阳性细胞可达95%以上,Westernblot在细胞内和上清中均能检测到融合蛋白。sEGFP或sEGFP-hecdCD40L与DCs共孵育2h,流式细胞仪检测示EGFP阳性率前者为28.6%,后者为56.9%,24h后分析DCs的表型,sEGFP-hecdCD40L融合蛋白增强DCs表面CD80、CD83和HLA-DR分子的表达以及刺激IL-12的分泌,而sEGFP对DCs的表型和IL-12的分泌无明显影响。结论用SigmKDR、EGFP和hecdCD40L构建的融合基因能在真核细胞中表达并能分泌至细胞外,这种分泌型融合蛋白能靶向DCs,诱导DCs的成熟和上调其表面共刺激分子和MHC-II分子的表达,并刺激IL-12分泌。 展开更多

关键词 蛋白分选信号 绿色荧光蛋白质类 CD40配体 树突细胞 白细胞介素12

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外周血间充质干细胞移植防治兔血管成形术后再狭窄的探讨 被引量：1

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作者 郭艳 石蓓 +4 位作者 赵然尊 王正龙 王冬梅 沈长银 喻田 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2009年第12期968-971,共4页

目的探讨外周血间充质干细胞(MSCs)移植对模型兔颈动脉血管成形术后再狭窄的防治作用。方法新西兰大白兔65只,5只作为产生MSCs的种兔,60只随机分为MSCs移植组和对照组,每组30只,术后7、14、28天处死兔,取颈动脉血管标本通过Weiger弹力... 目的探讨外周血间充质干细胞(MSCs)移植对模型兔颈动脉血管成形术后再狭窄的防治作用。方法新西兰大白兔65只,5只作为产生MSCs的种兔,60只随机分为MSCs移植组和对照组,每组30只,术后7、14、28天处死兔,取颈动脉血管标本通过Weiger弹力纤维染色及免疫组织化学染色进行形态学分析、内皮化程度分析、归巢MSCs的鉴定和分化跟踪等。结果 MSCs移植组术后7、14、28天内膜面积、内膜面积/中膜面积及再狭窄率明显低于对照组(P<0.01):内皮化程度分忻显示,MSCs移植组明显优于对照组(P<0.01)。MSCs移植组术后7、14、28天血管组织中有绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞分布,且部分细胞同时为GFP和CD31阳性,但在未损伤血管及对照组则无。结论静脉移植外周血MSCs能促进模型兔颈动脉球囊成形术后损伤血管的快速内皮化,抑制内膜增生和减少术后再狭窄:这一有益作用可能与MSCs归巢到损伤血管局部并部分分化为内皮细胞有关。 展开更多

关键词 间质干细胞移植 血管威形术 手术后并发症 绿色荧光蛋白质类 颈动脉狭窄

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两种CXCR4稳定表达的肾癌A498细胞株的构建

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作者 王林辉 王志向 +2 位作者 刘冰 杨庆 孙颖浩 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期623-627,共5页

