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绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达 被引量:2
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作者 霍海龙 赵跃 +6 位作者 王锐 侯慧芳 李卫真 张永云 刘丽仙 王配 霍金龙 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期820-825,共6页
为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,... 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达绿色荧光蛋白,经15%SDS-PAGE鉴定,结果显示:重组质粒pET32a-AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES-AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a-AcGFP1转化Rosetta(DE3),经不同浓度的IPTG诱导,SDS-PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+)-TAT-AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 基因克隆 报告基因 原核表达
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膜联蛋白A5绿色荧光蛋白重组质粒的构建及其在宫颈癌细胞系Hela细胞中的表达
2
作者 李欣 高福禄 +2 位作者 王芳 何颖 孙树汉 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期443-445,共3页
目的:构建在哺乳动物细胞中表达的膜联蛋白A5(anxA5)的重组质粒,并在真核细胞中表达。方法:用PCR方法从pJLA503-anxA5质粒中扩增anx A5的基因序列,引入酶切位点XhoⅠ和Bam HⅠ。将真核表达质粒pEGFP-N1和anxA5的PCR产物经双酶切后用T... 目的:构建在哺乳动物细胞中表达的膜联蛋白A5(anxA5)的重组质粒,并在真核细胞中表达。方法:用PCR方法从pJLA503-anxA5质粒中扩增anx A5的基因序列,引入酶切位点XhoⅠ和Bam HⅠ。将真核表达质粒pEGFP-N1和anxA5的PCR产物经双酶切后用T4连接酶连接,并经鉴定序列正确后,用磷酸钙共沉淀法稳定转染Hela细胞,荧光显微镜下观察;免疫细胞化学染色观察anxA5在Hela细胞的表达。结果:重组质粒鉴定正确,稳定转染Hela细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光,免疫细胞化学染色可见anxA5表达。结论:成功构建了pEGFP-anxA5重组质粒,并能在宫颈癌细胞系Hela细胞中表达,为研究anxA5的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 膜联蛋白A5 绿色荧光蛋白 重组质粒 HELA细胞
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携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建 被引量:8
3
作者 成俊 史晓峰 +2 位作者 谢森 唐礼功 夏穗生 《医学研究生学报》 CAS 2005年第1期13-16,共4页
目的 :构建携带绿色荧光蛋白 (GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。 方法 :应用RT PCR方法扩增人转化生长因子基因 ,与GFP真核表达载体连接 ,构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体 ,并用限制性内切酶酶切鉴定。 结... 目的 :构建携带绿色荧光蛋白 (GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。 方法 :应用RT PCR方法扩增人转化生长因子基因 ,与GFP真核表达载体连接 ,构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体 ,并用限制性内切酶酶切鉴定。 结果 :构建的新质粒经酶切鉴定和DNA测序 ,证实新质粒的构建成功。 结论 :应用RT PCR方法扩增目的DNA片段 ,简单快捷 ;双酶切定向克隆可以保证构建一步到位 ,免去正反向重组体筛选的问题。 展开更多
关键词 转化生长因子 绿色荧光蛋白 真核表达 载体
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人B7-2和增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建 被引量:3
4
作者 路静 杨洪艳 +3 位作者 赵军 黄幼田 赵国强 董子明 《山东医药》 CAS 北大核心 2005年第7期19-20,共2页
