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粗毛纤孔菌糖苷水解酶5基因克隆及蛋白质结构分析
1
作者
刘晓晗
王峰
+6 位作者
董爱荣
陈俏丽
刘立宏
零雅茗
王博文
丁晓霞
王世新
《林业科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2015年第2期163-168,共6页
【目的】克隆得到粗毛纤孔菌糖苷水解酶5基因,并对该基因进行生物信息学分析、蛋白质原核表达和酶活研究,为糖苷水解酶的利用提供依据。【方法】分离纯化粗毛纤孔菌,并于PDA斜面长期保存。应用TRIzol提取粗毛纤孔菌总RNA,通过AMV反转录...
【目的】克隆得到粗毛纤孔菌糖苷水解酶5基因,并对该基因进行生物信息学分析、蛋白质原核表达和酶活研究,为糖苷水解酶的利用提供依据。【方法】分离纯化粗毛纤孔菌,并于PDA斜面长期保存。应用TRIzol提取粗毛纤孔菌总RNA,通过AMV反转录系统将RNA反转录成c DNA,构建c DNA文库;应用NCBI BLAST分析并检测糖苷水解酶基因家族5阳性序列,RACE法克隆基因全长命名为Ih GH5-1并提交NCBI注册;ORF-Finder分析Ih GH5-1基因开放阅读框,推导出氨基酸序列;筛选NCBI登录的糖苷水解酶家族5同源序列,Clustal W进行保守结构域区段多序列比对;应用Mega 5.05选用WAG+G模型构建最大似然树;应用PSIPRED server对Ih GH5-1进行α螺旋和β折叠的蛋白质二级结构分析,应用SWISS-MODEL对Ih GH5-1进行三维建模,应用VMD1.8.6分析Ih GH5-1三维结构;设计原核表达引物并进行PCR扩增,将扩增得到的基因片段连接至p QE-30 UA载体并转入大肠埃希菌JM109感受态细胞,诱导表达后通过SDS-PAGE电泳检测表达量;测定糖苷水解酶活性并计算酶活。【结果】TRIzol提取的粗毛纤孔菌总RNA经分光光度计检验符合标准(OD260/OD280=2.0,OD260/OD230>1.8),c DNA文库成功构建并测序;RACE法克隆得到5'序列长度为770 bp,3'序列长度为1 562 bp且含有Poly A的序列,5'和3'序列拼接得到基因全长序列长1 727 bp,NCBI注册号为KM368321;ORF分析得到Ih GH5-1氨基酸序列含有300个氨基酸,分子质量为31.226 55 k D,等电点(p I)为9.24;结构域分析表明Ih GH5-1具有保守的催化结构域;最大似然树分析表明多数子囊菌糖苷水解酶家族5聚在一起,多数担子菌糖苷水解酶家族5聚在一起,粗毛纤孔菌Ih GH5-1蛋白质与太瑞斯梭孢壳霉和球毛壳菌等子囊菌的糖苷水解酶亲缘关系更近;蛋白质三维结构分析表明粗毛纤孔菌Ih GH5-1含有7个α螺旋、4个β折叠,三维比对表明粗毛纤孔菌Ih GH5-1三维结构与其他真菌糖苷水解酶家族5蛋白空间结构相近,进化关系与最大似然树分析相符;原核表达及酶活测定表明该基因成功表达,表达产物在65℃时相对酶活性最高。【结论】本研究可为白腐菌纤维素酶大规模的工业化应用提供前期研究基础和理论依据。
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关键词
粗毛纤孔菌
糖苷
水解
酶
家族
5
水曲柳
木材白色腐朽
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职称材料
瘤胃微生物强化醋糟厌氧消化及其机制
被引量：
7
2
作者
李倩
许之扬
+4 位作者
周云龙
何迪
白玲
晏习鹏
阮文权
《环境科学研究》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2020年第10期2370-2377,共8页
针对醋糟中木质纤维素利用效率低的问题,通过接种瘤胃微生物可强化木质纤维素水解.采用逐步提升体系有机负荷的方式,考察瘤胃微生物生物强化对醋糟厌氧消化性能的提升效果,并运用绝对定量实时聚合酶链锁反应(Q-PCR)技术探究其微生物学...