目的将表达CXCR4及增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-CXCR4质粒转入肾癌细胞A498中,并建立稳定转染细胞株。方法针对CXCR4基因构建稳定表达CXCR4质粒,应用脂质体转染技术将稳定表达CXCR4及EGFP-CXCR4质粒... 目的将表达CXCR4及增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-CXCR4质粒转入肾癌细胞A498中,并建立稳定转染细胞株。方法针对CXCR4基因构建稳定表达CXCR4质粒,应用脂质体转染技术将稳定表达CXCR4及EGFP-CXCR4质粒转入肾癌A498细胞中,经过G418抗性筛选细胞株。通过共聚焦显微镜观察转染EGFP-CXCR4质粒的A498细胞的表达情况。通过共聚焦显微镜观察EGFP-CXCR4融合蛋白在A498经SDF-1刺激前后的变换。通过蛋白质印迹法检测转染后CXCR4蛋白表达水平的变化,应用MTT法检测转染后的A498细胞增殖能力水平,并通过Transwell实验观察稳定表达CXCR4的肾癌A498细胞株侵袭能力的改变。结果稳定表达CXCR4及EGFP-CXCR4的质粒构建后测序结果与CXCR4DNA序列完全吻合。质粒转入A498细胞后进行G418抗性筛选挑选出合适的细胞株。共聚焦显微镜观察发现,转染EGFP-CXCR4质粒的A498细胞中胞膜及胞质中均有绿色荧光表达,经SDF-1刺激后EGFP-CXCR4向细胞内转移。蛋白质印迹法发现稳定转染CXCR4质粒的A498细胞的CXCR4表达水平高于正常A498细胞。第3天以后,转染pcDNA-CXCR4及pEGFP-CXCR4质粒组的A498细胞增殖水平率高于正常A498细胞(P<0.01)。Transwell实验证实稳定表达CXCR4的肾癌A498细胞株侵袭能力与正常A498细胞株相比增强(P<0.01)。结论成功地构建了CXCR4稳定表达的肾癌A498细胞株,转染后A498细胞的增殖能力增强,侵袭能力增强,为后续实验奠定了基础。 展开更多

关键词 肾肿瘤 A498细胞CXCR4受体 绿色荧光蛋白质类 转染

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小鼠pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体构建及CD69转基因小鼠的建立

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作者 王静 胡燕 +5 位作者 谭笔琴 王佳佳 赵梦婷 翁勤洁 朱狄峰 汪慧英 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期511-516,共6页

目的：构建携小鼠细胞表面活化蛋白CD69和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在细胞内核糖体切入位点（IRES）的表达载体pLCK—CD69-IRES—EGFP，并基于此创建CD69转基因小鼠。方法：首先通过小鼠肺组织提取RNA，逆转录成为cDNA，经过PubMed搜... 目的：构建携小鼠细胞表面活化蛋白CD69和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在细胞内核糖体切入位点（IRES）的表达载体pLCK—CD69-IRES—EGFP，并基于此创建CD69转基因小鼠。方法：首先通过小鼠肺组织提取RNA，逆转录成为cDNA，经过PubMed搜索设计PCR引物，PCR法扩增mCD69片断，接着将该DNA片段经测序验证后接入pInsulater—LCK—IRES—EGFP质粒，构建pLCK—CD69-IRES—EGFP转基因载体；再将其转染到293T细胞中，通过荧光显微镜技术确定其在293T细胞中的表达状况；最后将载体显微注射入受精卵并移植入假孕母小鼠，出生小鼠取尾经PCR鉴定获得阳性首建鼠，并通过荧光显微镜和流式细胞术确定淋巴细胞上CD69的表达。结果：经酶切、DNA测序鉴定证实pLCK—CD69-IRES—EGFP表达载体构建成功；荧光倒置显微镜检查证实其在转染的293T细胞内的蛋白表达；小鼠取尾PCR鉴定明确CD69转基因小鼠创建成功；CD69转基因小鼠有外周血淋巴细胞的减少及静息状态下CD69的表达。结论：成功构建pLCK-CD69-IRES—EGFP表达载体及制备CD69转基因小鼠，为CD69在炎症性疾病中作用的整体模型研究奠定了基础。 展开更多

关键词 抗原 核糖体 绿色荧光蛋白质类/代谢 质粒 转染 小鼠 转基因

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肌细胞增强因子2A CAG重复序列的改变与其细胞学定位功能的相关性研究

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作者 戴大鹏 周晓阳 +2 位作者 郑君德 张铁梅 蔡剑平 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2009年第3期194-197,共4页

