铁镍磁性微球直接纯化组氨酸标签蛋白 被引量：2

1

作者 刘宝全 张停停 +5 位作者 鲍丽 吕晓菊 王佳宁 张艳梅 王剑锋 范圣第 《化学研究与应用》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1569-1573,共5页

以氯化铁与硫酸镍为主要原料基于热分解法原理一锅法合成铁镍磁性微球。氯化铁、硫酸镍和乙酸钠在(80℃)乙二醇中搅拌30 min,在氮气保护下,加入乙醇胺后180℃搅拌6h,经过水清洗与乙醇清洗后获得有磁性的含镍微球,XRD检测结果证实晶型为N... 以氯化铁与硫酸镍为主要原料基于热分解法原理一锅法合成铁镍磁性微球。氯化铁、硫酸镍和乙酸钠在(80℃)乙二醇中搅拌30 min,在氮气保护下,加入乙醇胺后180℃搅拌6h,经过水清洗与乙醇清洗后获得有磁性的含镍微球,XRD检测结果证实晶型为Ni Fe2O4,晶体的平均粒径为6.75 nm。磁性微球不经任何修饰直接与组氨酸标签蛋白结合,完成带有组氨酸标签的绿色荧光蛋白纯化,SDS-PAGE检测结果表明:使用5倍于镍配位凝胶质量的铁镍磁性微球可达到与镍配位凝胶相近的蛋白质吸附量。低成本的铁镍磁性微球可以替代镍配位凝胶用于组氨酸标签蛋白的分离纯化。 展开更多

关键词 铁镍磁性微球 热分解法 组氨酸标签 蛋白纯化

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栓菌漆酶的异源表达及重组酶碳端和氮端组氨酸标签修饰对酶学特性的影响 被引量：2

2

作者 刘英丽 刘骏明 +2 位作者 王静 孙宝国 THIERRY Tron 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第21期143-148,共6页

以来源Trametes sp.C30的LAC3漆酶基因为研究对象,通过引物设计进行突变,在其C端和N端进行延长,分别引入6个组氨酸标签,并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中,将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性... 以来源Trametes sp.C30的LAC3漆酶基因为研究对象,通过引物设计进行突变,在其C端和N端进行延长,分别引入6个组氨酸标签,并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中,将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性质的影响较大。C端引入组氨酸标签的重组酶的表达量不受影响,但是在N末端引入组氨酸标签的重组酶表达量只有LAC3的一半。添加组氨酸标签的融合蛋白对ABTS和SGZ两种底物的亲和力得到增强。而在酸碱稳定性耐受方面,与LAC3相比,N末端氨基酸的改变使其在酸碱稳定性方面得到了增强,中碱性条件下仍能保持较佳活性。C端和N端可塑性的研究对于漆酶新性状的获得具有重要意义。 展开更多

关键词 漆酶 异源表达 组氨酸标签 碳端 氮端

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应用改进的多聚组氨酸标签T7表达载体构建肺癌cDNA文库 被引量：1

3

作者 董晓民 钟理 +1 位作者 樊江平 张旭朏 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期475-481,共7页

应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便.为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位... 应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便.为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位点的3'端引入6聚组氨酸筛选标签,经包装后挑取成功表达的单克隆构建肺癌cDNA文库.经镍柱亲和层析后,收集文库中表达组氨酸的克隆,利用化学发光免疫试验进行筛选效果鉴定.结果显示,改造的新型载体可成功表达组氨酸标签,以此构建的肺癌cDNA文库经筛选后,含ORF插入的克隆由筛前的6%提高至70%,本研究为提高cDNA文库的质量提供了一种简便可行的方法. 展开更多

关键词 组氨酸标签 T7噬菌体展示文库 开放阅读框

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带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建

4

作者 温建新 仇华吉 +3 位作者 涂亚斌 王柳 彭金美 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期193-195,共3页

马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题。本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入Nsp... 马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题。本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266_HIS。将pOK8266_HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子。提取pOK8266_HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础。本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制。 展开更多

