对虾白斑综合症病毒极早期基因启动子筛选文库的构建 被引量：1

1

作者 林梵宇 徐丽美 杨丰 《台湾海峡》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期184-188,共5页

对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是危害对虾养殖业的主要病原,而WSSV极早期基因对病毒功能基因的转录翻译和调控起着至关重要的作用.本研究将WSSV基因组以超声法随机断裂至400～900bp DNA片段,并插入启动子缺失且... 对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是危害对虾养殖业的主要病原,而WSSV极早期基因对病毒功能基因的转录翻译和调控起着至关重要的作用.本研究将WSSV基因组以超声法随机断裂至400～900bp DNA片段,并插入启动子缺失且多克隆位点下游具有报告基因的载体来构建文库,转染昆虫细胞Hi5.倒置荧光显微镜观察发现部分转染后的细胞有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,表明这部分细胞中的DNA片段可能具有极早期启动子活性.流式细胞仪分析显示,这部分荧光细胞占总细胞的比例为0.35%.由于转染效率为50%,可认为占比0.7%的WSSV基因组随机片段能在Hi5细胞中激发下游报告基因的转录翻译,可能具有极早期基因启动子活性.这对于进一步筛选和鉴定WSSV极早期基因及开展极早期启动子研究具有重要的意义. 展开更多

关键词 海洋生物学 对虾白斑综合症病毒 极早期基因 启动子 筛选文库 增强型绿色荧光蛋白

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葡萄脱落酸受体VvPYL4互作蛋白的筛选及互作蛋白基因表达

2

作者 刘丽 王辉 +2 位作者 关天舒 李柏宏 于舒怡 《生物技术通报》 北大核心 2025年第4期188-197,共10页

【目的】ABA受体PYRl/PYLs/RCARs在ABA信号转导通路中起着重要作用。通过酵母双杂交技术筛选葡萄VvPYL4的互作蛋白,探究VvPYL4在葡萄应答霜霉病菌胁迫信号通路中的作用。【方法】以霜霉病菌侵染‘贝达’葡萄叶片为材料,构建cDNA文库;构... 【目的】ABA受体PYRl/PYLs/RCARs在ABA信号转导通路中起着重要作用。通过酵母双杂交技术筛选葡萄VvPYL4的互作蛋白,探究VvPYL4在葡萄应答霜霉病菌胁迫信号通路中的作用。【方法】以霜霉病菌侵染‘贝达’葡萄叶片为材料,构建cDNA文库;构建诱饵表达载体pGBKT7-VvPYL4,通过酵母双杂交技术从cDNA文库中筛选与VvPYL4相互作用的蛋白;通过实时荧光定量PCR分析候选互作蛋白基因在葡萄霜霉病菌诱导下的表达模式,并通过双分子荧光互补技术进行互作蛋白的验证。【结果】构建的酵母双杂交cDNA文库库容为7.16×107 CFU/mL,重组率100%,插入片段大小在1000 bp左右。成功构建诱饵表达载体pGBKT7-VvPYL4,且在酵母细胞中无自激活活性。诱饵载体与酵母双杂交文库共转酵母AH109菌株后,经多次筛库、测序、BLAST比对和回转验证,最终获得53个候选互作蛋白,这些蛋白涉及信号转导、植物生长发育及环境胁迫响应等多个方面。基于实时荧光定量PCR分析,编码4个蛋白的基因均受葡萄霜霉病菌诱导表达。通过双分子荧光互补试验发现,在共转pSPYCEPP2C24和pSPYNE-PYL4表达载体的本氏烟草叶片中可观察到强烈的黄色荧光信号,表明PYL4与PP2C24蛋白之间能够发生相互作用。【结论】成功构建霜霉病菌侵染葡萄叶片的cDNA文库,并筛选出53个与VvPYL4相互作用的候选蛋白,其中4个编码蛋白的基因均响应葡萄霜霉病菌的胁迫诱导,验证了VvPYL4与PP2C24蛋白之间存在相互作用关系。 展开更多

关键词 葡萄霜霉病 脱落酸受体PYL4 cDNA文库筛选 酵母双杂交系统 双分子荧光互补 互作蛋白 蛋白磷酸酶2C

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利用CRISPR/Cas9 sgRNA文库筛选调控结直肠癌对奥沙利铂敏感性的表观遗传相关基因

