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一种诱导表达绿色荧光蛋白穿梭质粒的构建及其在荧光示踪中的应用
1
作者 左东 李子晨 +5 位作者 尹伊 胡海 王少辉 祁晶晶 田明星 于圣青 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第4期25-31,共7页
细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究... 细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究构建了一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒pBT-iEGFP,该质粒可通过添加无水四环素诱导表达绿色荧光蛋白。诱导表达和传代稳定性试验表明,pBT-iEGFP质粒可在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中成功诱导表达绿色荧光蛋白,在五代盲传中该质粒能在细菌中稳定遗传。胞内布鲁菌诱导表达试验证实,pBT-iEGFP质粒可成功示踪细胞感染过程中活的布鲁菌。总之,本研究构建的pBT-iEGFP质粒可作为细菌的荧光示踪研究工具,应用于多种实验研究。 展开更多
关键词 诱导表达质粒 绿色荧光蛋白 大肠杆菌 沙门菌 布鲁菌
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带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建 被引量：3
2
作者 范文韬 刘德立 +1 位作者 孙晓洁 杨成丽 《华中师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2000年第2期213-215,共3页
利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.
关键词 绿色荧光蛋白基因 植物重组表达质粒 pBI-GFP
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结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建 被引量：3
3
作者 曾曙光 张积仁 +4 位作者 章锦才 吴世卿 刘启才 艾伟健 薛国初 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期433-436,445,共5页
目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物... 目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列。将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒。将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒。Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Westernblot检测mtHSP70蛋白表达情况。结果酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达。结论含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础。 展开更多
关键词 结核杆菌 热休克蛋白70 增强型绿色荧光蛋白 真核表达 免疫治疗 肿瘤
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绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达 被引量：2
4
作者 霍海龙 赵跃 +6 位作者 王锐 侯慧芳 李卫真 张永云 刘丽仙 王配 霍金龙 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期820-825,共6页
为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,... 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达绿色荧光蛋白,经15%SDS-PAGE鉴定,结果显示:重组质粒pET32a-AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES-AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a-AcGFP1转化Rosetta(DE3),经不同浓度的IPTG诱导,SDS-PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+)-TAT-AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 基因克隆 报告基因 原核表达
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shRNA表达质粒抑制耐阿霉素的人乳腺癌细胞株(MCF-7/AdrR)绿色荧光蛋白表达的研究
5
作者 干惠珠 张桂珍 +4 位作者 张凤春 卜丽莎 杨绍娟 高申 郑德明 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期31-33,37,共4页
目的探讨靶向增强型绿色荧光蛋白(EGFP)小发夹结构RNA(ShorthairpinRNA,shRNA)对耐阿霉素的人乳腺癌细胞(MCF-7/AdrR)中EGFP基因表达的抑制作用。方法构建针对EGFP基因的shRNA表达载体,与pcDNA3.0EGFP质粒共转染MCF-7/AdrR细胞,分别用... 目的探讨靶向增强型绿色荧光蛋白(EGFP)小发夹结构RNA(ShorthairpinRNA,shRNA)对耐阿霉素的人乳腺癌细胞(MCF-7/AdrR)中EGFP基因表达的抑制作用。方法构建针对EGFP基因的shRNA表达载体,与pcDNA3.0EGFP质粒共转染MCF-7/AdrR细胞,分别用激光共聚焦扫描显微镜(Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM)和流式细胞术检测干扰效果。结果瞬时共转染pSilencerTM3.1-H1neoEGFPshRNA质粒和pcDNA3.0EGFP质粒后,荧光显微镜观察结果显示MCF-7/AdrR细胞中发出荧光的细胞数量减少,荧光强度明显降低。流式细胞术检测阳性细胞百分率降低至35.6%,差异有显著性。结论靶向EGFP的shRNA表达质粒能有效而特异抑制EGFP在MCF-7/AdrR中的表达,MCF-7/AdrR细胞中存在RNA干扰现象,为进一步利用RNA干扰技术逆转乳腺癌多药耐药性的研究奠定基础。 展开更多
