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基于新型昆虫杆状病毒flashBACTM表达系统表达鸭腺病毒3型Fiber-1蛋白
1
作者 肖雅清 孟凯 +4 位作者 董雯雯 袁小远 李桂明 刘明超 翟向和 《山东农业科学》 北大核心 2025年第7期139-144,共6页
鸭腺病毒3型(DAdV-3)近些年来被多地报道,给我国的养禽业带来较大损失。纤突蛋白(Fiber)在介导鸭腺病毒感染和诱导体液免疫中发挥着重要作用。本研究基于昆虫杆状病毒flashBACTM表达系统对DAdV-3的Fiber-1蛋白进行重组表达,获得目的蛋... 鸭腺病毒3型(DAdV-3)近些年来被多地报道,给我国的养禽业带来较大损失。纤突蛋白(Fiber)在介导鸭腺病毒感染和诱导体液免疫中发挥着重要作用。本研究基于昆虫杆状病毒flashBACTM表达系统对DAdV-3的Fiber-1蛋白进行重组表达,获得目的蛋白。因该系统将LacZ基因整合到苜蓿银纹蛾核型多角体病毒(AcMNPV),重组后开启LacZ表达,其借助蓝白斑实现对阳性病毒的筛选,免除空斑筛选过程,大大节省实验时间;通过Western blot验证Fiber-1蛋白在昆虫Sf9细胞中成功表达。本研究结果可为深入探究Fiber-1蛋白在DAdV-3感染机制中的作用以及相关的生物制品制备奠定基础。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 鸭腺病毒3型 蛋白表达 Fiber-1
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杆状病毒表达系统表达BCoV纤突蛋白及其对小鼠的免疫原性 被引量：4
2
作者 喻琦胜 朱庆 +6 位作者 周群 宋鑫 张家祺 陈涛云 徐林 张朝辉 张斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期640-648,共9页
旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH1... 旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S,利用基因组PCR、免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验对其进行鉴定,测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响,超速离心纯化蛋白,免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示:优化后全长4108 bp的BCoV S基因CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87,平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证,重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定,感染杆状病毒约20 h后产生典型病变,收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因;间接免疫荧光试验显示,试验组观察到特异性绿色荧光;Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白,目的条带位于250 ku左右,感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50μg蛋白、20μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后,肌肉注射免疫小鼠,间接ELISA试验结果显示,小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体,且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001),最高抗体效价达1∶12800;微量中和试验结果显示,小鼠血清中和效价最高达1∶224,试验组中和效价平均值高于灭活病毒组,但统计学差异不显著(P>0.05)。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白,并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价,为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 S蛋白 杆状病毒表达系统 免疫原性
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HCG嵌合肽CP12基因的构建和原核系统表达
3
作者 徐万祥 熊艳 +5 位作者 孙志达 廖矛川 顾少华 应康 刘建平 谢毅 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期96-97,共2页
关键词 HCG嵌合肽 CP12基因 基因构建 原核系统表达
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鹅副粘病毒HN基因在昆虫杆状系统表达及其抗原性鉴定
