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高温需求因子A2在神经毒素诱导的线粒体未折叠蛋白反应中的作用
1
作者 陈枝挺 付青贤 +1 位作者 陈丽娜 叶钦勇 《中国神经精神疾病杂志》 北大核心 2025年第7期413-419,共7页
目的探讨高温需求因子A2(high-temperature requirement factor A2,HTRA2)在神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP^(+))诱导的线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)模型中的作... 目的探讨高温需求因子A2(high-temperature requirement factor A2,HTRA2)在神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP^(+))诱导的线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)模型中的作用及其他蛋白酶的代偿作用。方法采用MPP^(+)干预SH-SY5Y细胞,构建mtUPR细胞模型,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞存活率,透射电镜观察线粒体的形态变化,荧光显微镜观察细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,免疫印迹(Western blot,WB)检测转录因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、热休克蛋白E1(homo sapiens heat shock protein family E member 1)、蛋白酶YME1样三磷酸腺苷酶(YME1 like 1 ATPase,YME1L1)、酪蛋白水解线粒体基质肽酶蛋白水解亚基(caseinolytic mitochondrial matrix peptidase proteolytic subunit,CLPP)和线粒体离子肽酶1(lon peptidase 1,mitochondrial,LONP1)的表达。慢病毒敲减(knock down,KD)SH-SY5Y细胞的HTRA2基因,实时荧光定量PCR法和WB法分别检测HTRA2的mRNA和蛋白的表达。用400μmol/L MPP^(+)诱导HTRA2-KD的SH-SY5Y细胞的mtUPR反应,CCK-8法检测细胞存活率改变,WB检测HTRA2、YME1L1、CLPP和LONP的表达改变。结果400μmol/L MPP^(+)干预SH-SY5Y细胞24 h构建了mtUPR细胞模型,SH-SY5Y细胞生存率与对照组相比无明显改变,透射电子显微镜下mtUPR组的线粒体嵴及大小未发生明显变化,mtUPR组的ROS平均荧光强度是PBS组的(1.25±0.08)倍,差别有统计学意义(P=0.001),mtUPR组的CHOP、HSPE1、HTRA2、CLPP和LONP的表达水平较对照组明显升高,分别为对照组的(2.68±0.94)倍、(2.83±0.89)倍、(1.67±0.20)倍、(1.65±0.28)倍和(1.66±0.13)倍,差别有统计学意义(均P<0.05),mtUPR组的YME1L1表达水平为对照组的(1.28±0.27)倍,差异无统计学意义(P>0.05)。慢病毒敲减SH-SY5Y细胞的HTRA2基因后,CLPP、YME1L1和LONP1的表达水平升高,分别为空病毒组的(1.46±0.79)倍、(1.41±0.12)倍和(1.32±0.25)倍(均P<0.05)。敲减SH-SY5Y细胞的HTRA2基因再予400μmol/L MPP^(+)干预SH-SY5Y细胞24 h,HTRA2组的SH-SY5Y细胞生存率下降为空病毒组88.4%±6.1%(P<0.001)。HTRA2组的YME1L1和LONP1的表达水平与空病毒组比较无明显改变(均P>0.05),CLPP表达空病毒组的(1.88±0.62)倍,差别有统计学意义(P=0.033)。结论HTRA2是MPP^(+)诱导mtUPR反应的重要的线粒体蛋白酶,其他线粒体蛋白酶有部分代偿HTRA2的作用。 展开更多
关键词 高温需求因子A2 线粒体未折叠蛋白反应 帕金森病 1-甲基-4-苯基吡啶离子 基因敲减技术
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线粒体融合蛋白-1对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响 被引量：4
2
作者 翟启明 李蓓 +2 位作者 刘露 张青 金钫 《实用口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期172-177,共6页
目的:比较正常及炎症来源的牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)中线粒体融合蛋白-1(mitofusion 1,Mfn1)的表达差异及其对PDLSCs成骨分化的影响。方法:分离培养PDLSCs,分别为正常来源(HPDLSCs)、牙周炎来源(P-PDLSCs... 目的:比较正常及炎症来源的牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)中线粒体融合蛋白-1(mitofusion 1,Mfn1)的表达差异及其对PDLSCs成骨分化的影响。方法:分离培养PDLSCs,分别为正常来源(HPDLSCs)、牙周炎来源(P-PDLSCs)及应用IL-1β模拟炎症微环境诱导牙周膜干细胞(H-PDLSCs+IL-1β)。RT-PCR方法检测对比H-PDLSCs与P-PDLSCs、H-PDLSCs与H-PDLSCs+IL-1β中Mfn1表达差异;RT-PCR检测成骨基因、茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量,对比P-PDLSCs及si Mfn1下调Mfn1表达后的成骨分化能力。结果:与H-PDSLCs组相比,P-PDSLCs组及H-PDLSCs+IL-1β组中Mfn1表达量显著升高(P<0.05);si Mfn1下调P-PDSLCs中Mfn1表达量后,其成骨分化能力增强(P<0.05)。结论:炎症微环境下,PDLSCs中Mfn1表达量升高,导致成骨分化能力下降。 展开更多