关键词 RNAi 绿色荧光蛋白 乳腺肿瘤 SHRNA表达载体
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增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达 被引量：9
6
作者 傅建新 王玮 +2 位作者 卢大儒 岑建农 陈子兴 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期261-265,共5页
逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交... 逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞 ,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性。流式细胞术和荧光显微镜检测发现 ,EGFP病毒转录的GP +envAm12细胞和K5 62细胞均可发出稳定的绿色荧光信号 ,阳性率可分别达 97%和 86% ;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合。上述结果提示 ,作为新一代选择性标志 ,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因 。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 逆转录病毒载体 基因表达 构建
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基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法 被引量：16
7
作者 于一帆 朱小彬 +1 位作者 葛会敏 陈云 《江苏农业科学》 北大核心 2014年第12期58-61,共4页
细胞是生命活动的基本单位,各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报... 细胞是生命活动的基本单位,各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法,其中绿色荧光蛋白应用最为广泛。综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法,包括拟南芥原生质体瞬时表达、烟草叶片瞬时表达、洋葱表皮细胞瞬时表达等,同时对上述几种方法进行了比较分析。 展开更多
关键词 蛋白质 亚细胞定位 绿色荧光蛋白 瞬时表达
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重组绿色荧光蛋白-肿瘤坏死因子融合蛋白的表达及应用 被引量：3
8
作者 孙义敏 尹丙姣 +2 位作者 李卓娅 姜小丹 徐勇 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期519-521,534,共4页
目的　为肿瘤坏死因子 α (TNF α)及其受体 (TNFR)的科学研究提供实验工具。方法　用基因克隆技术构建了人TNF α (rhTNF α)及绿色荧光蛋白 (GFP)与人TNF α的融合蛋白 (GFP TNF)的原核表达质粒pET2 8a/rhTNF及 pET2 8a/GFP TNF ,分... 目的　为肿瘤坏死因子 α (TNF α)及其受体 (TNFR)的科学研究提供实验工具。方法　用基因克隆技术构建了人TNF α (rhTNF α)及绿色荧光蛋白 (GFP)与人TNF α的融合蛋白 (GFP TNF)的原核表达质粒pET2 8a/rhTNF及 pET2 8a/GFP TNF ,分别转化大肠杆菌BL2 1;用IPTG诱导重组蛋白的表达 ,超声裂菌 ,包涵体中的rhTNF α和GFP TNF用镍金属螯合层析柱进行纯化 ;用MTT法检测rhTNF α和GFP TNF的生物活性。结果重组表达的rhTNF α及GFP TNF均具有明显的细胞毒效应 ,GFP TNF还具有GFP的绿色荧光特性。结论　rhTNF α和GFP TNF具有生物活性 ,可用于TNF α和TNFR的实验研究。 展开更多
关键词 HTNF-Α 原核表达质粒 TNFR 肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 融合蛋白 细胞毒效应 绿色荧光蛋白(GFP) 绿色荧光蛋白 IPTG 包涵体
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表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定 被引量：9
9
作者 王芳 焦新安 +2 位作者 刘文博 张如宽 刘秀梵 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期119-122,共4页
应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中 ,重组菌经LB固体及液体培养基连续传 15代后 ,单个菌落和菌液均呈绿色 ;在体内稳定试验中 ,经ICR小鼠连续传代 10次 ,从肝脏、脾脏中分离的细... 应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中 ,重组菌经LB固体及液体培养基连续传 15代后 ,单个菌落和菌液均呈绿色 ;在体内稳定试验中 ,经ICR小鼠连续传代 10次 ,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色 ,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS_PAGE结果显示 ,鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为 2 7kD ,这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/C小鼠后 ,观察 1个月未见有异常现象 ,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型 ,为研究沙门氏菌疫苗和沙门氏菌疾病的致病机理提供了一个有力的工具 。 展开更多