3

作者 付亚坤 贾林创 穆标 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期1698-1708,共11页

结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,以奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)为基础的联合化疗方案是临床上治疗中晚期病人最常用的策略,但耐药性的产生极大限制了化疗的效果,是导致化疗失败的主要原因。因耐药发生机制未明,亟需一种高通量... 结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,以奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)为基础的联合化疗方案是临床上治疗中晚期病人最常用的策略,但耐药性的产生极大限制了化疗的效果,是导致化疗失败的主要原因。因耐药发生机制未明,亟需一种高通量、高特异性的测序方法探索奥沙利铂耐药性产生的原因。CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)文库筛选是近年快速发展起来高通量筛选肿瘤耐药基因的新技术,但尚未在结直肠癌对奥沙利铂耐药性产生的基因筛选中应用。我们构建了含有5256个小向导RNA(small-guide RNA,sgRNA)的针对910个人类表观遗传相关基因的sgRNA文库,利用慢病毒包装,并通过蛋白质免疫印迹检测,以及流式细胞术检测确定病毒感染的条件,将慢病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)维持在30%以下,使其保证每1个细胞感染1条sgRNA并敲除1个基因;使用慢病毒携带文库感染结直肠癌细胞HCT116和SW620,通过阳性筛选策略获得单克隆并进行扩增,通过测序筛选得到21个调控结直肠癌细胞对奥沙利铂敏感的基因,通过分别敲除候选基因发现,敲除TDRKH、ALKBH3、UNKL、TTF2、TNKS、AURKA、RBM12、ELAVL2、LSM5、NOL8、PRPF 3基因可以显著提高奥沙利铂对结直肠癌细胞的半数致死量(IC_(50))(P<0.05),其中ALKBH3、AURKA和RBM 12等3个基因的高表达与临床的预后具有显著的相关性(总生存期:P=0.043,P<0.0001,P=0.045;无复发生存期:P=0.004,P=0.0019,P=0.0064)。研究证明,CRISPR/Cas9文库是筛选肿瘤敏感性基因的高通量方法,可为进一步探究结直肠癌对奥沙利铂敏感性的机制提供靶点参考。 展开更多

关键词 结直肠癌 奥沙利铂 肿瘤耐药性 CRISPR/Cas9文库筛选

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快速简便筛选cDNA文库的SSS法 被引量：7

4

作者 瞿文全 金治平 +2 位作者 赵德修 陈亚琼 李名扬 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期583-586,共4页

建立了一种快速简便筛选cDNA文库的方法—SSS法(subsectionscreening)。该方法用cDNA噬菌体平板划块分组和根据目的基因设计的一对特异性引物,用PCR技术逐级筛选cDNA文库获得目的基因。与其它筛选cDNA文库的方法相比,该方法范围可控,目... 建立了一种快速简便筛选cDNA文库的方法—SSS法(subsectionscreening)。该方法用cDNA噬菌体平板划块分组和根据目的基因设计的一对特异性引物,用PCR技术逐级筛选cDNA文库获得目的基因。与其它筛选cDNA文库的方法相比,该方法范围可控,目标明确,易于获得目的基因,而且快速、简捷、省时,一般可在一周内筛选出目的基因。本实验室利用该方法在半个月内筛选出了一个查耳酮异构酶(chalconeisomerase)(CHI)基因,一个黄酮类化合物3′ 羟化酶(flavonoid3′hydroxylase)(F3′H)基因,一个热激蛋白(heatshockprotein)(HSP)基因和一个1484bp热激蛋白基因片段。此方法用于同时筛选多个基因,可收到事半功倍的效果,对其它文库筛选也有借鉴意义。 展开更多

关键词 SSS法 CDNA文库 PCR 文库筛选

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杂色鲍Fosmid基因组文库构建与血蓝蛋白基因筛选 被引量：2

5

作者 姜敬哲 张彬彬 +2 位作者 张远 苏友禄 王江勇 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期192-196,202,共6页