关键词 牙周膜干细胞 炎症微环境 线粒体融合蛋白-1(mfnl) 成骨分化
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桃叶珊瑚苷通过PINK1/Parkin通路促进缺血性脑卒中大鼠线粒体自噬
3
作者 李洁 李元 +5 位作者 周美云 邓炎尧 林芳波 万慧伟 宋炯 梁俊俊 《神经解剖学杂志》 北大核心 2025年第3期335-341,共7页
目的:探讨桃叶珊瑚苷(AU)调节PTEN诱导激酶蛋白1(PINK1)/细胞质E3-泛素连接酶(Parkin)信号通路对缺血性脑卒中(IS)大鼠海马线粒体自噬的影响。方法:通过大脑中动脉阻塞法(MCAO)建立IS大鼠模型,并随机分为IS组、低剂量AU组(AU-L)、中剂... 目的:探讨桃叶珊瑚苷(AU)调节PTEN诱导激酶蛋白1(PINK1)/细胞质E3-泛素连接酶(Parkin)信号通路对缺血性脑卒中(IS)大鼠海马线粒体自噬的影响。方法:通过大脑中动脉阻塞法(MCAO)建立IS大鼠模型,并随机分为IS组、低剂量AU组(AU-L)、中剂量AU组(AU-M)、高剂量AU组(AU-H)以及高剂量AU联合3-MA组(AU-H+3-MA),以不结扎的大鼠为Sham组,Zea Longa评分评估大鼠神经功能;TTC染色检测脑梗塞体积比;制备海马组织切片,透射电镜观察海马线粒体超微结构、免疫组化检测线粒体自噬蛋白-微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、p62变化;TUNEL法检测海马组织凋亡;Western blot检测海马组织中PINK1/Parkin相关蛋白表达。结果:IS大鼠神经功能评分增加(P<0.05),TTC染色观察到脑梗死,同时观察到海马组织中线粒体自噬蛋白p62表达上调(P<0.05),LC3B表达下调(P<0.05),自噬小体数量减少(P<0.05),海马组织中细胞凋亡增加(P<0.05),海马组织中PINK1、ARKIN蛋白表达下调(P<0.05),AU干预后,可降低大鼠神经功能评分,减轻脑梗塞体积百分比,同时下调海马组织中p62阳性表达(P<0.05),上调LC3B阳性表达(P<0.05),增加自噬小体数量(P<0.05),降低海马组织中细胞凋亡(P<0.05),上调海马组织中PINK1、ARKIN蛋白表达(P<0.05),3-MA阻断了AU的治疗作用,加重大鼠神经损伤。结论:AU通过激活PINK1/Parkin信号通路,促进海马线粒体自噬,改善IS大鼠神经损伤。 展开更多
关键词 缺血性脑卒中(IS) PTEN诱导激酶蛋白1(PINK1)/细胞质E3-泛素连接酶(Parkin)信号通路 线粒体自噬 桃叶珊瑚苷(AU) 大鼠
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人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的构建和表达 被引量：6
4
作者 刘荣 姜文国 +5 位作者 刘芳 张砚君 范冬梅 杨铭 熊冬生 杨纯正 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期543-545,549,共4页
目的:构建和表达人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并测定该融合蛋白的生物学活性。方法:采用PCR和ovelap PCR方法构建人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用150g/L SDS-... 目的:构建和表达人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并测定该融合蛋白的生物学活性。方法:采用PCR和ovelap PCR方法构建人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用150g/L SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产物;采用FACS法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果:DNA序列测定结果表明:人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白已构建成功,表达可溶性产物的产量达4mg/L以上,具有与Raji细胞(CD20+)和A549(4-1BB+)细胞结合的活性。结论:利用融合蛋白形式,首次成功地构建了人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白,并获得较高表达。表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。 展开更多
关键词 4-1BBL CD20 融合蛋白 免疫治疗
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斯钙素蛋白-1和缺氧诱导因子-1α的相互作用对肾癌细胞线粒体膜电势稳定的影响 被引量：4
5
作者 杨清滔 谷江 +4 位作者 张永春 朱致晖 杨永安 王楠 祝庆亮 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期12-19,共8页