4
作者 藏玉婷 周丽 +1 位作者 姜亦飞 王君伟 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 2008年第3期88-91,共4页
血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)是鹅副粘病毒诱导体液免疫的重要靶抗原。经pMD18-T-HN阳性质粒扩增了HN基因,亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,并将其与线性化的杆状病毒共转染对数生长期的sf 9细胞,得到重组杆状病毒rBv-HN,试验... 血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)是鹅副粘病毒诱导体液免疫的重要靶抗原。经pMD18-T-HN阳性质粒扩增了HN基因,亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,并将其与线性化的杆状病毒共转染对数生长期的sf 9细胞,得到重组杆状病毒rBv-HN,试验表明,HN在昆虫细胞中得到表达,且产物具有抗原性。 展开更多
关键词 鹅副粘病毒 HN基因 昆虫杆状系统表达 抗原性
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用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素的方法研究 被引量：2
5
作者 马卫列 刘芳 何承伟 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第14期1476-1478,共3页
目的探索用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)重组蛋白的最佳生产工艺路线。方法用pTh ioH is-endo重组质粒转化不同的大肠杆菌BL21、JM109、DH5α,经几种不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(isopro-pylth io-galactoside,... 目的探索用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)重组蛋白的最佳生产工艺路线。方法用pTh ioH is-endo重组质粒转化不同的大肠杆菌BL21、JM109、DH5α,经几种不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(isopro-pylth io-galactoside,IPTG)诱导表达重组融合蛋白,或诱导表达不同时间后,采用SDS-PAGE分析表达产物;按所优化的条件进行重组内皮抑素的表达、包涵体的提取、洗涤、变性和复性,最后经N i+柱纯化,再通过SDS-PAGE分析纯化的结果。结果3种大肠杆菌表达效果相差无几,最佳IPTG的浓度0.9 mmol/L,最佳诱导时间为5 h,经N i+柱纯化后可获得可溶性的重组内皮抑素。结论利用本实验的优化条件可获得高产量、高纯度、可溶性的小鼠内皮抑素重组蛋白。 展开更多
关键词 ENDOSTATIN 硫氧还蛋白融合表达系统 融合蛋白
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禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白的哺乳动物细胞表达系统表达及鉴定 被引量：2
6
作者 李子璇 韦莉 +7 位作者 王菁 朱姗姗 张春燕 柳舒航 全荣 阎旭 陈武 刘爵 《北京农学院学报》 2014年第4期49-53,共5页
利用哺乳动物细胞表达系统对禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白进行表达,并检测所表达融合蛋白的抗原性。首先将N基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体,然后将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜检... 利用哺乳动物细胞表达系统对禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白进行表达,并检测所表达融合蛋白的抗原性。首先将N基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体,然后将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜检测N蛋白的表达,并用Western blot检测表达蛋白的抗原性。结果显示,禽偏肺病毒核衣壳N蛋白主要表达在细胞浆中,在转染后48h后表达量最高;与抗N蛋白抗体有抗原性,所表达核衣壳N融合蛋白大小为72kDa左右,与预期结果一致。结论,本试验成功应用哺乳动物表达系统表达了禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白,表达蛋白具有抗原性,为与禽偏肺病毒核衣壳N蛋白的相关研究奠定了基础。 展开更多
关键词 禽偏肺病毒核衣壳N蛋白 哺乳动物细胞表达系统 显微镜观察 WESTERN BLOTTING