针对醋糟中木质纤维素利用效率低的问题,通过接种瘤胃微生物可强化木质纤维素水解.采用逐步提升体系有机负荷的方式,考察瘤胃微生物生物强化对醋糟厌氧消化性能的提升效果,并运用绝对定量实时聚合酶链锁反应(Q-PCR)技术探究其微生物学强化机制.结果表明:长期连续运行成功塑造了高效的木质纤维素瘤胃强化体系.该体系的最高有机负荷达8.90 g/(L·d)(以VS计),是强化前的1.53倍,该有机负荷下半纤维素和纤维素降解率分别达73.9%和40.1%,单位质量底物沼气和甲烷产量相应地分别达到451和261 mL/g(以VS计),半纤维素和纤维素较高的降解率是该体系维持高产气性能的主要原因.生物相机制研究表明,瘤胃微生物强化体系中与木质纤维素水解密切相关的GH5(糖苷水解酶家族5)水解菌逐步富集,其基因拷贝数从初始的964×10^10 copies/g升至最高有机负荷下的6.83×10^11copies/g,这是底物在高有机负荷下仍能被高效生物转化的根本原因.研究显示,瘤胃微生物的介入可有效强化体系底物的降解能力,促进醋糟产甲烷性能的提升.
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关键词
醋糟
厌氧消化
木质纤维素
瘤胃
有机负荷
糖苷水解家族5
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职称材料
题名
粗毛纤孔菌糖苷水解酶5基因克隆及蛋白质结构分析
1
作者
刘晓晗
王峰
董爱荣
陈俏丽
刘立宏
零雅茗
王博文
丁晓霞
王世新
机构
东北林业大学林学院
出处
《林业科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2015年第2期163-168,共6页
基金
林业公益性行业科研专项项目(201004079)
中央高校基本科研业务费专项资金项目(DL13BA01)
文摘
【目的】克隆得到粗毛纤孔菌糖苷水解酶5基因,并对该基因进行生物信息学分析、蛋白质原核表达和酶活研究,为糖苷水解酶的利用提供依据。【方法】分离纯化粗毛纤孔菌,并于PDA斜面长期保存。应用TRIzol提取粗毛纤孔菌总RNA,通过AMV反转录系统将RNA反转录成c DNA,构建c DNA文库;应用NCBI BLAST分析并检测糖苷水解酶基因家族5阳性序列,RACE法克隆基因全长命名为Ih GH5-1并提交NCBI注册;ORF-Finder分析Ih GH5-1基因开放阅读框,推导出氨基酸序列;筛选NCBI登录的糖苷水解酶家族5同源序列,Clustal W进行保守结构域区段多序列比对;应用Mega 5.05选用WAG+G模型构建最大似然树;应用PSIPRED server对Ih GH5-1进行α螺旋和β折叠的蛋白质二级结构分析,应用SWISS-MODEL对Ih GH5-1进行三维建模,应用VMD1.8.6分析Ih GH5-1三维结构;设计原核表达引物并进行PCR扩增,将扩增得到的基因片段连接至p QE-30 UA载体并转入大肠埃希菌JM109感受态细胞,诱导表达后通过SDS-PAGE电泳检测表达量;测定糖苷水解酶活性并计算酶活。【结果】TRIzol提取的粗毛纤孔菌总RNA经分光光度计检验符合标准(OD260/OD280=2.0,OD260/OD230>1.8),c DNA文库成功构建并测序;RACE法克隆得到5'序列长度为770 bp,3'序列长度为1 562 bp且含有Poly A的序列,5'和3'序列拼接得到基因全长序列长1 727 bp,NCBI注册号为KM368321;ORF分析得到Ih GH5-1氨基酸序列含有300个氨基酸,分子质量为31.226 55 k D,等电点(p I)为9.24;结构域分析表明Ih GH5-1具有保守的催化结构域;最大似然树分析表明多数子囊菌糖苷水解酶家族5聚在一起,多数担子菌糖苷水解酶家族5聚在一起,粗毛纤孔菌Ih GH5-1蛋白质与太瑞斯梭孢壳霉和球毛壳菌等子囊菌的糖苷水解酶亲缘关系更近;蛋白质三维结构分析表明粗毛纤孔菌Ih GH5-1含有7个α螺旋、4个β折叠,三维比对表明粗毛纤孔菌Ih GH5-1三维结构与其他真菌糖苷水解酶家族5蛋白空间结构相近,进化关系与最大似然树分析相符;原核表达及酶活测定表明该基因成功表达,表达产物在65℃时相对酶活性最高。【结论】本研究可为白腐菌纤维素酶大规模的工业化应用提供前期研究基础和理论依据。