以杂色鲍Haliotis diversicolor肌肉组织为材料,按照CopyControlTM Fosmid Library Production Kit中方法构建了杂色鲍Fosmid全基因组文库.从文库中随机挑取50个克隆进行NotⅠ酶切鉴定发现,阳性率达到100%,插入片段大小分布在32～48 kb... 以杂色鲍Haliotis diversicolor肌肉组织为材料,按照CopyControlTM Fosmid Library Production Kit中方法构建了杂色鲍Fosmid全基因组文库.从文库中随机挑取50个克隆进行NotⅠ酶切鉴定发现,阳性率达到100%,插入片段大小分布在32～48 kb之间,平均长度约37.6 kb.随机挑取8个克隆进行正、反向末端测序,获得了全部16个测序结果,其中8条序列确定为鲍来源基因序列.进一步根据杂色鲍血蓝蛋白(Hemocyanin)基因3'端序列设计特异引物,用PCR方法对基因组文库进行筛选,获得一个阳性克隆,经Primer-Walking测序、Blast比对和进化分析证实,该序列为杂色鲍血蓝蛋白Ⅱ型基因克隆. 展开更多

关键词 杂色鲍 FOSMID 基因组文库 血蓝蛋白 文库筛选

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基于PCR技术筛选cDNA和genome文库方法的改进 被引量：5

6

作者 程旭东 董玲丽 凌宏清 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2004年第11期32-37,共6页

提出一种改进的基于PCR技术的cDNA和genome文库筛选新方法。该方法利用PCR手段逐步排除文库中的非阳性克隆组分，提高阳性克隆所占比重，最后得到含有一定数量阳性单克隆的最小克隆群体用于直接挑选单个阳性克隆。在筛选cDNA文库时则增... 提出一种改进的基于PCR技术的cDNA和genome文库筛选新方法。该方法利用PCR手段逐步排除文库中的非阳性克隆组分，提高阳性克隆所占比重，最后得到含有一定数量阳性单克隆的最小克隆群体用于直接挑选单个阳性克隆。在筛选cDNA文库时则增加了一个将噬菌体文库转化成质粒文库的步骤。该方法既保留了常规PCR文库筛选方法的灵敏、快捷和经济的特点，又弥补了其筛选周期相对较长、工作量大，以及随着循环数的增加和提取DNA的难度加大，阳性克隆容易丢失等缺陷，尤其在用于筛选cDNA文库时更是免除了繁琐的滴度、侵染和洗脱过程，极大地提高了筛选的成功率。 展开更多

关键词 CR技术 文库筛选 cDNA文库 文库 滴度 PCR 单克隆 阳性克隆 循环数 质粒

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甘薯近缘种Ipomoea trifida (Kunth) G.Don基因组Fosmid文库构建及PCR筛选体系建立 被引量：2

7

作者 李昂 吴志明 +6 位作者 周志林 赵冬兰 张安 马代夫 李亚栋 唐君 曹清河 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2014年第2期45-50,共6页

为挖掘有价值的基因资源,对甘薯近缘种I.trifida的基因组文库进行了研究。通过流式细胞法测定I.trifida（2x,编号DLP4597）基因组大小为531.699 Mb。以叶片为材料采用包埋法提取基因组DNA,通过物理剪切进行基因组DNA片段化并进行末端平... 为挖掘有价值的基因资源,对甘薯近缘种I.trifida的基因组文库进行了研究。通过流式细胞法测定I.trifida（2x,编号DLP4597）基因组大小为531.699 Mb。以叶片为材料采用包埋法提取基因组DNA,通过物理剪切进行基因组DNA片段化并进行末端平滑化和磷酸化处理,脉冲场电泳回收33-48 kb的DNA片段,然后连接到Fosmid载体pCC1FOS（Epicentre）上,包装转化大肠杆菌EPI300,构建了I.trifida的基因组Fosmid文库,该文库包含101 952个单克隆,保存于1 062个96孔培养板中,平均插入片段35 kb,覆盖基因组约6.7倍,理论上任意片段筛出率达到99.88%。以20个96孔板为一组构建三维PCR筛选体系,共分为53个组（第53组包含22个96孔板）,每组包含1个超级池,20个板池,12个列池,8个行池,理论上最多通过93个PCR反应即可筛选到1个阳性单克隆。随机选择来自I.trifida的10个基因进行文库克隆筛选,平均阳性克隆数为8.2个,最少阳性克隆数为3个,最多为16个。 展开更多