目的研究斯钙素蛋白-1(STC-1)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)相互作用后的调钙功能对肾癌细胞线粒体膜电势稳定的影响。方法构建高表达HIF-1α的肾癌细胞模型,采用不同浓度STC-1蛋白分别干预荷基因肾癌细胞和单纯肾癌细胞,MTT法检测细胞增... 目的研究斯钙素蛋白-1(STC-1)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)相互作用后的调钙功能对肾癌细胞线粒体膜电势稳定的影响。方法构建高表达HIF-1α的肾癌细胞模型,采用不同浓度STC-1蛋白分别干预荷基因肾癌细胞和单纯肾癌细胞,MTT法检测细胞增殖,RT-PCR和ELISA法检测细胞内HIF-1α和STC-1的基因及蛋白表达情况,荧光探针检测细胞内Ca2+变化,荧光分光光度计检测线粒体膜电位(Δψm),紫外分光光度计检测线粒体通透性转换孔(mPTP)。结果 HIF-1α基因转染、STC-1干预及基因转染后再STC-1干预3种方式均可提高Δψm,降低细胞内Ca2+和mPTP水平,促进细胞增殖(P均<0.05),以上结果可随着STC-1浓度的增加而逐渐增强,但细胞增殖率的升高趋势却逐渐减缓。结论 HIF-1α可能通过促进STC-1表达,下调Ca2+水平,从而稳定线粒体膜电势来参与肾癌细胞的恶性增殖,但此作用亦因外源性STC-1对HIF-1α的抑制而逐渐减弱。 展开更多
关键词 肾癌细胞 斯钙素蛋白-1 缺氧诱导因子-1Α 线粒体
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线粒体融合蛋白-2基因增强人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯的敏感性 被引量：3
6
作者 邱梅清 佟仲生 +2 位作者 贾勇圣 刘晓东 陈悦 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期37-42,共6页
目的:探讨线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2,Mfn-2)基因表达对人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯敏感性的影响。方法:Real-time PCR检测不同乳腺癌细胞系(T47D、MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435及HCC38)中Mfn-2 mRNA的表达。LipofectamineTM200... 目的:探讨线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2,Mfn-2)基因表达对人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯敏感性的影响。方法:Real-time PCR检测不同乳腺癌细胞系(T47D、MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435及HCC38)中Mfn-2 mRNA的表达。LipofectamineTM2000体外转染pEGFP和pEGFP-Mfn-2质粒至人乳腺癌T47D细胞,real-time PCR和Western blotting检测T47D细胞中Mfn-2 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测T47D细胞的增殖,流式细胞术检测T47D细胞凋亡率及线粒体膜电位。结果:与正常乳腺细胞相比,Mfn-2 mRNA在乳腺癌HCC38细胞系中高表达,在T47D等其他细胞系中均低表达。pEGFP-Mfn-2转染48 h后,T47D细胞中Mfn-2 mRNA和蛋白的表达均明显上调。与pEGFP转染组相比,pEGFP-Mfn-2转染组T47D细胞在小白菊内酯(0.05 mol/L)作用下的存活率明显降低[(47.93±2.21)%vs(56.93±2.05)%,P<0.05]。流式细胞术检测结果显示:50 mmol/L小白菊内酯作用下,pEGFP-Mfn-2转染组与pEGFP转染组相比,T47D细胞凋亡率升高[(71.2±2.1)%vs(38.8±2.6)%,P<0.05],而线粒体膜电位明显降低[(1.6±0.1)%vs(5.0±0.5)%,P<0.05]。结论:pEGFP-Mfn-2转染可增强T47D细胞对小白菊内酯的敏感性。 展开更多
关键词 乳腺癌 T47D细胞 线粒体融合蛋白-2 小白菊内酯 敏感性
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人参皂苷Rb1通过载脂蛋白M/线粒体凋亡途径对肝癌的影响及机制研究 被引量：1
7
作者 王嘉鑫 宋囡 +4 位作者 王杰 杨莹 朱敬轩 王群 贾连群 《世界中医药》 CAS 北大核心 2024年第17期2578-2583,共6页
目的:探究载脂蛋白M(ApoM)/线粒体凋亡在肝癌中的作用,以及人参皂苷Rb1(Rb1)通过ApoM/线粒体凋亡途径对肝癌影响的潜在机制。方法:生物信息学分析筛选ApoM在肝癌中的差异性表达及临床验证;分子对接技术确定Rb1与ApoM的靶向结合,体外培... 目的:探究载脂蛋白M(ApoM)/线粒体凋亡在肝癌中的作用,以及人参皂苷Rb1(Rb1)通过ApoM/线粒体凋亡途径对肝癌影响的潜在机制。方法:生物信息学分析筛选ApoM在肝癌中的差异性表达及临床验证;分子对接技术确定Rb1与ApoM的靶向结合,体外培养人肝癌细胞(HepG2),并进行细胞活力检测(CCK-8)筛选Rb1最佳干预浓度,克隆实验用于检测HepG2细胞的增殖情况,划痕实验用于检测HepG2细胞的迁移能力,采用蛋白质印迹法(Western Blotting)检测ApoM及线粒体凋亡相关基因Bcl2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl2)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)蛋白表达,实时萤光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测ApoM及线粒体凋亡相关基因Bax、Bcl2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平。结果:生存分析发现ApoM低表达肝癌预后更差,分子对接提示Rb1与ApoM之间具有较高亲和力,克隆及划痕实验提示Rb1有效抑制HepG2细胞增殖,Western Blotting及RT-qPCR验证Rb1可以干预线粒体凋亡相关基因蛋白和mRNA表达。结论:揭示了ApoM/线粒体凋亡在肝癌中发挥重要作用,人参皂苷Rb1可能通过ApoM/线粒体凋亡途径影响肝癌的可能潜在机制。 展开更多