关键词 基因表达 基因重组 基因构建 基因鉴定 绿色荧光蛋白 减毒鼠伤寒沙门氏菌
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携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建 被引量：8
10
作者 成俊 史晓峰 +2 位作者 谢森 唐礼功 夏穗生 《医学研究生学报》 CAS 2005年第1期13-16,共4页
目的 :构建携带绿色荧光蛋白 (GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。　方法 :应用RT PCR方法扩增人转化生长因子基因 ,与GFP真核表达载体连接 ,构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体 ,并用限制性内切酶酶切鉴定。　结... 目的 :构建携带绿色荧光蛋白 (GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。　方法 :应用RT PCR方法扩增人转化生长因子基因 ,与GFP真核表达载体连接 ,构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体 ,并用限制性内切酶酶切鉴定。　结果 :构建的新质粒经酶切鉴定和DNA测序 ,证实新质粒的构建成功。　结论 :应用RT PCR方法扩增目的DNA片段 ,简单快捷 ;双酶切定向克隆可以保证构建一步到位 ,免去正反向重组体筛选的问题。 展开更多
关键词 转化生长因子 绿色荧光蛋白 真核表达 载体
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携强绿色荧光蛋白重组慢病毒的构建及其在原代培养SD大鼠皮层神经细胞中的表达 被引量：6
11
作者 杨宇 吴江 +4 位作者 杨欣 孙欣 吴昊 王全颖 杨广笑 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期237-240,共4页
目的:构建携带强绿色荧光蛋白的重组慢病毒(Lent/EGFP),感染原代培养SD大鼠皮层神经细胞,观察其感染能力及报告基因的表达水平。方法:采用PCR方法克隆EGFP cDNA;将EGFP基因片段亚克隆到慢病毒穿梭质粒多克隆位点内;用4质粒共转染系统在2... 目的:构建携带强绿色荧光蛋白的重组慢病毒(Lent/EGFP),感染原代培养SD大鼠皮层神经细胞,观察其感染能力及报告基因的表达水平。方法:采用PCR方法克隆EGFP cDNA;将EGFP基因片段亚克隆到慢病毒穿梭质粒多克隆位点内;用4质粒共转染系统在293ET细胞中包装出携带EGFP基因的重组慢病毒Lent/EGFP;重组病毒感染NIH 3T3细胞,FACS检测重组病毒滴度;Lent/EGFP感染体外培养的原代SD大鼠皮层神经细胞,共聚焦荧光纤维镜观察原代神经细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。结果:基因测序证明克隆的EGFP cDNA与GenBank提供的序列完全一致;琼脂糖凝胶电泳结果证实EGFP正确插入pLenti6/V5TOPO;FACS检测病毒滴度为2×106;在体外分离培养的原代SD大鼠皮层神经细胞中,重组病毒感染72 h后可见较强的绿色荧光蛋白表达。结论:采用改良的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组慢病毒载体;Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达。 展开更多
关键词 增强绿色荧光蛋白 慢病毒属 原代培养神经细胞 基因表达
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绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测 被引量：6
12
作者 蒋欣泉 张志愿 +4 位作者 曹俊 陈传俊 王明国 周晓健 陈万涛 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期89-91,共3页
目的　检测绿色荧光蛋白基因 (EGFP)的表达载体pEGFP对MSCs的转染效率及瞬时表达 ,为利用pEGFP构建骨形成蛋白 (BMP)表达载体并转染骨髓基质干细胞 (MSCs)提供依据。方法　在体外扩增并酶切鉴定pEGFP质粒 ;抽取兔骨髓 ,应用贴壁法培养MS... 目的　检测绿色荧光蛋白基因 (EGFP)的表达载体pEGFP对MSCs的转染效率及瞬时表达 ,为利用pEGFP构建骨形成蛋白 (BMP)表达载体并转染骨髓基质干细胞 (MSCs)提供依据。方法　在体外扩增并酶切鉴定pEGFP质粒 ;抽取兔骨髓 ,应用贴壁法培养MSCs;质粒与脂质体按照不同的比例混合 ,以脂质体介导法转染pEGFP ,应用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况。结果　转染效率与脂质体和质粒的比例有关 ,绿色荧光蛋白在基因转染 2 4h后开始表达 ,4 8～ 72h最高 ,1周后表达逐渐减弱 ,但 3～ 4周后仍有少量表达。结论　按照合适的质粒和脂质体比例 ,pEGFP转染MSCs的效率可达到 30 % ,并能持续表达 3周以上 ,是转染MSCs较为理想的瞬时表达载体。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白基因 骨髓基质干细胞 瞬时表达 基因转染 脂质体
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含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建 被引量：3
13