关键词 马传染性贫血病毒 感染性分子克隆 组氨酸标签 马 传染性贫血 S2基因

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用于分离纯化组氨酸标签蛋白质的磁性复合纳米材料的制备 被引量：2

5

作者 王文静 孙宏浩 郭惠玲 《应用化工》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期294-297,共4页

采用溶剂热法制备Fe_3O_4纳米粒子,通过MPS和聚丙烯酸修饰,使其表面羧基化,再与NTA-Ni^(2+)螯合,制备Fe_3O_4/MPS/PAA/NTA-Ni^(2+)磁性复合纳米粒子。利用透射电镜、激光粒度仪、红外光谱进行表征。结果表明,Fe_3O_4/MPS/PAA/NTA-Ni^(2+... 采用溶剂热法制备Fe_3O_4纳米粒子,通过MPS和聚丙烯酸修饰,使其表面羧基化,再与NTA-Ni^(2+)螯合,制备Fe_3O_4/MPS/PAA/NTA-Ni^(2+)磁性复合纳米粒子。利用透射电镜、激光粒度仪、红外光谱进行表征。结果表明,Fe_3O_4/MPS/PAA/NTA-Ni^(2+)磁性复合纳米粒子的形貌为球形,且较为分散,其平均水合粒径为440 nm,Zeta电位为-15.8 mV,红外光谱证实了其化学结构。对组氨酸标签蛋白的分离能力为15.6μg蛋白质/mg磁性材料,说明此金属螯合吸附剂对组氨酸标签蛋白的选择性吸附有一定的意义。 展开更多

关键词 FE3O4纳米粒子 组氨酸标签蛋白质 分离

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含组氨酸纯化标签的假病毒表达载体的构建与应用 被引量：7

6

作者 肖性龙 余以刚 +2 位作者 翟建新 李惠芳 吴晖 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期687-692,共6页

为了RNA类病毒进行核酸检测提供一种更稳定、更方便的全程监控技术,本文研究了含组氨酸纯化标签的假病毒监控内标和阳性对照的制备方法.通过基因工程手段将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,成功构建带组氨酸纯化标签... 为了RNA类病毒进行核酸检测提供一种更稳定、更方便的全程监控技术,本文研究了含组氨酸纯化标签的假病毒监控内标和阳性对照的制备方法.通过基因工程手段将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,成功构建带组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体.外源基因序列插入载体后,经诱导表达与镍离子亲和层析纯化后,可获得高浓度、高纯度的假病毒,在4℃和-20℃条件下,可用SM缓冲液稳定保存1年以上. 展开更多

关键词 假病毒 组氨酸标签 表达载体 检测

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多聚组氨酸融合标签在蛋白药物开发中的应用 被引量：7

7

作者 阮建兵 梅艳珍 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期49-53,共5页

纯化技术是制约蛋白质药物开发及其产业化的关键技术之一。构建多聚组氨酸标签融合蛋白,采用固定金属离子亲和层析进行纯化,是一种高效的蛋白质纯化策略。介绍多聚组氨酸融合标签在蛋白质药物开发中的应用基础和应用概况,分析多聚组氨... 纯化技术是制约蛋白质药物开发及其产业化的关键技术之一。构建多聚组氨酸标签融合蛋白,采用固定金属离子亲和层析进行纯化,是一种高效的蛋白质纯化策略。介绍多聚组氨酸融合标签在蛋白质药物开发中的应用基础和应用概况,分析多聚组氨酸标签在融合蛋白中的位置对亲和层析纯化的影响,总结常用的多聚组氨酸融合表达方式,并对其融合表达样品的预处理、亲和层析纯化条件及其对目的蛋白药物药用安全性和有效性的影响进行探讨。 展开更多

关键词 多聚组氨酸标签 融合蛋白 蛋白药物

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含组氨酸蛋白标签的蓝舌病假病毒物质构建及定量分析 被引量：1

8

作者 邓俊花 林祥梅 +2 位作者 张永宁 王彩霞 吴绍强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第9期68-73,共6页