目的 构建含人B7- 2与增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体p EGFP- N3- B7- 2。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增到人B7- 2 c DNA基因片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒p GEM- Teasy... 目的 构建含人B7- 2与增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体p EGFP- N3- B7- 2。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增到人B7- 2 c DNA基因片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒p GEM- Teasy和p EGFP- N3上。结果 通过酶切和序列分析证实插入片段序列正确。结论 应用基因工程技术构建成功p EGFP- N3- B7- 2融合基因表达载体,为增强型绿色荧光蛋白作为人B7- 2生物标记分子,转染肿瘤细胞及树突状细胞制备疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 B7-2 融合基因 增强型绿色荧光蛋白 表达载体 基因表达 肿瘤细胞
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pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达 被引量:3
5
作者 徐玉英 曹靖 +2 位作者 任秀花 赵青赞 臧卫东 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期339-341,共3页
目的:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)并观察其存大鼠体内的转染部位及表达时间。方法:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔,观察其存大鼠体内转染后的时空效应... 目的:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)并观察其存大鼠体内的转染部位及表达时间。方法:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔,观察其存大鼠体内转染后的时空效应。结果:双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1(+)约5.4kb,EGFP约750bp,另外测序分析与文献报道结果完全一致;动物实验结果表明,鞘内注射24h后存大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达,在14d达到高峰,4周后明显下降,第7周消失;在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光。对照组所有取材部位均没有绿色荧光。结论:重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔,且外源基因得到了表达。 展开更多
关键词 鞘内注射 增强型绿色荧光蛋白 真核表达 PCDNA3.1
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口蹄疫病毒3ABC绿色荧光蛋白载体构建及表达 被引量:3
6
作者 孙德惠 独军政 +1 位作者 常惠芸 才学鹏 《动物医学进展》 CSCD 2006年第4期72-74,106,共4页
将O型口蹄疫病毒Akesu/58株适应细胞培养。用RT-PCR技术从适应细胞株中克隆了3ABC基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序鉴定。然后将目的基因与线性化的绿色荧光蛋白(PEGFPN1)载体连接筛选阳性质粒命名为PEGFPN1-3ABC。将阳性质粒转入JM109... 将O型口蹄疫病毒Akesu/58株适应细胞培养。用RT-PCR技术从适应细胞株中克隆了3ABC基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序鉴定。然后将目的基因与线性化的绿色荧光蛋白(PEGFPN1)载体连接筛选阳性质粒命名为PEGFPN1-3ABC。将阳性质粒转入JM109大肠埃希菌增殖。提取PEGFPN1-3ABC质粒转染入BHK细胞,在荧光显微镜下直接观察表达结果。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 口蹄疫病毒 3ABC基 表达
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稳定高表达增强型绿色荧光蛋白基因膀胱癌细胞株的构建 被引量:1
7
作者 郝钢跃 张维东 +2 位作者 张月英 贾青 田野 《山东医药》 CAS 北大核心 2009年第46期1-3,共3页
目的建立稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的膀胱癌细胞株(KU-7/EGFP)并观察其生物特性的变化。方法利用脂质体将EGFP真核表达质粒(pEGFP-N3)转染至人膀胱癌细胞株KU-7,经过G418筛选和克隆化培养,荧光显微镜及流式细胞仪观察转染... 目的建立稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的膀胱癌细胞株(KU-7/EGFP)并观察其生物特性的变化。方法利用脂质体将EGFP真核表达质粒(pEGFP-N3)转染至人膀胱癌细胞株KU-7,经过G418筛选和克隆化培养,荧光显微镜及流式细胞仪观察转染EGFP基因的KU-7在裸鼠体内外的表达情况,分析转染细胞生物学行为变化。结果KU-7/EGFP在荧光显微镜下发出绿色荧光,能稳定、高效和持久地表达EGFP,与未转染细胞比较,其生物学特性未改变。KU-7/EGFP接种于裸鼠皮下5 d后成瘤,14 d后肿瘤直径达到15 mm。结论成功建立了稳定高表达EGFP的膀胱癌细胞株KU-7-EGFP,其生物学特性未变。 展开更多