关键词 载脂蛋白M 人参皂苷RB1 线粒体凋亡 肝细胞癌 增殖 B淋巴细胞瘤-2/X蛋白 胱天蛋白酶-3 胱天蛋白酶-9
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1-磷酸鞘氨醇受体2通过AKT/mTOR通路调节线粒体功能参与Aβ_(25-35)诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y损伤 被引量：1
8
作者 肖志强 杨柳 +3 位作者 黄睿 黄斌 李晓佳 王晓平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1453-1461,共9页
阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种与年龄相关的认知功能下降的神经退行性疾病。1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)参与多种细胞过程,被证实在神经系统发育中发挥重要作用。本文旨在探究S1PR2对A... 阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种与年龄相关的认知功能下降的神经退行性疾病。1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)参与多种细胞过程,被证实在神经系统发育中发挥重要作用。本文旨在探究S1PR2对Aβ_(25-35)诱导的AD细胞模型损伤的作用及可能机制。研究通过Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞构建细胞损伤模型,并且构建靶向S1PR2的干扰序列用于干预细胞中S1PR2的表达。Western印迹及RT-PCR检测S1PR2蛋白及基因表达,发现Aβ_(25-35)诱导的细胞模型中S1PR2蛋白及基因表达均显著增加(P<0.01),S1PR2干预后模型组内S1PR2蛋白及基因表达显著降低(P<0.001)。CCK8检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示,S1PR2干预后显著增加Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞的增殖活性,减少细胞凋亡(P<0.01)。Western印迹检测细胞中APP、Tau、p-Tau和PSD95的表达,结果显示,S1PR2干预后显著降低模型组细胞内APP、Tau和p-Tau的表达,增加突触蛋白PSD95的表达,可显著改善Aβ_(25-35)诱导的细胞损伤(P<0.001)。另外,试剂盒检测细胞中ATP的产生,流式细胞术检测ROS含量及线粒体膜电位以分析细胞的线粒体功能,结果显示,Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞显著降低了细胞中ATP的产生,增加了ROS含量,减少了线粒体膜电位(P<0.001)。S1PR2干预后显著增加Aβ_(25-35)诱导的细胞模型中ATP的产生,降低ROS含量,增加线粒体膜电位(P<0.001)。最后,通过Western印迹检测AKT/mTOR通路蛋白质表达,结果显示,Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞促进了p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR的表达,S1PR2干预后显著抑制AKT/mTOR通路的激活(P<0.001)。总而言之,S1PR2可能通过促进AKT/mTOR通路调节线粒体功能参与Aβ_(25-35)诱导的细胞损伤进程。 展开更多
关键词 1-磷酸鞘氨醇受体2 β淀粉样蛋白_(25-35) 阿尔兹海默症 线粒体功能 AKT/mTOR通路
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融合蛋白TAP-SSL5对血小板微粒与THP-1细胞结合及Mac-1活化的影响 被引量：3
9
作者 刘成海 彭松 +3 位作者 胡厚源 贝俊杰 孟璟 房兆飞 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期864-867,共4页
目的探讨融合蛋白TAP-SSL5对血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)与人单核细胞株THP-1细胞结合及Mac-1活化的影响。方法以二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)激活人血小板并获取PMPs。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)及P... 目的探讨融合蛋白TAP-SSL5对血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)与人单核细胞株THP-1细胞结合及Mac-1活化的影响。方法以二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)激活人血小板并获取PMPs。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)及PE标记的抗CD62P单克隆抗体、FITC标记的Annexin V检测PMPs,以FITC标记的抗CD41单克隆抗体和PE标记的抗CD154(CD40L)单克隆抗体检测PMPs的表面特征。