基于蓝舌病(bluetongue,BT)的危害及RNA阳性质控品研制的重要性,试验将pTrcHis-MS2质粒借助点突变技术在噬菌体外壳蛋白15和16氨基酸之间插入组氨酸(His)蛋白标签,构建了pTrcMS载体。将pMD19-T-BTV质粒与pTrcMS质粒分别进行KpnⅠ和Hind... 基于蓝舌病(bluetongue,BT)的危害及RNA阳性质控品研制的重要性,试验将pTrcHis-MS2质粒借助点突变技术在噬菌体外壳蛋白15和16氨基酸之间插入组氨酸(His)蛋白标签,构建了pTrcMS载体。将pMD19-T-BTV质粒与pTrcMS质粒分别进行KpnⅠ和HindⅢ双酶切,然后连接构建pTrcMS-BTV重组质粒。将pTrcMS-BTV重组菌进行原核表达,产物借助偶联His蛋白标签的磁珠捕获技术获得纯化的蓝舌病假病毒颗粒,进行特性鉴定并定量。结果显示,研制的pTrcMSBTV物质经PCR方法评价纯度高,无基因DNA污染;透射电镜观察形态为不规则的直径约为26nm的多边形;RT-PCR方法检测稳定性表明该物质耐RNase A,易保存;应用荧光RT-PCR检测表明该物质溶液最低检测限可达到2.5×102拷贝/mL。蓝舌病假病毒物质将为蓝舌病分子生物学检测提供阳性质控物质。 展开更多

关键词 蓝舌病 假病毒物质 组氨酸蛋白标签 纯化 定量

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磺化修饰结合离子交换色谱和生物质谱富集鉴定含组氨酸肽段 被引量：1

9

作者 曹冬 周春喜 +3 位作者 张养军 韩春光 邓玉林 钱小红 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期158-163,共6页

通过在肽段的N端引入磺酸基,从而使含组氨酸的肽段与其他肽段在pH<3.0的条件下产生电荷差异,建立了一种基于强阳离子交换色谱(SCX)结合生物质谱富集鉴定含组氨酸肽段的方法,并以含有组氨酸的标准蛋白质为模型,进行了方法学考察。结... 通过在肽段的N端引入磺酸基,从而使含组氨酸的肽段与其他肽段在pH<3.0的条件下产生电荷差异,建立了一种基于强阳离子交换色谱(SCX)结合生物质谱富集鉴定含组氨酸肽段的方法,并以含有组氨酸的标准蛋白质为模型,进行了方法学考察。结果表明,经N端磺酸化后,含组氨酸的肽段能有效地被阳离子交换色谱富集,且在肽的N端引入磺酸基促进了肽的裂解,使之产生简单而信息丰富的二级质谱图,从而得到完美的质谱鉴定结果。这说明磺化修饰结合强阳离子交换色谱用于含组氨酸肽段的富集鉴定是可行的,且具有在蛋白质组研究中应用的潜力。 展开更多

关键词 强阳离子交换色谱 基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱 磺化修饰 富集 鉴定 组氨酸标签肽

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含非洲马瘟病毒部分核酸序列的病毒样颗粒的研制 被引量：1

10

作者 孙敏 梁成珠 +4 位作者 王群 张晓文 肖西志 耿娟 陈吉祥 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期637-643,共7页

VP7蛋白是非洲马瘟病毒(AHSV)群特异性蛋白,其编码基因S7基因常被用作AHSV RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测的靶标基因。本研究旨在构建耐RNase的内含AHSV部分核酸序列的病毒样颗粒。首先合成S7基因保守序列,然后克隆到含有噬菌体包膜蛋白... VP7蛋白是非洲马瘟病毒(AHSV)群特异性蛋白,其编码基因S7基因常被用作AHSV RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测的靶标基因。本研究旨在构建耐RNase的内含AHSV部分核酸序列的病毒样颗粒。首先合成S7基因保守序列,然后克隆到含有噬菌体包膜蛋白基因的带组氨酸纯化标签的假病毒表达载体pNH-MS2his上,成功构建原核表达载体pNH-MS2his-VP7。将重组质粒pNH-MS2his-VP7转化BL21(DE3),并进行诱导表达及镍离子亲和层析纯化后,得到含AHSV部分RNA片段的病毒样颗粒。试验证实该病毒样颗粒均匀性和稳定性良好,可作为AHSV PCR检测的质控品和标准品使用。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 组氨酸标签 病毒样颗粒 检测