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用pFASTBAC-THa系统表达IBV SD株S1基因
7
作者 刘兴友 王春凤 +4 位作者 戴亚斌 陈德胜 李文刚 刘尚高 陈溥言 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2004年第6期14-16,共3页
关键词 pFASTBAC表达系统 昆虫杆状病毒细胞表达系统 传染性支气管炎病毒 SD株 S1基因 基因表达
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利用柞蚕核型多角体病毒表达系统表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶 被引量：1
8
作者 朱彤 赵振军 +4 位作者 叶博 刘宇博 范琦 张嘉宁 李文利 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期478-484,共7页
谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸... 谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸。将该基因连接到柞蚕杆状病毒转移载体pApM748BE后与ApNPV-Δph/egfp+共转染Tn-High Five细胞获得重组病毒。将重组病毒注射到柞蚕蛹体内,收集发病蛹血淋巴,用镍离子螯合柱纯化得到纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测表明,ApGFAT蛋白在柞蚕蛹体内得到成功表达,酶活力为0.978μmol/(min·mg)。 展开更多
关键词 柞蚕 谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶 柞蚕核型多角体病毒表达载体系统
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利用MultiBac系统表达有活性鸡γ干扰素及其鉴定
9
作者 周耀红 冯敏 +1 位作者 严会超 孙京臣 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期50-58,共9页
MultiBac系统是一套完善而又强大的真核表达系统,可在昆虫细胞中大量表达高品质的外源蛋白,已经应用于结构生物学研究和药物开发。为了实现鸡γ干扰素(chIFN-γ)在昆虫细胞中的表达,利用零背景转座技术构建重组杆状病毒,通过感染Sf9细胞... MultiBac系统是一套完善而又强大的真核表达系统,可在昆虫细胞中大量表达高品质的外源蛋白,已经应用于结构生物学研究和药物开发。为了实现鸡γ干扰素(chIFN-γ)在昆虫细胞中的表达,利用零背景转座技术构建重组杆状病毒,通过感染Sf9细胞,表达并且纯化chIFN-γ蛋白。使用制得的多抗血清,在重组杆状病毒感染的Sf9细胞样品中能够检测到大小为17.8 kD的单一条带,表明chIFN-γ成功表达。对纯化得到的重组chIFN-γ蛋白进行生物活性检测,结果显示其抗病毒活性为1.6×10^(4) U/mL,具有良好的生物活性。 展开更多
关键词 杆状病毒表达系统 鸡干扰素 生物活性
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利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素和λ1干扰素 被引量：2
10
作者 吕言娜 杨鑫 +3 位作者 李轶女 胡小元 张志芳 易咏竹 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期681-687,共7页
牛干扰素可用于对各种类型牛传染性疾病的预防和治疗。利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素（BoIFN-α）及牛λ1干扰素（BoIFN-λ1）。首先对BoIFN-α和BoIFN-λ1的编码基因序列进行优化合成,优化合成的BoIFN-α和BoIFN-λ1基因的... 牛干扰素可用于对各种类型牛传染性疾病的预防和治疗。利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素（BoIFN-α）及牛λ1干扰素（BoIFN-λ1）。首先对BoIFN-α和BoIFN-λ1的编码基因序列进行优化合成,优化合成的BoIFN-α和BoIFN-λ1基因的密码子适应指数（CAI）值提高,更适合在家蚕中表达,且翻译后的氨基酸序列与原始氨基酸序列完全一致。将优化合成的2个基因序列分别克隆至杆状病毒转移载体pVL1393,与缺失了orf1629的亲本杆状病毒BmBacmid共转染Bm N细胞,通过同源重组将BoIFN-α和BoIFN-λ1基因插入到杆状病毒多角体蛋白基因启动子下游,获得重组病毒rBmBac-BoIFN-α和rBmBac-BoIFN-λ1。用纯化的重组病毒感染家蚕5龄幼虫融合表达BoIFN-α和BoIFN-λ1干扰素,并通过PCR鉴定了2个目标蛋白基因在蚕体内的复制。采用微量细胞病变抑制法在Vero/VSV＊GFP表达系统检测蚕体中表达重组BoIFN-α的效价可达1.0×10~6U/mL左右,重组BoIFN-λ1的效价可达5.01×10~4U/m L左右。试验结果提示,利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内表达牛α干扰素及牛λ1干扰素是生产牛干扰素制剂更加廉价而高效的途径。 展开更多
