重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定 被引量：2

1

作者 陈于红 朱镇华 +6 位作者 刘蓓钫 张菁 傅一工 王石泉 张巍 杨庆 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期1-6,共6页

　利用RT PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2.1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重... 　利用RT PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2.1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a/K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌.经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20%.该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性. 展开更多

关键词 组织型人纤溶酶原激活剂变体基因 工程菌 质粒稳定性 表达稳定性 克隆

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重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体对家兔纤溶和凝血系统活性的影响 被引量：2

2

作者 董六一 范丽 +5 位作者 江勤 方明 岑德意 陈飞虎 智强 陈志武 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2004年第7期778-780,共3页

目的 :观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体 (reteplase ,Ret)对家兔纤溶和凝血系统活性的影响。方法 :采用常规方法测定家兔血液纤溶和凝血系统相关参数指标。结果 :Ret(3.75、7.5 0、15 .0MIU·kg-1)可明显降低纤溶酶原含量 ... 目的 :观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体 (reteplase ,Ret)对家兔纤溶和凝血系统活性的影响。方法 :采用常规方法测定家兔血液纤溶和凝血系统相关参数指标。结果 :Ret(3.75、7.5 0、15 .0MIU·kg-1)可明显降低纤溶酶原含量 ,使血浆纤维蛋白降解产物转呈阳性反应 ,缩短优球蛋白溶解时间 ,同时延长血浆凝血酶时间 ,凝血酶原时间及活化部分凝血活酶时间。结论 展开更多

关键词 重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体 组织型纤溶酶原激活剂 纤溶系统 凝血系统 家兔

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重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究 被引量：1

3

作者 朱镇华 孙自勇 +7 位作者 陈于红 张菁 王石泉 杨庆 刘莉莉 丁楅森 陈新园 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期7-15,共9页

　将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20%,表达产物经体外变复性、TI Sepharose亲和层析、SP Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得... 　将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20%,表达产物经体外变复性、TI Sepharose亲和层析、SP Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95%以上,比活大于500000IU/mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准.其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符.同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究. 展开更多

关键词 重组人组织型纤溶酶原激活剂 缺失变体 制备 发酵 活化 纯化 蛋白

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重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的药效学研究

4

作者 赵专友 刘厚孝 +5 位作者 张菁 陈于红 张巍 朱镇华 王石泉 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期16-27,共12页

　犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%... 　犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%、42.5%;心肌梗死范围明显缩小.血纤维蛋白原明显降解,凝血酶原时间、凝血酶时间及陶土激活部分凝血酶时间明显延长,但抗凝血酶活性无显著改变.伤口出血量增加,出血时间延长.以上指标与等剂量(5×105IU/kg)的德国BoehringerMannheimGmbH产品Retavase作用相似.离体家兔血小板凝集实验结果表明:重组人K2tPA对家兔血小板聚集功能具有明显的抑制作用. 展开更多

关键词 重组人组织型纤溶酶原激活剂 缺失变体 药效学 溶栓 纤维蛋白原 血小板聚集 心脑血管病

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重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体对猕猴的长期毒性研究

5

作者 董六一 左翔 +4 位作者 范丽 方明 陈飞虎 智强 陈志武 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期582-584,共3页

目的　观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(reteplase,Ret)的长期毒性作用。 方法　连续 14d给猕猴静脉注射不同剂量Ret。结果　Ret 8 0MIU·kg-1对猕猴不表现任何毒性作用 ,Ret 2 5 0、80 0MIU·kg-1组的血液RBC、HGB及... 目的　观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(reteplase,Ret)的长期毒性作用。 方法　连续 14d给猕猴静脉注射不同剂量Ret。结果　Ret 8 0MIU·kg-1对猕猴不表现任何毒性作用 ,Ret 2 5 0、80 0MIU·kg-1组的血液RBC、HGB及HCT均降低 ,部分猕猴粪便隐血试验阳性 ,血液生化学检查有TP下降 ,但这些指标在停药 14d时基本恢复正常。另外 ,所有给药猕猴出血时间均延长 ,但脏器系数和病理学未见有毒性变化。结论　Ret静脉注射 8 0MIU·kg-1是安全剂量 ,2 5 0、80 0MIU·kg-1两个剂量有一定的毒性反应 ,主要表现为贫血和出血 ,停药后毒性可以恢复。 展开更多