关键词 膀胱肿瘤 绿色荧光蛋白 转染 质粒
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表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒Bartha-K61株TK^-突变株的构建 被引量:2
8
作者 范伟兴 宋建兰 +2 位作者 魏荣 陈溥言 赵宏坤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期476-482,共7页
提取伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank已发表的PRVKa plan株UL区UL25、UL24、UL23、UL22基因序列,选择保守序列设计了两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)的可用于同源重组的左臂片段(L... 提取伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank已发表的PRVKa plan株UL区UL25、UL24、UL23、UL22基因序列,选择保守序列设计了两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R),L包括部分UL25、全部UL24、部分TK,R包括部分TK及部分UL22,L和R的拼接片段中TK基因内部缺失270个核苷酸。将L片段和R片段克隆于pBluescriptM13-载体上,获得pSKLR;再将绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1上含GFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pSKLR的L片段和R片段之间构成转移载体pSKLRG。提取pSKLRG质粒,经单酶切线性化后用脂质体与PRVBartha-K61株共转染143TK-细胞,在细胞培养液中有5 溴脱氧尿嘧啶(BrdU)存在的条件下筛选出表达绿色荧光蛋白的重组PRVBartha-K61毒株:PRVrBGFP。 展开更多
关键词 基因表达 绿色荧光蛋白 伪狂犬病毒 Bartha—K61株 TK^-突变株 基因构建 PCR扩增模板 DNA
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绿色荧光蛋白的原核表达、纯化与荧光分析 被引量:3
9
作者 张少斌 刘慧 《食品研究与开发》 CAS 北大核心 2006年第6期23-25,共3页
将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入到pET30(a)+构建pET30-GFP表达载体,将重组载体导入大肠杆菌BL-21中,经IPTG诱导产生His-GFP融合蛋白,融合蛋白主要存在于可溶性上清中。用镍柱亲合纯化His-GFP,分子量大约为32.4kD,与预期值相符。荧光分析表... 将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入到pET30(a)+构建pET30-GFP表达载体,将重组载体导入大肠杆菌BL-21中,经IPTG诱导产生His-GFP融合蛋白,融合蛋白主要存在于可溶性上清中。用镍柱亲合纯化His-GFP,分子量大约为32.4kD,与预期值相符。荧光分析表明,His-GFP与野生型GFP荧光激发及发射波长基本相同,荧光性质稳定,比常用的荧光素(FITC)具有更强的抗荧光淬灭能力。通过此方法制备的绿色荧光蛋白可用于食用色素的开发等。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 原核表达 纯化
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食管癌点突变型DNA聚合酶β与绿色荧光蛋白重组表达载体的构建 被引量:1
10
作者 赵军 黄幼田 +3 位作者 路静 杨洪艳 赵国强 董子明 《山东医药》 CAS 北大核心 2005年第7期13-15,共3页
目的 构建携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组真核绿色荧光蛋白表达载体p EGFP-C3- polβ。方法 运用PCR方法,从质粒pc DNA3.1- polβ中扩增出点突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,T- A克隆至p GEM- TEasy载体,再定向克隆至... 目的 构建携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组真核绿色荧光蛋白表达载体p EGFP-C3- polβ。方法 运用PCR方法,从质粒pc DNA3.1- polβ中扩增出点突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,T- A克隆至p GEM- TEasy载体,再定向克隆至p EGFP- C3真核绿色荧光蛋白表达载体,重组质粒p EGFP- C3- polβ用限制性内切酶酶切和通用鉴定引物PCR扩增鉴定,并进行DNA序列分析。结果 DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列与已知的点突变型DNA聚合酶β基因序列相符。结论 成功构建了携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组的荧光蛋白表达载体p EGFP- C3- polβ,为DNA聚合酶β基因的体内外表达及蛋白定位提供了理想的标记。 展开更多
关键词 DNA聚合酶Β 绿色荧光蛋白 点突变型 PCR扩增 食管癌 表达载体