采用JC-1试剂盒检测血小板线粒体膜电位。采用FCM检测PMPs与THP-1细胞的结合,以及PMPs诱导THP-1细胞表面Mac-1(CD11b/CD18,αMβ2)的活化情况,并研究TAP-SSL5的干预作用。结果 PMPs呈现CD62P和Annexin V双阳性,且CD41和CD40L的阳性率分别达到50.8%和44.0%。JC-1检测显示,ADP对血小板线粒体膜电位无明显影响(P>0.05)。PMPs与THP-1细胞的结合率为(24.80±5.16)%,PMPs诱导THP-1细胞Mac-1的活化率为(21.17±5.92)%,THP-1细胞经10 mg/L TAP-SSL5预处理后,PMPs的结合率下降至(13.67±2.15)%(P<0.05),Mac-1的活化率下降至(0.99±0.62)%(P<0.01)。结论 TAPSSL5可抑制PMPs与THP-1细胞的结合及THP-1细胞表面Mac-1的活化。 展开更多
关键词 血小板微粒 金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5 蜱抗凝血肽 融合蛋白 THP-1细胞 MAC-1
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TNF-α受体-IgG1 Fc段融合蛋白对感染性休克大鼠的治疗作用 被引量：2
10
作者 王世婷 矫强 +2 位作者 徐芒华 徐旨梅 郭竹英 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期909-912,共4页
目的研究早期应用可溶性肿瘤坏死因子-α受体-IgG1 Fc段融合蛋白(sTNF-αR-Fc)对于感染性休克大鼠的治疗作用及可能的作用机制。方法30只Sprague-Daw ley大鼠随机平均分为对照组(注射生理盐水)、模型组(注射脂多糖)和sTNF-αR-Fc处理组... 目的研究早期应用可溶性肿瘤坏死因子-α受体-IgG1 Fc段融合蛋白(sTNF-αR-Fc)对于感染性休克大鼠的治疗作用及可能的作用机制。方法30只Sprague-Daw ley大鼠随机平均分为对照组(注射生理盐水)、模型组(注射脂多糖)和sTNF-αR-Fc处理组(注射sTNF-αR-Fc和脂多糖)。多道生物信号分析系统监测各组大鼠平均动脉压变化并记录死亡情况;流式细胞仪检测脾细胞中TNF-α水平;RT-PCR检测肝脏及心脏组织TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平。结果与对照组相比,模型组TNF-αmRNA表达水平升高,平均动脉压和生存率下降(P<0.05);与模型组相比,sTNF-αR-Fc处理组TNF-α、IL-6水平下降,生存率提高(P<0.05)。结论sTNF-αR-Fc可以显著降低脂多糖所致感染性休克大鼠的死亡率,其可能是通过降低TNF-α水平而起治疗作用。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子-Α 受体-IgG1Fc段融合蛋白 肿瘤坏死因子-Α 脂多糖 感染性休克 大鼠
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PINK1减轻α-突触核蛋白引起的线粒体损伤 被引量：1
11
作者 王雪 申甲梅 +3 位作者 高歌 段春礼 鲁玲玲 杨慧 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2016年第1期70-75,共6页
目的证明PINK1对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)引起的线粒体损伤的影响。方法将携带人源PINK1和α-syn基因的质粒共转染MN9D多巴胺能神经细胞,流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体渗透性转运孔(mito... 目的证明PINK1对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)引起的线粒体损伤的影响。方法将携带人源PINK1和α-syn基因的质粒共转染MN9D多巴胺能神经细胞,流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体渗透性转运孔(mitochondrial permeability pore,mPTP)的开放情况及线粒体膜电势(ΔΨm)变化;MTT和乳酸脱氢酶法检测细胞活力及细胞损伤情况。结果 PINK1减少α-syn引起的ROS的生成、线粒体膜孔的开放及线粒体膜电势降低,并减轻α-syn所致细胞活力下降及和细胞损伤。结论 PINK1可以减轻α-syn引起的线粒体损伤。 展开更多
关键词 PINK1 Α-突触核蛋白 线粒体
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新穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白的跨膜效率及其对细胞存活的影响 被引量：1
12
作者 王怡 林海环 +2 位作者 杨静 姜丽娟 李校堃 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期129-135,共7页