关键词 牛干扰素 杆状病毒表达系统 家蚕 抗病毒活性
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利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白 被引量：2
11
作者 高琳琳 王晓燕 +4 位作者 张颖慧 李岩 邓菲 张艳芳 林菊生 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期787-790,共4页
目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBV C基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual-HBV core,转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9,获得含有HBV C基因的重组杆状病毒... 目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBV C基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual-HBV core,转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9,获得含有HBV C基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达,然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBV C基因的重组杆状病毒,而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统,成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白,为进一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒核心蛋白 杆状病毒表达载体系统 昆虫细胞
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利用家蚕杆状病毒表达系统表达人γ干扰素及产物的抗病毒活性检测
12
作者 曾振 李家磊 +5 位作者 刘兴健 唐平 李轶女 张志芳 沈兴家 易咏竹 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期240-246,共7页
干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用。利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的... 干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用。利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的序列克隆到杆状病毒转移载体pBR中,然后与orf1629基因缺失的失活拯救型杆状病毒BmBacmid共转染BmN细胞,获得重组病毒reBmBac-hIFN-γ,最后利用获得的重组病毒感染家蚕并收获表达产物。采用微量细胞病变抑制法,在Vero/VSV-GFP系统中检测到重组hIFN-γ的效价达到(3.69±2.02)×106 IU/mL。此外,重组hIFN-γ可以抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖。上述结果为利用家蚕生物反应器高效生产具有活性的人γ干扰素奠定了试验基础。 展开更多
关键词 人γ扰素 杆状病毒表达系统 家蚕 抗病毒活性
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家蚕丝素重链表达系统表达外源蛋白的应用研究进展
13
作者 张雨丽 王平阳 +4 位作者 王霞 崔秋英 黄旭华 董桂清 张桂征 《广西蚕业》 2023年第1期22-27,共6页
家蚕丝腺拥有出色的丝蛋白合成能力,家蚕又具有容易饲养、生长周期短等优点,利用家蚕丝腺来生产大量有价值的蛋白,生产出的重组蛋白可在生物、医药、材料学等领域广泛应用,所以家蚕丝腺是一种理想的生物反应器。高效表达系统的构建是家... 家蚕丝腺拥有出色的丝蛋白合成能力,家蚕又具有容易饲养、生长周期短等优点,利用家蚕丝腺来生产大量有价值的蛋白,生产出的重组蛋白可在生物、医药、材料学等领域广泛应用,所以家蚕丝腺是一种理想的生物反应器。高效表达系统的构建是家蚕丝腺生物反应器产生重组蛋白的关键步骤之一。为了构建出更加优良的表达系统,结合国内外研究进展,对家蚕丝素重链表达系统的建立、发展与应用情况进行综述,为该系统的深入研究与应用提供参考。 展开更多