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绿色荧光蛋白酿酒酵母表达系统的建立 被引量:2
11
作者 祁浩 刘新利 《齐鲁工业大学学报》 2016年第3期24-27,共4页
利用质粒YEplac112为骨架,在其多克隆位点Hind III和EcoRI之间插入水母绿色荧光蛋白(GFP)开放阅读框上下游约1 kb左右的DNA序列,得到YEplac112-CT质粒,在其多克隆位点Pst I和Bam HI之间插入750bp左右的GFP DNA序列,构建表达质粒YEplac11... 利用质粒YEplac112为骨架,在其多克隆位点Hind III和EcoRI之间插入水母绿色荧光蛋白(GFP)开放阅读框上下游约1 kb左右的DNA序列,得到YEplac112-CT质粒,在其多克隆位点Pst I和Bam HI之间插入750bp左右的GFP DNA序列,构建表达质粒YEplac112-C-GFP-T,以酿酒酵母W303为宿主,通过报告基因GFP验证了所构建的表达载体具有便捷筛选及良好的表达效果。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 GFP 质粒 表达
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瘦素与绿色荧光蛋白融合基因的合成及其高效表达
12
作者 庞实锋 吴晓萍 +4 位作者 李校堃 郑青 于平野 曲红艳 王艳萍 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期276-279,共4页
目的 :为了便于追踪瘦素 (Leptin)在体内的去向 ,对其进行体内定位 ,设计合成Leptin荧光分子蛋白探针。方法 :用PCR技术将LeptincDNA与绿色荧光蛋白cDNA构建成融合基因LG ,然后将其克隆进原核表达载体pET3c中 ,构建成原核表达工程菌BL2 ... 目的 :为了便于追踪瘦素 (Leptin)在体内的去向 ,对其进行体内定位 ,设计合成Leptin荧光分子蛋白探针。方法 :用PCR技术将LeptincDNA与绿色荧光蛋白cDNA构建成融合基因LG ,然后将其克隆进原核表达载体pET3c中 ,构建成原核表达工程菌BL2 1(DE3) /pET3c LG。用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性 ,用荧光显微镜观察融合蛋白及其诱导菌休的发光活性。结果 :DNA测序结果证实设计合成的融合基因与预期一致 ;构建的工程菌BL2 1(DE3) /pET3c LG获得了表达 ,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 4 0 %以上 ;Western blot杂交检测表明重组蛋白具有Leptin的免疫原性 ;经IPTG诱导后的菌体及蛋白粗提液在荧光显微镜下可观察到其能发射出强烈的绿色荧光。结论 :融合基因在大肠杆菌中实现了高效表达 ,表达的融合蛋白具Leptin的免疫原性和GFP的发光特性。为利用绿色荧光蛋白标记Leptin在动物体内的药物治疗的研究提供了一种新的途径。 展开更多
关键词 瘦素 绿色荧光蛋白(GFP) 融合基因 高效表达
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表达绿色荧光蛋白重组单核细胞增多性李斯特菌的构建(英文)
13
作者 柯春林 宋厚辉 +2 位作者 江玲丽 张桂芝 方维焕 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期638-644,共7页
将编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因融合到单核细胞增多性李斯特菌actA基因启动子和信号肽下游,应用同源重组技术构建了含gfp的重组李斯特菌突变株.PCR扩增及其产物的酶切鉴定均证实目的基因gfp融合到李斯特菌基因组中.荧光显微镜下可见重... 将编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因融合到单核细胞增多性李斯特菌actA基因启动子和信号肽下游,应用同源重组技术构建了含gfp的重组李斯特菌突变株.PCR扩增及其产物的酶切鉴定均证实目的基因gfp融合到李斯特菌基因组中.荧光显微镜下可见重组菌体发绿色荧光.SDS-PAGE电泳和免疫印迹结果显示重组李斯特菌表达的GFP分子量约为28 kD,与预计的分子量大小一致.重组菌对鸡胚和小鼠的毒力以及对体外培养细胞的侵袭力均低于野生型李斯特菌.该重组菌可用于研究李斯特菌的致病机理和食品加工过程中微生物污染控制的指示性细菌. 展开更多
关键词 单核细胞增多性李斯特菌 同源重组 绿色荧光蛋白 外源基因表达
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携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体构建及鉴定
14
作者 肖钟迪 张玉成 房学东 《山东医药》 CAS 北大核心 2010年第5期71-72,共2页
目的构建携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体,为研究其抗肿瘤功能奠定基础。方法提取基因组RNA,利用特异性引物进行RT-PCR反应,扩增全长TSLC1基因片段,与真核表达载体pReceiver-M29载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增... 目的构建携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体,为研究其抗肿瘤功能奠定基础。方法提取基因组RNA,利用特异性引物进行RT-PCR反应,扩增全长TSLC1基因片段,与真核表达载体pReceiver-M29载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增,以获得重组载体,应用酶切、PCR及测序鉴定此重组载体。结果RT-PCR获得约1 329 bp大小的特异性TSLC1基因片段;测序鉴定证实,TSLC1基因片段正确插入真核表达载体pReceiver-M29中。结论成功构建了真核表达载体pReceiver-M29-TSLC1。 展开更多