关键词 重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体 长期毒性 猕猴

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重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体对犬冠状动脉血栓的溶栓作用

6

作者 李春海 刘亚千 +2 位作者 陈华 智强 王喜群 《中国比较医学杂志》 CAS 2006年第9期518-521,F0002,共5页

目的观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(reteplase)对犬冠状动脉血栓的溶栓作用。方法实验用杂种犬,设溶剂对照组r、eteplase 100×104、50×104和25×104IU/kg 4组。手术分离冠状动脉左旋支(LCX),以血管内膜粗糙+电... 目的观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(reteplase)对犬冠状动脉血栓的溶栓作用。方法实验用杂种犬,设溶剂对照组r、eteplase 100×104、50×104和25×104IU/kg 4组。手术分离冠状动脉左旋支(LCX),以血管内膜粗糙+电刺激法形成冠状动脉左旋支血栓,检测静脉注射不同剂量reteplase后对冠状动脉左旋支血流量、栓塞再通率、心肌梗死范围、伤口失血量和末梢出血时间的影响。结果静脉注射reteplase可使栓塞的冠状动脉血管很快出现再通,血流量显著增加,心肌梗塞范围明显缩小,明显增加伤口出血量,延长末梢出血时间,rete-plase各剂量组与溶剂对照组比较均有显著差别(P<0.001)。结论reteplase对犬冠状动脉血栓具有显著的溶栓作用。 展开更多

关键词 重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体 冠状动脉 血流量 溶栓

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人组织型纤溶酶原激活剂转基因功能鸡蛋的研究及其活性分析

7

作者 李银聚 程相朝 +3 位作者 张春杰 吴庭才 杜瑞玲 余祖华 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第11期168-172,共5页

为探索人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在鸡卵黄中积淀的可行性,开发具有抗心血管疾病的功能性鸡蛋,应用分子生物学技术分别构建含有人t-PA基因和t-PA与鸡卵黄高磷蛋白融合基因的真核表达质粒pcDNA3-tPA和pPhosvitin-tPA,脂质体包裹后分... 为探索人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在鸡卵黄中积淀的可行性,开发具有抗心血管疾病的功能性鸡蛋,应用分子生物学技术分别构建含有人t-PA基因和t-PA与鸡卵黄高磷蛋白融合基因的真核表达质粒pcDNA3-tPA和pPhosvitin-tPA,脂质体包裹后分别注射于初产蛋鸡的肝脏,Western blotting和ELISA检测t-PA基因在鸡肝脏中的表达和在卵黄中的积淀情况,琼脂糖平板溶圈法检测期其活性。结果显示,注射重组质粒后7d,卵黄中有分子质量为63kD的t-PA积淀,表达可持续5周,高峰表达量分别为39.16mg/L和53.92mg/L;琼脂糖平板溶圈法检测其活性表明,卵黄中的t-PA具有激活组织纤溶酶的活性。实验证明了外源基因表达产物在卵黄中积淀这一途径的可行性。 展开更多

关键词 人组织型纤溶酶原激活剂 卵黄高磷蛋白 功能性食品 卵黄 转基因

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人组织型纤溶酶原激活剂牛乳腺生物反应器的研究 被引量：2

8

作者 安靓 李振林 +2 位作者 黄伟民 黄吴键 李进 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第5期546-548,552,共4页

目的构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)乳腺定位表达载体,使其在牛乳汁中高效表达,从而建立牛乳腺生物反应器。方法RT-TD-PCR法克隆目的基因,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含t-PA-cDAN的乳腺定位表达载体;采用显微注射法和乳腺注... 目的构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)乳腺定位表达载体,使其在牛乳汁中高效表达,从而建立牛乳腺生物反应器。方法RT-TD-PCR法克隆目的基因,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含t-PA-cDAN的乳腺定位表达载体;采用显微注射法和乳腺注射法将融合基因转入小鼠的受精卵和小鼠及牛的乳腺组织中。结果显微注射法和乳腺注射法转基因后,t-PA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论所构建的乳腺定位表达载体可有效地使t-PA基因在小鼠和牛乳汁中表达,t-PA基因的表达不受转基因方法的影响,但t-PA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量,提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异,可能受着不同的因素或调控系统的影响。 展开更多