目的研究穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白（GFP）的跨膜效率及其对细胞存活的影响。方法以浓度为500mg·L^-1的His-T1-GFP与人鼻咽癌CNE2或大鼠肾小管上皮NRK52E细胞孵育6h，应用荧光显微镜观察His-T1-GFP跨膜进入细胞的情况。应... 目的研究穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白（GFP）的跨膜效率及其对细胞存活的影响。方法以浓度为500mg·L^-1的His-T1-GFP与人鼻咽癌CNE2或大鼠肾小管上皮NRK52E细胞孵育6h，应用荧光显微镜观察His-T1-GFP跨膜进入细胞的情况。应用多功能酶标仪检测细胞荧光强度，研究His-T1-GFP跨膜的动力学因素：以浓度为500mg·L-1的His-T1-GFP与CNE2或NRK52E细胞孵育10min至24h，观察孵育时间对穿膜作用的影响；以浓度为25mg·L^-1至1．0g·L^-1的His-T1-GFP与两种细胞孵育6h，观察蛋白浓度对跨膜效率的影响；以浓度为500mg·L^-1的His-T1-GFP与两种细胞分别在4℃和37℃的条件下孵育6h，观察温度对蛋白跨膜效率的影响。用细胞乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒和MTr法来评价5．0g·L^-1浓度的His-T1-GFP对细胞存活的影响。结果在一定浓度范围内，His-T1-GFP能够有效穿透CNE2和NRK52E细胞膜，且对NRK52E细胞的跨膜效率明显高于His-TAT-GFP。His-T1-GFP在10min内就能有效跨膜进入细胞，并且在6h内进入细胞的量与时间成正相关。在一定浓度范围（25mg·L^-1-1．0g·L^-1）内，该蛋白进入细胞的量与自身浓度成正相关，而在4℃时该蛋白仍具有跨膜能力。当其终浓度高达5．0g·L^-1时，对CNE2和NRK52E两种细胞几乎无毒性作用。结论His-T1-GFP蛋白是一种跨膜效率高且低毒的穿膜融合蛋白。 展开更多
关键词 穿膜肽 融合蛋白 His-T1-绿色荧光蛋白 细胞膜通透性 细胞毒性
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人成熟型转化生长因子-β_1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步临床应用 被引量：1
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作者 龚环宇 胡国龄 +1 位作者 谭德明 侯珏 《中国感染控制杂志》 CAS 2007年第6期372-375,400,共5页
目的获得兔抗人成熟型转化生长因子-β1(TGF-β1)多克隆抗体,并将其初步应用于临床检测。方法将人成熟型TGF-β1融合蛋白经亲和层析法纯化,并将其作为抗原免疫家兔,获得兔抗血清,经饱和硫酸铵纯化,获得初步纯化的兔抗人TGF-β1多克隆抗... 目的获得兔抗人成熟型转化生长因子-β1(TGF-β1)多克隆抗体,并将其初步应用于临床检测。方法将人成熟型TGF-β1融合蛋白经亲和层析法纯化,并将其作为抗原免疫家兔,获得兔抗血清,经饱和硫酸铵纯化,获得初步纯化的兔抗人TGF-β1多克隆抗体。采用双抗夹心间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定健康对照者、慢性肝病及肝硬化患者血清TGF-β1的OD值。结果获得初步纯化的兔抗人TGF-β1特异性多克隆抗体,该抗体能与人TGF-β1起反应。各组血清TGF-β1的检测OD450值为:轻、中度慢性肝炎组11.333±6.136,慢性重症肝炎组16.400±6.959,肝硬化组14.975±6.090,健康对照组7.275±3.222;前三组分别与健康对照组比较,差异均有显著性(P<0.01);慢性重症肝炎组、肝硬化组分别与轻、中度慢性肝炎组比较,差异亦有显著性(P<0.01)。结论制备的TGF-β1多克隆抗体可初步用于临床检测,判断肝纤维化程度。 展开更多
关键词 人成熟型转化生长因子-β1 融合蛋白 亲和层析法 多克隆抗体 肝纤维化 实验室技术与方法
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BCR/ABL融合蛋白对鞘氨醇激酶和1-磷酸鞘氨醇分泌的影响 被引量：1
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作者 许尹 王超 +1 位作者 吴彬 秦宜德 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2009年第4期411-415,共5页
目的研究高表达BCR/ABL融合蛋白对人鞘氨醇激酶(SPK)表达、活性及1-磷酸鞘氨醇(S1P)分泌的影响。方法使用pLXSN和pLXSN-bcr/abl的重组逆转录病毒感染HL-60和ECV304细胞并筛选出pLXSN和pLXSN-bcr/abl的细胞。利用RT-PCR鉴定病毒转染。Wes... 目的研究高表达BCR/ABL融合蛋白对人鞘氨醇激酶(SPK)表达、活性及1-磷酸鞘氨醇(S1P)分泌的影响。方法使用pLXSN和pLXSN-bcr/abl的重组逆转录病毒感染HL-60和ECV304细胞并筛选出pLXSN和pLXSN-bcr/abl的细胞。利用RT-PCR鉴定病毒转染。WesternBlot检测SPK表达,γ-32P-ATP掺入法检测细胞SPK活性和培养上清的S1P含量。应用同样方法检测不同剂量Gleevec对K562细胞培养上清中S1P的影响。结果RT-PCR结果显示bcr/abl基因转染成功。高表达BCR/ABL融合蛋白的HL-60和ECV304均比转染空载体后的细胞SPK表达、活性和S1P分泌均显著提高。随着Gleevec浓度的增加,K562细胞培养上清中S1P的含量逐渐减少。结论BCR/ABL融合蛋白可提高细胞SPK表达、活性和S1P分泌。 展开更多
关键词 融合蛋白质类 bcr—abl 重组逆转录病毒 人鞘氨醇激酶 1-磷酸鞘氨醇
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GLP-1-Fc融合蛋白在DG44细胞中的表达及其质量分析 被引量：2
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作者 骆海燕 谭婉珑 +1 位作者 张亚楠 洪厚胜 《南京工业大学学报（自然科学版）》 北大核心 2017年第6期74-81,共8页