关键词 TSLC1 克隆 真核表达 绿色荧光蛋白
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组织因子途径抑制因子/绿色荧光蛋白双顺反子真核表达载体构建及其在NIH 3T3细胞中表达
15
作者 宋丽萍 楼莎 +5 位作者 朱敦皖 刘兰霞 张海玲 董霞 董庭婷 冷希岗 《生物医学工程与临床》 CAS 2011年第2期178-182,88,共5页
目的构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 3T3细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体。方法以含有全长cDNA的pIRES-TFPI为模板,多聚... 目的构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 3T3细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体。方法以含有全长cDNA的pIRES-TFPI为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增TFPI全长cDNA,经酶切后插入到pIRES2-AcGFP1-Nuc载体中,构建成双顺反子真核表达载体,重组质粒经酶切图谱分析、PCR扩增及测序鉴定后命名为pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI。将其转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达,以RT-PCR检测TFPI在细胞内的表达。结果经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实双顺反子真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达;RT-PCR证实经TFPI基因转染的细胞内TFPI mRNA表达增高。结论成功构建了包括TFPI和GFP的真核双表达载体,并使其在NIH3T3细胞中顺利表达。 展开更多
关键词 组织因子途径抑制因子 绿色荧光蛋白 双顺反子表达载体 血管再狭窄
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绿色荧光蛋白基因在家蚕的表达研究
16
作者 陈智毅 李青兵 +3 位作者 陈列辉 廖琼香 李宝瑜 廖森泰 《广东蚕业》 1999年第4期31-34,共4页
将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入家蚕蛹(G_0)的睾丸,利用荧光显微镜技术检测到绿色荧光蛋白基因在家蚕卵(G_1)表达的荧光图像。
关键词 家蚕(Bombyx mori L.) 绿色荧光蛋白 基因表达 荧光显微镜
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绿色荧光蛋白的真核表达及其单克隆抗体制备 被引量:1
17
作者 胡换仪 汪建中 +4 位作者 刘昌锦 林敏 刘小兰 魏黄思梧 邓舜洲 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第1期328-337,共10页
【目的】构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox virus,rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体。【方法】首先合成3′-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其... 【目的】构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox virus,rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体。【方法】首先合成3′-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。【结果】PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体效价高达1∶256000。采用杂交瘤技术制备了9株能稳定分泌抗EGFP-His单克隆抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA和Western blotting结果显示,9株单克隆抗体中的7株针对GFP的线性表位,另外2株单克隆抗体针对GFP的构象表位。【结论】本研究成功制备了EGFP-His蛋白和9株抗EGFP-His的单克隆抗体,为后续建立GFP的免疫学检测方法提供了必备材料。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白(GFP) 猪痘病毒载体 真核表达 单克隆抗体
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含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780的构建 被引量:1
18