关键词 组织型纤溶酶原激活剂 牛 乳腺生物反应器 基因定位表达 转基因动物

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EGF对小鼠角质形成细胞中组织型纤溶酶原激活剂表达的调节

9

作者 连小华 杨恬 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第9期1094-1097,共4页

目的　探讨小鼠表皮角质形成细胞 (KC)中 ,EGF对组织型纤溶酶原激活剂 (tPA)表达的影响。方法　应用免疫组化及原位杂交技术 ,结合图像分析 ,定性及定量检测在EGF作用下的小鼠表皮角质形成细胞中 ,tPAmRNA/蛋白质的表达。结果　小鼠表... 目的　探讨小鼠表皮角质形成细胞 (KC)中 ,EGF对组织型纤溶酶原激活剂 (tPA)表达的影响。方法　应用免疫组化及原位杂交技术 ,结合图像分析 ,定性及定量检测在EGF作用下的小鼠表皮角质形成细胞中 ,tPAmRNA/蛋白质的表达。结果　小鼠表皮KC经EGF处理 12、2 4、48、72h后 ,tPAmRNA/蛋白质的量均增加 (P <0 .0 1) ,tPAmRNA表达的高峰出现于EGF作用 2 4h时 ,tPA蛋白质表达的高峰则出现于EGF作用 48h时。EGF联合 0 .5、1.0、1.5mmol/LCa2 + 作用小鼠表皮KC 48h ,与EGF单独作用小鼠表皮KC 48h时 ,tPAmRNA/蛋白质的表达 ,均显著降低 (P <0 .0 0 1)。结论　小鼠表皮KC中 ,EGF可以时间依赖方式促进tPAmR NA/蛋白质的表达 ,但受Ca2 + 浓度的影响。 展开更多

关键词 TPA EGF 基因表达 调节 表皮角质形成细胞 组织型纤溶酶原激活剂

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致炎细胞因子诱导组织型纤溶酶原激活剂基因的表达

10

作者 姜颖 《国外医学（口腔医学分册）》 2003年第5期395-395,共1页

致炎细胞因子会引起并加重炎症级联反应,在组织损伤中起重要作用。炎症局部纤溶酶原被纤溶酶原激活剂(PA)活化成纤溶酶,纤溶酶可致纤维蛋白溶解,引起组织损伤。目前就牙髓根尖周疾病中通过组织型-PA(t-PA)蛋白水解途径致组织损伤的机制... 致炎细胞因子会引起并加重炎症级联反应,在组织损伤中起重要作用。炎症局部纤溶酶原被纤溶酶原激活剂(PA)活化成纤溶酶,纤溶酶可致纤维蛋白溶解,引起组织损伤。目前就牙髓根尖周疾病中通过组织型-PA(t-PA)蛋白水解途径致组织损伤的机制及致炎细胞因子的作用研究较少。本研究目的是确定在培养的人牙髓细胞、牙龈成纤维细胞中致炎细胞因子IL-1α和TNE-α对PA/纤维溶酶系统的作用。 材料和方法 拔除健康的阻生第三磨牙。 展开更多

关键词 致炎细胞因子 组织型纤溶酶原激活剂基因 基因表达 牙髓病 根尖周疾病

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组织型纤溶酶原激活剂促进小鼠坐骨神经血-神经屏障损伤后的修复

11

作者 凌长春 陶贤梅 +3 位作者 萧瑶 胡华 陈祖林 宋后燕 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期597-600,共4页