构建GLP-1-Fc蛋白真核表达载体,并在DG44细胞株中实现表达。利用基因工程等方法构建表达GLP-1-Fc融合蛋白的重组DG44细胞株,通过甲氨喋呤的加压筛选及有限稀释法挑选出表达量较高的单克隆细胞株,经无血清驯化培养获得悬浮生长的细胞株... 构建GLP-1-Fc蛋白真核表达载体,并在DG44细胞株中实现表达。利用基因工程等方法构建表达GLP-1-Fc融合蛋白的重组DG44细胞株,通过甲氨喋呤的加压筛选及有限稀释法挑选出表达量较高的单克隆细胞株,经无血清驯化培养获得悬浮生长的细胞株。收集发酵培养上清,通过离心、过滤及亲和层析等方法对目的蛋白GLP-1-Fc进行分离纯化,并利用Dot blot、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱法、Edman降解等方法进行目的蛋白的质量分析,以建立GLP-1-Fc融合蛋白发酵、纯化工艺,探索该融合蛋白的质量检测方法。本实验成功构建了表达GLP-1-Fc融合蛋白的重组DG44悬浮型细胞株,通过该工艺流程,GLP-1-Fc融合蛋白表达量达到400 mg/L,纯度达95%,分子量约为3.0×10~4。该生产工艺能够获得与理论目标蛋白相一致的、且结构稳定GLP-1-Fc融合蛋白,其质量检测方法稳定可靠。 展开更多
关键词 胰高血糖素样肽-1 FC融合蛋白 DG44细胞株 基因表达
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GST-hMunc18-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
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作者 吴怡 王婧 王岚 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期557-561,共5页
目的:构建hMunc18-1的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hMunc18-1基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-6p-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-6p-1-hMu... 目的:构建hMunc18-1的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hMunc18-1基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-6p-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-6p-1-hMunc18-1。异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在E.coli BL21大肠杆菌中诱导GST-hMunc18-1融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western Blot鉴定结果。结果:hMunc18-1编码序列克隆至pGEX-6p-1载体中,双酶切鉴定片段大小为1785 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为67 000 Da,成功纯化出GST及GST-hMunc18-1蛋白,Western Blot检测到蛋白表达。结论:成功地构建了hMunc18-1基因原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化Munc18-1及研究其结构与功能奠定了基础。 展开更多
关键词 Munc18-1 蛋白纯化 融合蛋白
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人基质金属蛋白酶-1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步应用
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作者 侯珏 胡国龄 +3 位作者 刘双虎 谭德明 刘映霞 沙新平 《湖南医科大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第3期240-242,共3页
目的 :获得兔抗人基质金属蛋白酶 1 (MMP 1 )多克隆抗体 ,并将其初步应用于临床检测。方法 :将人MMP 1融合蛋白经亲和层析法纯化 ,并将其作为抗原免疫家兔 ,获得兔抗血清 ,经饱和硫酸铵纯化 ,获得初步纯化的兔抗人MMP 1多克隆抗体。用... 目的 :获得兔抗人基质金属蛋白酶 1 (MMP 1 )多克隆抗体 ,并将其初步应用于临床检测。方法 :将人MMP 1融合蛋白经亲和层析法纯化 ,并将其作为抗原免疫家兔 ,获得兔抗血清 ,经饱和硫酸铵纯化 ,获得初步纯化的兔抗人MMP 1多克隆抗体。用双抗夹心间接酶联免疫吸附实验 (ELISA)测定正常对照、慢性肝病、肝硬化患者血清MMP 1的OD值。结果 :获得初步纯化的兔抗人MMP 1特异性多克隆抗体 ,该抗体能与人MMP 1起反应。结论:制备的MMP 展开更多
关键词 人基质金属蛋白酶-1融合蛋白 纯化 多克隆抗体 制备
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腹内侧下丘脑GLP-1R阳性神经元在糖稳态调控中的作用和机制
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作者 贺承康 龚昌雄 +6 位作者 彭舟舟 张爽 王柄乔 赵源 许鸣锐 林森 杨清武 《中国神经精神疾病杂志》 北大核心 2025年第6期354-362,共9页