关键词 家蚕 丝腺生物反应器 丝素重链 表达系统
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猪流行性腹泻病毒N蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及单克隆抗体制备
14
作者 柴茂 马震原 +8 位作者 杨海波 王淑娟 刘影 王东方 赵雪丽 王翠 谢彩华 王华俊 闫若潜 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期124-131,共8页
利用昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白,并制备单克隆抗体。构建PEDV N基因重组穿梭质粒pFastBac-N,转化至感受态细胞DH10Bac中获取重组杆粒Bacmid-N,将Bacmid-N转染至SF9昆虫细胞中制备重组蛋白。将重组蛋白... 利用昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白,并制备单克隆抗体。构建PEDV N基因重组穿梭质粒pFastBac-N,转化至感受态细胞DH10Bac中获取重组杆粒Bacmid-N,将Bacmid-N转染至SF9昆虫细胞中制备重组蛋白。将重组蛋白免疫小鼠,经融合、筛选、纯化出单克隆抗体,并测定单克隆抗体相关特性。获得重组杆状病毒rBV-N,获得大小为59 kDa重组N蛋白(rN),制备出抗N蛋白单克隆抗体3C8E3,该单克隆抗体为IgG1亚类,效价为1∶1.024×10^(5),效价高、特异性强、稳定性好,更具实用性。本研究为PEDV抗原/抗体诊断试剂盒、PEDV亚单位疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 昆虫杆状病毒表达系统 猪流行腹泻病毒 单克隆抗体
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组成型启动子P_(ldh)对乳酸菌表达系统外源基因表达的影响研究
15
作者 刘芯孜 赵海渊 +7 位作者 鞠宁 陈莹 王梓 孟伟静 李佳璇 姜艳平 崔文 王晓娜 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2937-2947,共11页
旨在利用AmpR(氨苄青霉素抗性)报告基因表达系统,构建不同数量乳酸菌组成型启动子P_(ldh)串联、启动子P_(ldh)与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统,分别检测AmpR报告基因转录水平、蛋白表达量并评价AMPR酶活性,从而筛选出稳定... 旨在利用AmpR(氨苄青霉素抗性)报告基因表达系统,构建不同数量乳酸菌组成型启动子P_(ldh)串联、启动子P_(ldh)与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统,分别检测AmpR报告基因转录水平、蛋白表达量并评价AMPR酶活性,从而筛选出稳定且强表达的组成型多启动子表达系统,为乳酸菌活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。对P_(ldh)启动子进行生物信息学分析,构建不同数量启动子P_(ldh)串联的重组乳酸菌以及启动子与外源基因AmpR不同顺序重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR、Western blot、间接ELISA检测以及氨苄青霉素活菌筛选试验综合评估不同表达系统中外源基因表达的强弱。PCR结果显示重组乳酸菌成功扩增出600、900、2300和2300 bp的P_(ldh)-P_(ldh)、P_(ldh)-P_(ldh)-P_(ldh)、P_(ldh)-AmpR-P_(ldh)-AmpR和P_(ldh)-P_(ldh)-AmpR-AmpR目的片段;Western blot结果显示重组菌均可表达AMPR蛋白,目的蛋白大小均约为28 ku。间接ELISA、荧光定量PCR和AMPR酶活性检测结果均显示,在不同数量启动子P_(ldh)串联乳酸菌表达载体系统中,三启动子驱动AmpR报告基因表达的效率显著高于双启动子(P<0.05),三启动子、双启动子驱动AmpR报告基因表达的效率均极显著高于单启动子(P<0.01),且均极显著高于对照菌pPG-Ampr/HLJ-27(P<0.01);在启动子P_(ldh)与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统中,重组菌pPG-P_(ldh)-P_(ldh)-Ampr-Ampr/HLJ-27驱动AmpR报告基因表达的效率极显著高于重组菌pPG-P_(ldh)-Ampr-P_(ldh)-Ampr/HLJ-27(P<0.01)。本研究利用AmpR报告基因成功构建了5种组成型多启动子P_(ldh)乳酸菌表达系统,结果显示在不同数量启动子P_(ldh)串联驱动单外源蛋白载体系统中,启动子调控转录进而驱动外源基因表达量与启动子数量呈正相关;在双启动子驱动双外源蛋白载体系统中,连续串联两个启动子调控转录进而驱动双外源基因表达效率显著高于两个启动子分别驱动双外源基因表达效率;以上数据为乳酸菌表达载体对外源蛋白的表达效率优化提供了必要的依据。 展开更多