目的构建肌细胞增强因子2A(MEF2A)/绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,检测其在Hela和293T细胞中的表达,探讨MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其细胞学定位功能的相关性。方法用PCR法扩增野生型MEF2A基因全长cDNA序列,以及... 目的构建肌细胞增强因子2A(MEF2A)/绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,检测其在Hela和293T细胞中的表达,探讨MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其细胞学定位功能的相关性。方法用PCR法扩增野生型MEF2A基因全长cDNA序列,以及其他含4～15个CAG三联核苷酸重复序列的变异型MEF2A全长cDNA序列;将上述12种MEF2A全长cDNA序列分别克隆入带有GFP报告基因的真核表达载体pEGFP-Cl,构建MEF2A野生型融合表达质粒pEGFP-MEF2A、变异型融合表达质粒pEGFP-MEF2A-CAGr;通过脂质体介导的方法将以上质粒转染到Hela和293T细胞,荧光显微镜检测GFP蛋白的表达。结果构建成功与GFP融合的野生型及变异型MEF2A蛋白表达质粒共12种用于细胞学定位功能研究,体外实验结果显示,上述12种MEF2A蛋白均定位于细胞核内。结论 MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变不会影响其细胞内的定位功能。 展开更多

关键词 突变 肌细胞 细胞学 质粒 转染 绿色荧光蛋白质类

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大鼠卵黄囊的分化及其肿瘤性转化研究

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作者 徐元基 陈惠华 +2 位作者 杜芝燕 王妍 陆应麟 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2006年第2期89-92,I0004,共5页

目的研究12d大鼠胚胎脏层卵黄囊(VYS)向多胚层组织分化的潜能和在逆转录病毒感染下的肿瘤性转化特征。方法在不同培养条件、移植位点的条件下,观察VYS体内外分化的改变;另外利用逆转录病毒载体将荧光蛋白基因(GFP)转染12d卵黄囊细胞,对... 目的研究12d大鼠胚胎脏层卵黄囊(VYS)向多胚层组织分化的潜能和在逆转录病毒感染下的肿瘤性转化特征。方法在不同培养条件、移植位点的条件下,观察VYS体内外分化的改变;另外利用逆转录病毒载体将荧光蛋白基因(GFP)转染12d卵黄囊细胞,对GFP标记的转化细胞进行体内外研究。结果在不同培养条件下,均对体外培养的或体内移植的大鼠卵黄囊向三个胚层分化的进程无特异的导向性。将荧光蛋白标记卵黄囊克隆细胞接种在裸鼠皮下长出了未分化的间质细胞肉瘤。结论12d大鼠胚胎脏层卵黄囊具有向三胚层分化的潜能;逆转录病毒感染导致卵黄囊间质细胞发生肿瘤性转化。 展开更多

关键词 卵黄囊 逆转录病毒 绿色荧光蛋白质类 细胞转化 肿瘤

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Tumstatin-EGFP在CHO细胞中的表达和活性分析

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作者 姚丽娟 罗以勤 +3 位作者 孔建新 赵亮 濮跃晨 马筱玲 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2008年第6期603-607,共5页

目的分析融合蛋白tumstatin-EGFP在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达及生物学活性。方法经过酶切和测序正确的真核表达载体PIRESneo3/STL-EGFP、PIRES-neo3/sig-EGFP和空载体稳定转染CHO细胞后,用Western blot从细胞上清液中检测融合蛋白... 目的分析融合蛋白tumstatin-EGFP在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达及生物学活性。方法经过酶切和测序正确的真核表达载体PIRESneo3/STL-EGFP、PIRES-neo3/sig-EGFP和空载体稳定转染CHO细胞后,用Western blot从细胞上清液中检测融合蛋白的表达、倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。通过生长曲线分析外源基因的导入对CHO细胞生长的影响,MTT法和管状形成抑制试验评估tumstatin-EGFP融合蛋白的tumstatin样活性,体外靶向试验验证tumstatin能否携带融合蛋白特异性结合内皮细胞。结果获得了稳定转染的CHO细胞系。生长曲线表明转染后的较未转染的CHO细胞生长缓慢,MTT试验和管状形成抑制试验分别证实了融合蛋白tumstatin-EGFP具有抑制内皮细胞增殖,明显抑制血管管状结构的形成的作用;体外靶向试验也验证了tumstatin-EGFP能够特异性结合内皮细胞。结论重组真核表达载体在CHO细胞获得稳定表达,融合蛋白tumstatin-EGFP的表达不影响tumstatin和EGFP各自的生物学活性,并且在体外tumstatin能特异性携带EGFP靶向内皮细胞,为进一步tumstatin及其融合蛋白的研究奠定基础。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白质类