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DNA的G四链体抗体的制备和鉴定 被引量：1

11

作者 张毅强 兰晓瑜 +7 位作者 王爽 李美宁 刘志荣 申金雁 师帅帅 张悦红 解军 程牛亮 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期977-981,共5页

目的构建DNA的G四链体抗体的原核表达质粒，利用BL21（DE3）菌表达此抗体，并进行纯化及鉴定。方法化学合成DNA的G四链体抗体的基因BC,4，插入以pET-26b（＋）为骨架构建的载体pSANGl0中，构建DNA的G四链体抗体表达载体pSANGl0-BG4。以... 目的构建DNA的G四链体抗体的原核表达质粒，利用BL21（DE3）菌表达此抗体，并进行纯化及鉴定。方法化学合成DNA的G四链体抗体的基因BC,4，插入以pET-26b（＋）为骨架构建的载体pSANGl0中，构建DNA的G四链体抗体表达载体pSANGl0-BG4。以大肠杆菌B121（DE3）为宿主菌进行该抗体的自诱导表达，渗透压裂解法收集此抗体，并经His亲和层析纯化，用SDS-PAGE及Western blot法鉴定此抗体，并在SW480结肠癌细胞中验证此抗体功能。结果DNA的G四链体抗体表达载体经双酶切及基因测序鉴定构建成功。该抗体相对分子质量（M1）为30000～37000，以可溶性的形式表达于BL21菌细胞间质，表达产物与目的蛋白大小一致。结论成功制备了DNA的G四链体抗体。 展开更多

关键词 G四链体 原核表达载体 组氨酸标签

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构建的Flt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达 被引量：1

12

作者 卢宏松 徐丽慧 +2 位作者 施焕敬 韩捷 何贤辉 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期331-335,共5页

目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法:依据Flt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Flt3L基因并构建其... 目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法:依据Flt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Flt3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定。结果:克隆到Flt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的Flt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21(ED3)中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的Flt3L胞外域蛋白的相对分子质量(Mr)为19 000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应。结论:成功克隆Flt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。 展开更多

关键词 FMS样酪氨酸激酶3配体 胞外域 原核表达 组氨酸标签

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牛乳素真核表达载体的构建 被引量：1

13

作者 张瑜 马凤龙 +2 位作者 刘焕珍 乔彦良 赵玉军 《湖北农业科学》 北大核心 2008年第5期501-502,570,共3页

以牛乳素为目的基因,构建含有组氨酸标签、人生长激素信号肽的真核表达载体,为利用牛乳素在活体动物及培养细胞中的表达提供基因材料。用人工合成hGH-Lacf B的序列与T载体连接,用Xho I和BamH I酶切后与相应酶切处理的pVAX1连接,取阳性... 以牛乳素为目的基因,构建含有组氨酸标签、人生长激素信号肽的真核表达载体,为利用牛乳素在活体动物及培养细胞中的表达提供基因材料。用人工合成hGH-Lacf B的序列与T载体连接,用Xho I和BamH I酶切后与相应酶切处理的pVAX1连接,取阳性克隆质粒,用EcoR I和Xho I酶切回收含hGH的pVAX1载体,再与经过PCR扩增的his-Lacf B连接,酶切鉴定及测序。DNA序列分析表明,携带hGH、6×his和目的基因Lacf B已成功连接到真核表达载体pVAX1中。 展开更多

关键词 牛乳素 组氨酸标签 人生长激素信号肽 真核表达

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日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶原核表达载体的构建及序列分析 被引量：1