关键词 乳酸菌表达系统 组成型启动子P_(ldh) 启动子活性 外源基因表达效率
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大肠杆菌Nissle 1917类T7表达系统的构建及应用
16
作者 郑烨 邓睿哲 +3 位作者 杨富荏 林艺娜 王辉 叶健文 《暨南大学学报(自然科学与医学版)》 北大核心 2025年第2期151-162,共12页
目的:在大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN)中构建类T7 RNA聚合酶的强诱导表达系统,实现目标蛋白的高效表达。方法:在EcN中构建不同诱导表达调控系统,并进行“剂量-响应”表征测试,筛选出低渗漏、高表达的诱导系统... 目的:在大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN)中构建类T7 RNA聚合酶的强诱导表达系统,实现目标蛋白的高效表达。方法:在EcN中构建不同诱导表达调控系统,并进行“剂量-响应”表征测试,筛选出低渗漏、高表达的诱导系统;通过构建基因组整合表达类T7 RNA聚合酶(T7-like RNA polymerase,MmP1)的菌株LM01,并测试其启动子突变文库,优化其表达强度及动态输出范围;利用MmP1诱导系统表达超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),验证其蛋白表达能力。结果:在EcN中成功构建并表征了多个诱导系统,其中以MmP1为RNA聚合酶的类T7诱导表达系统的饱和诱导输出强度最优,最大动态调控范围高达909倍;将MmP1聚合酶表达模块整合至EcN基因组后,其饱和响应表达输出提高达66.8%;P MmP1启动子突变文库的构建提供了涵盖65~1097倍动态范围的宽范围可诱导表达可能性;MmP1系统在SOD蛋白可溶性表达测试中产量最高,达到435.7 mg/L,为香草酸诱导系统产量的4.02倍,且酶活性最高达到391.3 U/mL。结论:类T7(MmP1)诱导系统在EcN中可成功构建,并具有高饱和表达、低本底渗漏、动态范围可控等特性,有助于实现蛋白的高效表达合成。 展开更多
关键词 大肠杆菌Nissle 1917 诱导表达系统 类T7表达系统 蛋白表达 合成生物学
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荧光假单胞菌蛋白表达系统研究进展
17
作者 谭景轩 邢德勋 +1 位作者 何天锦 刘占英 《生物技术通报》 北大核心 2025年第1期49-61,共13页
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)作为一种新型蛋白表达系统,凭借其多样且独特的分泌系统,逐渐展现出在生物技术和生物制药领域的巨大应用潜力。尽管传统蛋白表达系统,如大肠杆菌、酿酒酵母及昆虫细胞系统,已在众多研究和工业应... 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)作为一种新型蛋白表达系统,凭借其多样且独特的分泌系统,逐渐展现出在生物技术和生物制药领域的巨大应用潜力。尽管传统蛋白表达系统,如大肠杆菌、酿酒酵母及昆虫细胞系统,已在众多研究和工业应用中取得成功,但仍存在折叠机制和翻译后修饰等方面的局限性。相较之下,荧光假单胞菌因其能够高效处理和分泌大分子蛋白质而迅速成为当前研究的热点。本文综述了荧光假单胞菌在蛋白表达系统方面的最新进展,涵盖了高效表达宿主菌株、克隆表达载体及调控元件、蛋白分泌系统等多个领域。详细分析了荧光假单胞菌在蛋白质折叠、分泌及糖基化修饰等关键步骤中的优异表现,并探讨了多种信号肽在优化蛋白分泌效率中的应用。这些研究成果不仅显著提升了目标蛋白的溶解度和表达水平,还为改善蛋白质生产工艺提供了新的思路。此外,荧光假单胞菌在疫苗、治疗性蛋白质和抗体生产中的应用也已显示出广阔的应用前景。尽管近年来的研究取得了显著进展,该系统在某些高分子蛋白表达方面仍面临挑战。未来的研究应集中于基因组编辑技术、蛋白质分泌调控机制的优化,以及工业生产中的工艺优化,以进一步提高荧光假单胞菌作为蛋白表达平台的灵活性和效率,为蛋白质工程和合成生物学提供强有力的工具。 展开更多
关键词 荧光假单胞菌 蛋白表达系统 分泌系统
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杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)表达的动物病毒样颗粒及疫苗研究进展 被引量：1
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作者 王炎 高婉宁 +3 位作者 范益阳 玉妹 张德荣 柏家林 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第1期203-208,共6页
杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)是一种高效的外源蛋白表达平台,具有可以容纳较大的外源基因片段、蛋白质表达量较高、支持蛋白质翻译后修饰、操作简便且安全性较高等优势,已被广泛用于兽用疫苗生产。病毒样颗粒(VLP)是一种由病毒蛋白自... 杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)是一种高效的外源蛋白表达平台,具有可以容纳较大的外源基因片段、蛋白质表达量较高、支持蛋白质翻译后修饰、操作简便且安全性较高等优势,已被广泛用于兽用疫苗生产。病毒样颗粒(VLP)是一种由病毒蛋白自组装形成的纳米颗粒,由于缺乏病毒遗传物质,其安全性较高。VLP表面抗原排列高度有序,可有效诱导免疫反应,是一种新型的亚单位疫苗。本文综述了IBEVS在动物VLP疫苗中的应用现状,分析了当前IBEVS存在的问题及其解决策略,为动物VLP疫苗的进一步开发提供参考。 展开更多
关键词 病毒样颗粒 杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS) 动物病毒样颗粒疫苗
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慢病毒介导的猫四连接素蛋白过表达系统的构建
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作者 杨泽昊 胡佳艺 +2 位作者 赵源杰 刘萌萌 陈宇 《热带生物学报》 2025年第1期58-63,共6页
四连接素(Tetranectin)是一种具有结合钙离子和肝素能力的纤溶酶原结合蛋白。通过构建稳定表达猫四连接素蛋白的细胞系,为后续探究其与猫心血管疾病的关系提供实验材料。本研究利用分子克隆技术构建过表达猫四连接素基因的重组慢病毒质... 四连接素(Tetranectin)是一种具有结合钙离子和肝素能力的纤溶酶原结合蛋白。通过构建稳定表达猫四连接素蛋白的细胞系,为后续探究其与猫心血管疾病的关系提供实验材料。本研究利用分子克隆技术构建过表达猫四连接素基因的重组慢病毒质粒,并通过慢病毒感染获得过表达猫四连接素蛋白的HEK293T细胞系,蛋白免疫印迹法验证蛋白表达。慢病毒质粒测序结果表明,实测猫四连接素基因CDS序列与NCBI数据库预测序列一致。经嘌呤霉素筛选过表达细胞系构建成功,猫四连接素重组蛋白以可溶形式分泌于细胞上清中,分子量约为25kDa并带有flag标签。 展开更多
关键词 猫四连接素蛋白 CLEC3B 慢病毒包装系统 真核表达系统
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鸭IFN-α昆虫杆状病毒表达系统的建立及其抗新型鸭呼肠孤病毒活性研究
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作者 孔雨心 柳美玲 +4 位作者 于鲁娜 鹿益豪 张兆鹏 傅绩 李宁 《中国动物检疫》 2025年第3期119-126,共8页
为利用昆虫杆状病毒表达系统表达鸭干扰素α(inteferon-α,IFN-α),并研究其对新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的抗病毒活性,针对鸭IFN-α序列构建重组质粒PFastBac-DuIFN-α,转化DH10Bac细胞后提取重组杆粒B acmid-DuIFN-... 为利用昆虫杆状病毒表达系统表达鸭干扰素α(inteferon-α,IFN-α),并研究其对新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的抗病毒活性,针对鸭IFN-α序列构建重组质粒PFastBac-DuIFN-α,转化DH10Bac细胞后提取重组杆粒B acmid-DuIFN-α,然后将其转染Sf9昆虫细胞并收集上清,盲传3代后收集病变细胞,经超声纯化获得重组鸭IFN-α蛋白。Western blot鉴定结果显示,鸭IFN-α在细胞质中表达,大小约为23 kDa。经测定,重组鸭IFN-α蛋白效价为2.14×10^(5)U/mL,以其处理鸭胚成纤维细胞(DEF)后,可极显著刺激蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)、抗黏病毒蛋白(myxovirus resistant,Mx)和寡腺苷酸合成酶(oligadenylate syntase,OAS)编码基因的表达(P<0.01)。进一步将鸭IFN-α蛋白接种5日龄樱桃谷鸭(2.14×10^(3) U/mL,0.2mL/只),2 d后再进行NDRV攻毒试验(1000 TCID_(50)/0.1 mL,0.2 mL/只),同时设置阴性对照组和仅NDRV攻毒组。组织病理学检测显示,仅肌注NDRV的攻毒组雏鸭脾出现大量淋巴细胞崩解坏死,数量减少;而先肌注鸭IFN-α蛋白后攻毒NDRV的试验组雏鸭病变较轻,仅有少量淋巴细胞坏死。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测发现,试验组雏鸭的排毒量极显著低于攻毒组(P<0.01),且其肝和脾中NDRV载量也极显著低于攻毒组(P<0.01),同时试验组Mx和OAS表达量极显著升高(P<0.01)。结果表明,本研究通过昆虫杆状病毒系统成功表达出了重组鸭IFN-α蛋白,其具有较好的抗NDRV活性。本研究为进一步探索鸭IFN-α对NDRV感染等鸭病毒性疾病的防治机制提供了技术支持。 展开更多
关键词 干扰素Α 鸭 昆虫杆状病毒表达系统 新型鸭呼肠孤病毒 抗病毒活性
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