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三种转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞的比较研究 被引量：3

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作者 何星 李华 +5 位作者 邵雁 胡莹 顾子春 陈力 马菁晶 兰志勇 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期660-665,共6页

目的:采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。方法:分别采用不同剂量(1.25μl、2.0μl、2.5μl)的Lipofectamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1μg质粒进行转染,观察... 目的:采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。方法:分别采用不同剂量(1.25μl、2.0μl、2.5μl)的Lipofectamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1μg质粒进行转染,观察其转染效率,测定其转染细胞存活率。结果:HilyMax组的转染效率为(86.85%±2.32%),较Lipofectamin2000组(48.33%±3.24%)、Gbfectene-Elite组(37.35%±5.41%)高(F=18.882,P<0.05);其中,HilyMax 2.5μl组的转染效率最高为(90.53%±1.15%)。Lipofectamin2000组的细胞存活率(65.76%±5.78%)明显低于HilyMax组(89.54%±0.86%)、Gbfectene-Elite组(82.45%±3.56%)(F=90.676,P<0.05)。结论:HilyMax对于鸡胚成纤维细胞具有最好的转染效率和最低的细胞毒性,推荐使用2.5μl HilyMax:1μg质粒进行鸡胚成纤维细胞的转染。 展开更多

关键词 转染 质粒DNA/遗传学 鸡胚成纤维细胞/细胞学 绿色荧光蛋白质类 细胞毒性

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p300/CBP相关因子对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响及机制研究 被引量：1

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作者 邱立强 夏豪 +1 位作者 江洪 徐昌武 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2020年第1期75-78,共4页

目的探讨p300/CBP相关因子(PCAF)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)迁移的作用及机制。方法组织块贴壁法获取大鼠原代VSMC,使用Ad-PCAF RNAi腺病毒转染VSMC以下调PCAF表达。选择1μg/ml的脂多糖作为VSMC迁移诱导剂。将实验分为4组:不添加脂多... 目的探讨p300/CBP相关因子(PCAF)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)迁移的作用及机制。方法组织块贴壁法获取大鼠原代VSMC,使用Ad-PCAF RNAi腺病毒转染VSMC以下调PCAF表达。选择1μg/ml的脂多糖作为VSMC迁移诱导剂。将实验分为4组:不添加脂多糖(对照组)、1μg/ml脂多糖刺激(A组)、Ad-绿色荧光蛋白(GFP)腺病毒转染+1μg/ml脂多糖刺激(B组)、Ad-PCAF RNAi腺病毒转染+1μg/ml脂多糖刺激(C组)。采用Transwell实验检测细胞迁移水平。免疫荧光染色实验检测VSMC中NF-κB p65的核转位情况。Western blot检测PCAF、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平。结果 Western blot结果显示,与对照组比较,A组和B组PCAF和磷酸化NF-κB p65蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组PCAF和磷酸化NF-κB p65蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示,与对照组比较,A组和B组穿出小室细胞数明显增多,差异有统计学意义[(766.30±40.86)个/视野、(794.00±76.36)个/视野vs (202.70±22.59)个/视野,P<0.05];与B组比较,C组穿出小室细胞数明显减少,差异有统计学意义[(337.00±82.95)个/视野vs (794.00±76.36)个/视野,P<0.05]。免疫荧光染色实验结果显示,与对照组比较,A组和B组细胞核内NF-κB p65蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与B组比较,C组细胞核内NF-κB p65蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调PCAF的表达可明显抑制VSMC迁移,其机制可能与下调PCAF后抑制NF-κB信号通路介导的炎性反应有关。 展开更多

关键词 p300-CBP转录因子 肌细胞 平滑肌 细胞运动 绿色荧光蛋白质类 NF-κB

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