关键词
粗毛纤孔菌
糖苷
水解
酶
家族
5
水曲柳
木材白色腐朽
Keywords
Inonotus hispidus
glycoside hydrolase family
5
Fraxinus mandshurica
white rote
分类号
S718.81 [农业科学—林学]
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职称材料
题名
瘤胃微生物强化醋糟厌氧消化及其机制
被引量：
7
2
作者
李倩
许之扬
周云龙
何迪
白玲
晏习鹏
阮文权
机构
江南大学环境与土木工程学院
江苏省环境厌氧生物技术重点实验室
出处
《环境科学研究》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2020年第10期2370-2377,共8页
基金
国家自然科学基金项目(No.51678279)。
文摘
针对醋糟中木质纤维素利用效率低的问题,通过接种瘤胃微生物可强化木质纤维素水解.采用逐步提升体系有机负荷的方式,考察瘤胃微生物生物强化对醋糟厌氧消化性能的提升效果,并运用绝对定量实时聚合酶链锁反应(Q-PCR)技术探究其微生物学强化机制.结果表明:长期连续运行成功塑造了高效的木质纤维素瘤胃强化体系.该体系的最高有机负荷达8.90 g/(L·d)(以VS计),是强化前的1.53倍,该有机负荷下半纤维素和纤维素降解率分别达73.9%和40.1%,单位质量底物沼气和甲烷产量相应地分别达到451和261 mL/g(以VS计),半纤维素和纤维素较高的降解率是该体系维持高产气性能的主要原因.生物相机制研究表明,瘤胃微生物强化体系中与木质纤维素水解密切相关的GH5(糖苷水解酶家族5)水解菌逐步富集,其基因拷贝数从初始的964×10^10 copies/g升至最高有机负荷下的6.83×10^11copies/g,这是底物在高有机负荷下仍能被高效生物转化的根本原因.研究显示,瘤胃微生物的介入可有效强化体系底物的降解能力,促进醋糟产甲烷性能的提升.
关键词
醋糟
厌氧消化
木质纤维素
瘤胃
有机负荷
糖苷水解家族5
Keywords
vinegar residue
anaerobic digestion
lignocellulose
rumen
organic loading rates
glycoside hydrolase family
5
分类号
X712 [环境科学与工程—环境工程]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
粗毛纤孔菌糖苷水解酶5基因克隆及蛋白质结构分析
刘晓晗
王峰
董爱荣
陈俏丽
刘立宏
零雅茗
王博文
丁晓霞
王世新
《林业科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2015
0
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职称材料
2
瘤胃微生物强化醋糟厌氧消化及其机制
李倩
许之扬
周云龙
何迪
白玲
晏习鹏
阮文权
《环境科学研究》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2020
7
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职称材料
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