作者 桂慕燕 叶向群 +1 位作者 吴春旭 熊秀芳 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期628-633,共6页
以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG35 0为出发质粒 ,插入增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体 pMD Fib IE EGFP ,通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中 ,通过脂质体介... 以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG35 0为出发质粒 ,插入增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体 pMD Fib IE EGFP ,通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中 ,通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光 ,表明该质粒能够在真核细胞中表达 。 展开更多
关键词 EGFP 家蚕 同源重组质粒载体 增强型绿色荧光蛋白基因 转基因蚕 载体构建 基因表达
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血管生成素与绿色荧光蛋白融合基因的构建、表达及生物活性 被引量：4
14
作者 马百坤 徐东刚 +4 位作者 王嘉玺 彭善云 李莉 王利红 邹民吉 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期445-449,共5页
通过RT PCR的方法从人外周血白细胞扩增血管生成素 (Ang)cDNA .在计算机分子结构模建的基础上 ,通过柔性连接臂构建了Ang与Gfp融合基因 ,并在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达 .重组蛋白占菌体总蛋白的 32 %.融合蛋白经初步纯化后 ,在紫... 通过RT PCR的方法从人外周血白细胞扩增血管生成素 (Ang)cDNA .在计算机分子结构模建的基础上 ,通过柔性连接臂构建了Ang与Gfp融合基因 ,并在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达 .重组蛋白占菌体总蛋白的 32 %.融合蛋白经初步纯化后 ,在紫外线激发下可见明显的绿色荧光 ,同时能够显著地促进鸡胚尿囊膜毛细血管的新生 ,而且所获融合蛋白在体外具有促进人脐静脉血管内皮细胞增殖的作用 .这种双功能融合蛋白的表达为阐明Ang的核转位过程奠定了基础 。 展开更多
关键词 血管生成素 绿色荧光蛋白 融合基因 构建 表达 生物活性
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应用绿色荧光蛋白研究外源基因在造血细胞的表达调控 被引量：5
15
作者 刘兵 周生 +4 位作者 张双喜 孙建民 杨靖清 于晓媅 毛宁 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第5期699-703,共5页
以增强型绿色荧光蛋白为报道分子,研究双基因逆转录病毒载体介导小鼠骨髓细胞的基因转移中,SV(simianvirus)40启动子和内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)对双基因共表达的影响。构建双基因中间序列分别为SV40启动子和... 以增强型绿色荧光蛋白为报道分子,研究双基因逆转录病毒载体介导小鼠骨髓细胞的基因转移中,SV(simianvirus)40启动子和内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)对双基因共表达的影响。构建双基因中间序列分别为SV40启动子和IRES的载体pLESN和pLEIN。经包装获得较高滴度的病毒上清,以共培养的方式感染5-氟尿嘧啶预刺激的小鼠骨髓细胞。流式细胞仪检测表明转染效率约25%,PCR证明EGFP基因整合至骨髓细胞基因组。半固体培养转基因细胞7d,LEIN组获得具有G418抗性的集落中98%表达绿色荧光,而LESN组54%。结果表明:在双基因逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓细胞的基因转导中,IRES与内部SV40启动子相比,更能保证双基因的共同表达。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 外源基因 造血细胞 表达调控
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携带IRES的BMP_2绿色荧光蛋白表达载体的构建和表达 被引量：5
16
作者 邹海波 安洪 +2 位作者 蒋电明 刘建伟 周亚莉 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2004年第4期455-458,共4页
目的 :构建携带有BMP2 基因的pIRES2 绿色荧光蛋白表达载体 ,为BMP2 在体内外表达及蛋白定位提供标记。方法 :酶切 pCDAN3.1-BMP2 质粒 ,获得BMP2 cDNA片段并亚克隆至 pUC18载体上 ,随后用SalⅠ单酶切pUC18-BMP2 ,再次获得BMP2 cDNA ,... 目的 :构建携带有BMP2 基因的pIRES2 绿色荧光蛋白表达载体 ,为BMP2 在体内外表达及蛋白定位提供标记。方法 :酶切 pCDAN3.1-BMP2 质粒 ,获得BMP2 cDNA片段并亚克隆至 pUC18载体上 ,随后用SalⅠ单酶切pUC18-BMP2 ,再次获得BMP2 cDNA ,同时用SalⅠ将载体 pIRES2 -EGFP线性化后去磷酸化修饰。连接二者构建重组质粒。酶切筛选阳性克隆并鉴定插入的方向。重组质粒转染细胞 ,用激光共聚焦显微镜、RT -PCR及流式细胞仪检测基因在细胞内的定位、表达及转染效率 ;结果 :重组载体经酶切和测序证明构建正确 ,并在细胞中表达。结论 :成功构建了 pIRES2 -BMP2 -EGFP表达载体 ,为研究BMP2 展开更多
关键词 骨形态发生蛋白 绿色荧光蛋白 内部核糖体进入位点 真核表达