作者 邓丽 刘红 杨万年 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第26期11251-11252,共2页
[目的]构建含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。[方法]用PCR方法扩增psmGFP的GFP片段,BamHI和SacI双酶切PCR产物,同时用BamHI和SacI双酶切pBI121。从琼脂糖凝胶中回收纯化pBI121的大片段,... [目的]构建含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。[方法]用PCR方法扩增psmGFP的GFP片段,BamHI和SacI双酶切PCR产物,同时用BamHI和SacI双酶切pBI121。从琼脂糖凝胶中回收纯化pBI121的大片段,经连接、转化、鉴定出改造后的质粒。[结果]用PCR方法扩增得到长度为740 bp的增强型的绿色荧光蛋白基因片段,克隆入pBI121表达载体后,获得了新的重组质粒pBI121-GFP。分别将编码拟南芥BAG7、BAG4蛋白的基因At5g62390和At3g51780通过PCR方法扩增后,克隆入pBI121-GFP,构建了用于超量表达BAG蛋白基因的GFP融合蛋白双元表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。利用细胞感受态法将该植物表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101中。[结论]为进一步研究BAG蛋白在拟南芥抗性胁迫中的功能及其在细胞内的动态分布奠定了基础。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白(sfp)基因 BAG蛋白 植物表达载体 根癌农杆菌
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以黄瓜花叶病毒为载体表达绿色荧光蛋白 被引量:2
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作者 卢冉 常发光 +1 位作者 杜志游 廖乾生 《浙江理工大学学报(自然科学版)》 2016年第6期917-921,共5页
为了构建基于黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的外源蛋白表达载体,实验在获得CMV的LS株系(CMV-LS)农杆菌侵染性克隆(pCB301-R1,R2和R3)的基础上,将CMV-LS基因组RNA3的外壳蛋白(coat protein,CP)基因置换成绿色荧光蛋白(green f... 为了构建基于黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的外源蛋白表达载体,实验在获得CMV的LS株系(CMV-LS)农杆菌侵染性克隆(pCB301-R1,R2和R3)的基础上,将CMV-LS基因组RNA3的外壳蛋白(coat protein,CP)基因置换成绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因,研究以CMV-LS为载体在本氏烟中表达GFP基因的情形。农杆菌浸润接种结果表明,以R1R2R3-gfp为载体在寄主中的GFP表达量远高于植物瞬时表达载体pCB301产生的GFP,番茄丛矮病毒基因沉默抑制子p19加入有助于CMV表达GFP,将移动蛋白(movement protein,MP)缺失C端的33个氨基酸残基而构建表达载体R1R2R3mpΔ33-gfp在寄主中的GFP含量大大增加。农杆菌菌液稀释接种的结果表明R1R2R3mpΔ33-gfp接种OD600值为0.01均能有效在本氏烟中表达产生GFP。 展开更多
关键词 黄瓜花叶病毒 农杆菌浸润接种 表达载体 绿色荧光蛋白
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靶向增强绿色荧光蛋白shRNA的真核表达载体构建 被引量:1
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作者 包莉 《湖北民族学院学报(医学版)》 2009年第2期4-6,F0003,共4页
目的构建针对增强绿色荧光蛋白(EGFP)的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6。方法设计并合成针对EGFP的shRNA DNA片段,退火后连接到真核表达载体pGenesil-1上,通过测序证实载体构建成功;用脂质体将构建正确的质粒转染到中国仓... 目的构建针对增强绿色荧光蛋白(EGFP)的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6。方法设计并合成针对EGFP的shRNA DNA片段,退火后连接到真核表达载体pGenesil-1上,通过测序证实载体构建成功;用脂质体将构建正确的质粒转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,72 h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果测序证实针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6构建正确;荧光显微镜下观察转染pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6质粒的CHO细胞中,荧光明显减少。结论针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6能明显干扰EGFP的表达。 展开更多
关键词 增强绿色荧光蛋白 小发夹RNA RNA干扰 真核表达载体
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