目的探讨胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)调控糖稳态的神经基础并解析GLP-1影响糖感知神经元活动的分子机制。方法以雄性GLP-1R-Cre、GLP-1R KO以及野生型小鼠为研究对象。采用光纤记录腹内侧下丘脑(ventromedial hypo... 目的探讨胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)调控糖稳态的神经基础并解析GLP-1影响糖感知神经元活动的分子机制。方法以雄性GLP-1R-Cre、GLP-1R KO以及野生型小鼠为研究对象。采用光纤记录腹内侧下丘脑(ventromedial hypothalamus,VMH)神经元钙信号,利用膜片钳分析GLP-1受体阳性(GLP-1R^(VMH))神经元的电生理特性。采用脑立体定位病毒注射和化学遗传学,结合血浆激素检测以及常规糖代谢指标检测,明确GLP-1R^(VMH)神经元对糖稳态的调控作用。利用组织和细胞线粒体呼吸功能测定、透射电镜和常规分子生物学方法,探讨GLP-1R激动剂调节糖稳态的机制。结果在葡萄糖浓度从5.0 mmol/L降低至0.5 mmol/L时,GLP-1R^(VMH)神经元的动作电位频率显著降低[(4.51±0.80)Hz vs.(1.43±0.51)Hz,P<0.01];激活GLP-1RVMH神经元显著增强了胰岛素分泌[(7.60±0.56)μU/mL vs.(11.34±0.93)μU/mL,P<0.01],抑制该类神经元活动则损害了GLP-1激动剂的降糖效率(32.03%±0.91%vs.25.77%±1.09%,P<0.001),其机制与GLP-1调控Drp1磷酸化,促进神经元线粒体分裂并改善线粒体能量代谢有关。结论GLP-1R^(VMH)神经元是一类葡萄糖兴奋神经元,激活该类神经元能够促进胰岛素分泌,GLP-1R受体激动剂发挥降糖作用部分依赖于GLP-1R^(VMH)神经元活动。 展开更多
关键词 腹内侧下丘脑 葡萄糖稳态 胰高血糖素样肽-1 线粒体 线粒体动力相关蛋白1
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甲基苯丙胺对体外培养SH-SY5Y细胞线粒体膜电位、超微结构及Mfn1、Fis1蛋白表达的影响 被引量：6
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作者 牟登峰 郑丹 +4 位作者 王琪 黄仕美 官志忠 于燕妮 楼迪栋 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期935-939,共5页
目的 评估甲基苯丙胺(METH)对体外培养的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位(MMP)、线粒体超微结构及Mfn1、Fis1蛋白表达的影响。方法 SH-SY5Y细胞中加入METH(0.0、1.0、1.5、2.0 mmol·L^-1 ),培养3、6、12、24 h;JC-1法检测SH-SY5Y细胞MMP;... 目的 评估甲基苯丙胺(METH)对体外培养的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位(MMP)、线粒体超微结构及Mfn1、Fis1蛋白表达的影响。方法 SH-SY5Y细胞中加入METH(0.0、1.0、1.5、2.0 mmol·L^-1 ),培养3、6、12、24 h;JC-1法检测SH-SY5Y细胞MMP;透射电镜观察SH-SY5Y细胞线粒体超微结构;Western blot检测Mfn1、Fis1蛋白表达。结果 METH作用SH-SY5Y细胞3、6、12、24 h,与对照组比较,METH组细胞MMP红绿荧光比值明显降低( P <0.05),Mfn1蛋白表达降低( P <0.05),Fis1蛋白表达升高( P <0.05);METH作用SH-SY5Y细胞24 h时,透射电镜观察见未处理组细胞线粒体呈椭圆形棒状双层膜结构,线粒体嵴正常、清晰,METH组细胞线粒体椭圆形棒状结构被分裂成小球状结构,并发现线粒体自噬小体及自噬溶酶体。结论 METH可引起SH-SY5Y细胞MMP下降、线粒体超微结构改变及Mfn1、Fis1蛋白表达水平改变,其改变可能参与METH致神经细胞损伤的发病机制。 展开更多
关键词 甲基苯丙胺 SH-SY5Y细胞 线粒体膜电位 线粒体超微结构 线粒体融合蛋白1 线粒体分裂蛋白1
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跨膜丝氨酸蛋白酶-4对2009甲型H1N1流感病毒HA的切割及其融合活性研究 被引量：1
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作者 吴超 温志远 +3 位作者 陈伟业 施建忠 葛金英 步志高 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期517-520,共4页
流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤。2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化。本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸... 流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤。2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化。本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)的真核表达重组质粒pCA-TMPRSS4-Flag与表达2009甲型H1N1流感病毒中国四川分离株HA的真核重组表达质粒pCA-SCHA共转染293T细胞,利用westernblot证明2009甲型H1N1流感病毒的HA蛋白能够被TMPRSS4切割;通过激光共聚焦确定TMPRSS4和HA在293T细胞膜上共定位;并进一步通过细胞融合试验证明经正确切割的HA具有在低pH条件下介导细胞膜发生融合的生物学功能。本实验为研究自然感染情况下参与活化流感病毒的宿主胰蛋白酶提供了实验依据。 展开更多
关键词 2009甲型H1N1流感病毒 跨膜丝氨酸蛋白酶-4 血凝素 细胞融合
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