目的观察组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)对坐骨神经血-神经屏障损伤后修复的影响。方法选取野生型小鼠和t-PA基因敲除纯合子小鼠,利用持针器钳夹坐骨神经20 s。在损伤后第3,7,11,15天观察小鼠坐骨神经血-神... 目的观察组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)对坐骨神经血-神经屏障损伤后修复的影响。方法选取野生型小鼠和t-PA基因敲除纯合子小鼠,利用持针器钳夹坐骨神经20 s。在损伤后第3,7,11,15天观察小鼠坐骨神经血-神经屏障修复情况。采用尾静脉注射Evans Blue,观察野生型小鼠组和t-PA基因敲除小鼠组血-神经屏障渗透性的差异。利用免疫荧光和Western Blot观察两组小鼠损伤段坐骨神经血-神经屏障重要的组成性蛋白occludin的恢复情况。结果小鼠坐骨神经损伤后,t-PA基因敲除小鼠组血-神经屏障的通透性在损伤后第7,11,15天高于野生型小鼠组。免疫荧光及其Western Blot显示t-PA基因敲除延缓了坐骨神经损伤后occludin的表达。结论t-PA基因缺失对小鼠坐骨神经血-神经屏障损伤后的修复有一定的阻碍作用,与坐骨神经血-神经屏障损伤后,其组成性蛋白occludin的表达减少有关。 展开更多

关键词 组织型纤溶酶原激活剂基因敲除小鼠 坐骨神经损伤 血-神经屏障 紧密连接蛋白

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抗PAI抑制作用的组织纤溶酶原激活剂在大肠杆菌中的表达 被引量：5

12

作者 朱美财 占志 +3 位作者 王雅静 刘成刚 石缨 蔡庆 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期565-569,共5页

目的: 构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体.方法: 根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1～3和176～527位的截短式t-PA DNA序... 目的: 构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体.方法: 根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1～3和176～527位的截短式t-PA DNA序列; 并将该t-PA分子中的PAI-1结合位点,即第373～384位核苷酸(AAG CAC AGG AGG)突变为(GCG GCC GCG GCG),相应的氨基酸KHRR则变为AAAA.结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,将其克隆于大肠杆菌表达载体中,并在大肠杆菌中得到高效表达.表达蛋白占总菌体蛋白的30%,以包涵体形式存在.经蛋白质变性、复性,得到有活性的t-PA突变体.t-PA突变体与PAI-1反应后t-PA的活性未受到抑制.结论:t-PA突变体可能是一种用于治疗心肌梗死和脑血栓等血栓性疾病的强效且剂量要求低的新型生物工程药物. 展开更多

关键词 组织型纤溶酶原激活剂 突变体 基因克隆 表达 纯化

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中老年非瓣膜病心房颤动患者凝血-纤溶功能的变化

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作者 李曦 谢英 +10 位作者 张维君 温绍君 赵瑞祥 彭新界 张文 张妍 程秀琴 王龙华 刘洁琳 郭永和 周玉杰 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期461-464,共4页

目的:评价中老年非瓣膜病心房颤动(房颤)患者的凝血-纤溶功能。方法:选择92例中老年非瓣膜病房颤患者(房颤组)和60例窦性心律者(对照组),采用免疫比浊法测定血浆D-二聚体(D-Dimer)水平,采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA法)测定血浆... 目的:评价中老年非瓣膜病心房颤动(房颤)患者的凝血-纤溶功能。方法:选择92例中老年非瓣膜病房颤患者(房颤组)和60例窦性心律者(对照组),采用免疫比浊法测定血浆D-二聚体(D-Dimer)水平,采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA法)测定血浆组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及纤溶酶原激活剂抑制物1(PAI-1)水平。单因素分析方法分析两组间各指标的差异,对可能影响D-Dimer、t-PA、PAI-1水平的性别、年龄和血清肌酐、尿酸、血糖、甘油三酯、胆固醇等因素采用协方差方法分析。结果:①单因素分析,房颤组D-Dimer[(0.16±0.10)mg.L-1]、t-PA[(42.58±30.28)μg.L-1]和PAI-1[(86.03±21.43)μg.L-1]水平均显著高于对照组[(0.10±0.08)mg.L-1,(26.02±13.84)μg.L-1和(64.94±24.35)μg.L-1]。房颤组PAI-1/t-PA比值略高于对照组(P>0.05)。②多因素分析调整影响因素后,房颤组D-Dimer(P=0.047)、t-PA(P=0.264)和PAI-1(P=0.001)水平仍高于对照组,但t-PA差异无显著性(P>0.05)。结论:中老年非瓣膜病房颤患者存在凝血-纤溶系统失衡,血液处于高凝、低纤溶状态。 展开更多

关键词 心房颤动/血液 D-二聚体 组织型纤溶酶原激活物 纤溶酶原激活剂抑制物1

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