14

作者 方桂杰 乔宪凤 《江西农业学报》 CAS 2010年第11期8-10,14,共4页

为构建带有组氨酸标签(his-tag)的日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(sjGST)表达载体。以载有sjGST基因的载体PGEX-KG为模板,PCR扩增sjGST基因,并在进行酶切和基因测序后将其克隆到pET28a载体上。运用生物学软件与具有代表性的血吸虫GST基因... 为构建带有组氨酸标签(his-tag)的日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(sjGST)表达载体。以载有sjGST基因的载体PGEX-KG为模板,PCR扩增sjGST基因,并在进行酶切和基因测序后将其克隆到pET28a载体上。运用生物学软件与具有代表性的血吸虫GST基因进行比对并对可能的表达产物进行分析。结果表明,PCR产物与3种sjGST基因有99%的同源性。重组载体构建成功。 展开更多

关键词 日本血吸虫 谷胱甘肽硫转移酶 原核 表达载体的构建 序列分析 SCHISTOSOMA JAPONICUM Sequence Analysis 基因测序 重组载体构建 组氨酸标签 生物学软件 表达产物 PCR产物 HIS-TAG GST基因 同源性 代表性 pET28a 模板 酶切

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硫酸软骨素裂解酶ABCⅡ的高效融合表达及其酶学性质研究

15

作者 李晔 周朝 袁其朋 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2023年第5期88-97,共10页

目的:本研究旨在实现硫酸软骨素裂解酶ABCⅡ(chondroitinase ABCⅡ,ChSase ABCⅡ)的高效可溶性表达并研究其酶学性质,为ChSase ABCⅡ在药品和保健食品生产中的应用奠定基础。方法:在优化ChSase ABCⅡ基因原始序列的基础上,构建重组质粒p... 目的:本研究旨在实现硫酸软骨素裂解酶ABCⅡ(chondroitinase ABCⅡ,ChSase ABCⅡ)的高效可溶性表达并研究其酶学性质,为ChSase ABCⅡ在药品和保健食品生产中的应用奠定基础。方法:在优化ChSase ABCⅡ基因原始序列的基础上,构建重组质粒pET-28a-His-ChSase ABCⅡ并优化其表达条件;利用亲和层析得到带有多聚组氨酸标签(polyhistidine-tag,His-tag)的ChSase ABCⅡ融合蛋白后,研究了His-ChSase ABCⅡ的部分酶学性质。结果:构建的His-ChSase ABCⅡ融合蛋白表达系统能在大肠杆菌中实现可溶性表达;在表达宿主为E.coli BL21(DE3)和诱导剂(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度为125μmol/L的优化条件下,发酵液酶活力可达到7206.83±184.27 IU/L;纯化后的His-ChSase ABCⅡ酶比活力为22.02±0.39 IU/mg蛋白,最适pH和温度分别为7.5和40℃,其在30~40℃条件下较为稳定,且半衰期在2 h以上。His-ChSase ABCⅡ能特异性有效分解硫酸软骨素,其K_(m)值为10.4±0.8μmol/L,Kcat值为9.4±0.2 s^(-1)。结论:本论文通过基因优化和融合表达等策略实现了His-ChSase ABCⅡ的高效表达和纯化。此外,His-ChSase ABCⅡ的酶学性质可基本满足其在医药和营养产品工业生产中的应用需求。 展开更多

关键词 硫酸软骨素裂解酶ABCⅡ 低分子量硫酸软骨素(LMWCSs) 酶学性质 融合表达 多聚组氨酸标签

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非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量：6

16

作者 荣明轩 徐保娟 +9 位作者 南文龙 范根成 李国攀 王席 陈清清 胡基雄 李欢 谢明 张志翔 荣俊 《中国动物检疫》 CAS 2021年第5期109-118,共10页