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表达绿色荧光蛋白重组乳酸杆菌的构建及电击转化条件 被引量：2
17
作者 田兴山 张玲华 +2 位作者 周风珍 李国立 孙晓刚 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期117-119,共3页
应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组乳酸杆菌.将pGFP2质粒中的绿色荧光蛋白基因切下,克隆进表达载体质粒pThioHisB的NcoⅠ和SacⅠ位点之间,构建成重组表达质粒pThioGFP,然后转化大肠杆菌BL21.从BL21中提取重组质粒,用电... 应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组乳酸杆菌.将pGFP2质粒中的绿色荧光蛋白基因切下,克隆进表达载体质粒pThioHisB的NcoⅠ和SacⅠ位点之间,构建成重组表达质粒pThioGFP,然后转化大肠杆菌BL21.从BL21中提取重组质粒,用电击法转化乳酸杆菌Lac1001,当细菌处于D600nm为0.6的生长期时,使用PEB作为电击缓冲液,对100μL体积的细胞悬液在电容25μF,电阻200Ω,电压2.2kV的电击条件进行完整质粒转化可得到较高的转化率.电击转化后Lac1001于LB培养基上呈绿色,在荧光透射仪下观察,整个菌体发绿色荧光.构建的重组乳酸杆菌能够稳定表达绿色荧光蛋白. 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 重组乳酸杆菌 质粒构建 电击
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绿色荧光蛋白基因在小鼠胚胎干细胞中表达效率的影响因素分析 被引量：3
18
作者 杨桦 戴建新 +1 位作者 戴旭明 傅继梁 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期319-321,共3页
目的 :研究绿色荧光蛋白 (GFP)基因在小鼠胚胎干细胞系 R1中表达的影响因素。方法 :构建 3个不同的 GFP真核表达载体 ,并从转录、蛋白表达水平比较了它们整合于宿主细胞染色体中的表达效率。结果 :在 GFP蛋白表达水平上 ,含肽链延长因子... 目的 :研究绿色荧光蛋白 (GFP)基因在小鼠胚胎干细胞系 R1中表达的影响因素。方法 :构建 3个不同的 GFP真核表达载体 ,并从转录、蛋白表达水平比较了它们整合于宿主细胞染色体中的表达效率。结果 :在 GFP蛋白表达水平上 ,含肽链延长因子 (EF)启动子的表达载体和所转染的克隆明显高于含 CMV启动子及含双拷贝 CMV - GFP表达单元的表达载体 ;而p CMV- GFP和 pd CMV - GFP所转染的克隆之间无显著差别 ;NIH3T3和 ES细胞之间比较 ,GFP的表达水平无显著差异。转录水平与蛋白质水平的测定结果相一致。结论 :(1)在 NIH 3T3和 R1胚胎干细胞系中 ,EF启动子引导下的 GFP基因表达效率明显高于 CMV启动子 ;(2 )外源基因表达单元的拷贝数在染色体中的少量增加 ,不能明显提高表达效率 ;(3)获得了在 R1胚胎干细胞系中稳定、高效表达 GFP的载体 ,为后续工作奠定了基础。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 胚胎干细胞 基因表达 影响因素 小鼠
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利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白 被引量：7
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作者 王林美 张波 +5 位作者 叶博 赵振军 李树英 李文利 岳冬梅 范琦 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期792-799,共8页
为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培... 为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。 展开更多
关键词 柞蚕蛹 核型多角体病毒表达载体系统 增强型绿色荧光蛋白基因 樗蚕培养细胞
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韧皮部特异性启动子的克隆及含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体的构建 被引量：5
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作者 胡桂兵 张上隆 +1 位作者 徐昌杰 林顺权 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期118-120,共3页
用PCR方法扩增得到了长度为966 bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆入pUCm-T载体后,获得了新的重组质粒pUCm-PSP.分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMB IA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光... 用PCR方法扩增得到了长度为966 bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆入pUCm-T载体后,获得了新的重组质粒pUCm-PSP.分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMB IA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的新型植物表达载体pHZ03.利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌R i15834中. 展开更多
关键词 笋瓜 韧皮部特异性启动子(PSP) 植物表达载体 绿色荧光蛋白(GFP)
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