为建立一种检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA(iELISA)方法,对构建的ASFV P30基因表达工程菌诱导表达后,将获取的重组ASFV P30蛋白进行纯化和Western-blot检测,然后以纯化的重组蛋白为抗原,建立了ASFV抗体iELISA检测方法,并进行了... 为建立一种检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA(iELISA)方法,对构建的ASFV P30基因表达工程菌诱导表达后,将获取的重组ASFV P30蛋白进行纯化和Western-blot检测,然后以纯化的重组蛋白为抗原,建立了ASFV抗体iELISA检测方法,并进行了特异性、灵敏性、重复性试验;同时与基于ASFV P30-2His6蛋白(N、C末端各融合1个His6标签)的iELISA方法进行兽医临床样本比较试验。结果显示:重组ASFV P30蛋白和重组ASFV P30-2His6蛋白在Western-blot检测中,均能与猪ASFV阳性血清产生特异性杂交带;基于重组ASFV P30蛋白iELISA的最佳反应条件为,抗原蛋白包被质量浓度20μg/mL、血清样品稀释度1:1000、酶标二抗稀释度1:40000、血清样品检测OD450阳性结果临界值0.22。该方法仅对ASFV阳性血清呈特异性反应,1:3200稀释的阳性血清仍可检出,批内试验和批间试验变异系数均小于10%,可以消除His标签所造成的假阳性反应。本研究建立的ASFV P30 iELISA检测方法为ASFV抗体检测提供了一种有效手段。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 原核表达 P30蛋白 间接ELISA 组氨酸标签 抗体检测

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低温脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达研究 被引量：2

17

作者 刘羽 王能飞 +2 位作者 黄亦钧 林学政 沈继红 《海洋科学进展》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期155-162,共8页

将已有的低温脂肪酶基因克隆至表达载体pPICZα上,并转化毕赤酵母X-33。在低温条件下诱导培养6d后,发酵液中可检测到低温脂肪酶活力。重组酵母发酵液加入二硫苏糖醇后单位酶活力达到32U/mL,与未加入该试剂的原始菌株相比提高4倍以上。... 将已有的低温脂肪酶基因克隆至表达载体pPICZα上,并转化毕赤酵母X-33。在低温条件下诱导培养6d后,发酵液中可检测到低温脂肪酶活力。重组酵母发酵液加入二硫苏糖醇后单位酶活力达到32U/mL,与未加入该试剂的原始菌株相比提高4倍以上。对重组脂肪酶的酶学性质研究表明,其最适pH为8.0,最适温度为35℃,50℃温浴30min后,仍有30.04%的活性。以不同碳链长度的4-Nitrophenyl Ester为底物检测其底物特异性,结果显示其较适合作用于短链底物。重组酵母能够在BMMY培养基中胞外分泌表达带有His标签的重组脂肪酶,经镍柱纯化后,SDS-PAGE检测可得到大约35kDa的单一蛋白质条带。 展开更多

关键词 低温脂肪酶 重组蛋白 毕赤酵母 组氨酸标签

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葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究 被引量：2

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作者 洪流 郎君超 +2 位作者 贺冬梅 刘坤锋 吴洁 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期214-219,共6页

为获得纯度较高的葡萄球菌核酸酶(SNase)以研究其与糖尿病的关系,构建基因工程表达菌E.coli BL21/p ET28aHis-SNase,诱导其表达可溶性胞外蛋白,并对纯化的SNase进行初步性质研究。采用分子生物学方法设计和构建含有SNase基因的表达载体p... 为获得纯度较高的葡萄球菌核酸酶(SNase)以研究其与糖尿病的关系,构建基因工程表达菌E.coli BL21/p ET28aHis-SNase,诱导其表达可溶性胞外蛋白,并对纯化的SNase进行初步性质研究。采用分子生物学方法设计和构建含有SNase基因的表达载体pET28a-His-SNase,再转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞。经过乳糖诱导表达、超声破碎及镍柱亲和色谱等纯化步骤后,以SDS-PAGE和Western blot鉴定His-SNase,并对其性质进行了初步研究。结果表明,乳糖诱导后HisSNase能高效表达,亲和色谱后纯度高达85%以上,且其具备较高的核酸酶活性,作用pH范围较广,有很好的耐热性。本研究为进一步探究葡萄球菌核酸酶与糖尿病的关系奠定了基础。 展开更多

关键词 糖尿病 葡萄球菌核酸酶 组氨酸标签 分离纯化

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SARS冠状病毒NS融合蛋白的重组表达纯化与免疫学性质分析(英文) 被引量：1

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作者 贾汝静 袁志宏 +4 位作者 赵金存 王炜 赵振东 高晓明 徐晓军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期748-755,共8页

刺突蛋白(S)和核心蛋白(N)是SARS冠状病毒的主要结构蛋白.在病毒细胞受体结合和病毒包装过程起重要作用.重组融合表达这2种蛋白具有较高的诊断学价值.对SARS病毒N蛋白和S蛋白氨基酸序列进行计算机分析,选择含有优势抗原表位的N蛋白1～22... 刺突蛋白(S)和核心蛋白(N)是SARS冠状病毒的主要结构蛋白.在病毒细胞受体结合和病毒包装过程起重要作用.重组融合表达这2种蛋白具有较高的诊断学价值.对SARS病毒N蛋白和S蛋白氨基酸序列进行计算机分析,选择含有优势抗原表位的N蛋白1～227位氨基酸片段和S蛋白450～650位氨基酸片段,采用序列重叠延伸策略(sequenceoverlappingextension,SOE)构建编码N1227LinkerS450650新型融合蛋白的基因片段,导入原核表达载体,实现融合蛋白在大肠杆菌的高效表达.利用组氨酸标签亲和层析的方法纯化,获得高纯度的融合蛋白.对该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,其免疫化学性质均无显著改变.采用ELISA和Western印迹方法对其识别SARS冠状病毒特异性抗体的能力进行初步鉴定,显示该融合蛋白具有较好的抗原性和特异性,可有效特异性地检测恢复期SARS病人血清中抗SARS冠状病毒结构蛋白的抗体,可以作为SARS冠状病毒感染的辅助诊断手段. 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 组氨酸标签 抗原性 酶联免疫吸附实验

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硫氧还蛋白-(His)_ 6 融合的瑞替普酶的表达、纯化和活性检测(英文) 被引量：5

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作者 张新元 廖建民 +1 位作者 孙石静 沈子龙 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期374-378,共5页

目的 :构建硫氧还蛋白 (His) 6 瑞替普酶融合表达载体 ,提高瑞替普酶在大肠杆菌中的表达量 ,简化rPA的分离纯化。方法 :将rPA基因克隆于原核表达载体pET32a硫氧还蛋白 (组氨酸 ) 6标签下游 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中用乳糖进行诱导表... 目的 :构建硫氧还蛋白 (His) 6 瑞替普酶融合表达载体 ,提高瑞替普酶在大肠杆菌中的表达量 ,简化rPA的分离纯化。方法 :将rPA基因克隆于原核表达载体pET32a硫氧还蛋白 (组氨酸 ) 6标签下游 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中用乳糖进行诱导表达。采用一步稀释法对融合蛋白体外复性后 ,使用Ni2 + 亲和层析柱 ,对包涵体复性液进行初步纯化。采用体外溶圈法对复性后和纯化后的融合蛋白进行生物活性的测定。结果 :得到分子量约为 5 6kDa的融合蛋白 ,表达量达到总蛋白的 30 %以上。比本实验室构建的非融合表达载体表达量提高了约 5 0 %。经过一步Ni2 + 亲和层析 ,融合蛋白纯度达到80 %以上。体外溶圈法实验表明融合蛋白复性后和纯化后具有溶栓活性。结论 :与非融合表达相比 ,融合表达的表达量明显提高。即使N端额外融合一段融合多肽 ,rPA仍然具有生物学活性。 展开更多

关键词 硫氧还蛋白 (组氨酸)6标签 瑞替普酶 融合蛋白 表达 纯化 活性

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