关键词 甘薯近缘野生种 基因组 FOSMID文库 文库筛选体系

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噬菌体cDNA文库筛选方法的改良 被引量：1

8

作者 尚毅 马璐琳 +2 位作者 亓增军 刘大钧 王秀娥 《生物学杂志》 CAS CSCD 2010年第5期91-93,共3页

cDNA文库的构建和简便、快速的筛选是获得全长基因的重要途径,基于PCR的筛库方法具有快捷、灵敏的特点。研究改进了基于PCR的噬菌体cDNA文库筛选方法,用液体分装的方法,替代了文库筛选的关键步骤——涂板分区,省去了噬菌体文库铺平板、... cDNA文库的构建和简便、快速的筛选是获得全长基因的重要途径,基于PCR的筛库方法具有快捷、灵敏的特点。研究改进了基于PCR的噬菌体cDNA文库筛选方法,用液体分装的方法,替代了文库筛选的关键步骤——涂板分区,省去了噬菌体文库铺平板、浸染、培养、划块洗脱的操作过程,使筛库的工作量减少,进一步提高了筛选速度和获得阳性克隆的效率。 展开更多

关键词 噬菌体cDNA文库 PCR 文库筛选 液体分装

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酵母双杂交筛选华北大黑鳃金龟触角均一化cDNA文库 被引量：2

9

作者 王冰 尹姣 +1 位作者 李克斌 曹雅忠 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1127-1134,共8页

昆虫错综复杂的嗅觉系统在昆虫寻找寄主、交配、产卵以及逃避行为中起到了至关重要的作用。因此,对昆虫嗅觉感受机理的研究将有助于揭开昆虫感受和识别环境中的气味物质并引起相关行为反应的秘密。为了更多地了解华北大黑鳃金龟Holotric... 昆虫错综复杂的嗅觉系统在昆虫寻找寄主、交配、产卵以及逃避行为中起到了至关重要的作用。因此,对昆虫嗅觉感受机理的研究将有助于揭开昆虫感受和识别环境中的气味物质并引起相关行为反应的秘密。为了更多地了解华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita Faldermann嗅觉相关蛋白互作机制,本实验利用DUALhunter Starter Kits酵母双杂交筛选试剂盒,构建了华北大黑鳃金龟气味结合蛋白OBP2诱饵载体,筛选了华北大黑鳃金龟触角酵母双杂交系统均一化的cDNA文库。通过β-半乳糖苷酶活性检测以及GenBank中Blast比对分析,以OBP2为诱饵鉴定出6个阳性互作物。我们推测其中的一种较强的阳性互作物凝固酶原可能是华北大黑鳃金龟在嗅觉识别过程中的相关蛋白。 展开更多

关键词 华北大黑鳃金龟 气味结合蛋白 蛋白互作 酵母双杂交 文库筛选

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中国野生葡萄白粉菌诱导cDNA文库中抗病基因的筛选 被引量：1

10

作者 张军科 王静 +2 位作者 王跃进 张朝红 徐炎 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2008年第2期119-123,共5页

【目的】从中国野生华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因。【方法】根据植物抗病基因保守序列NBS位点设计特异引物,对葡萄白粉病接种诱导后的环化cDNA文库进行菌落PCR筛选,从随机挑选的大量菌... 【目的】从中国野生华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因。【方法】根据植物抗病基因保守序列NBS位点设计特异引物,对葡萄白粉病接种诱导后的环化cDNA文库进行菌落PCR筛选,从随机挑选的大量菌落中筛选出82个PCR阳性菌落,提取阳性菌落的质粒进一步进行PCR检测确认,对确认的36个阳性质粒插入片段进行了测序。【结果】测序结果和序列生物信息学分析结果均表明,有3个基因序列与Genbank中的已知序列有较高的同源性,其中1个基因序列与葡萄抗白粉病基因(DT661587.1)序列同源性达99%,另外2个基因序列与水分胁迫下葡萄特异表达基因(DT031657.1)和葡萄抗皮尔斯病基因(CF202948.1)的同源性分别为89%和96%。【结论】初步推测获得的3个基因均为抗性相关基因。 展开更多

关键词 中国野生葡萄 CDNA基因 文库筛选 抗病基因

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用suc2信号肽捕获系统筛选小鼠胚胎cDNA文库基因 被引量：1

11

作者 孙强 黄红艳 +3 位作者 周鹏 冯蕾 秦红 韩骅 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期507-512,共6页

PCR扩增 1 1d小鼠胚胎cDNA文库插入片段 ,将 0 .5～ 2 0kb的扩增产物插入筛选载体的多克隆位点 ,转化suc2基因缺陷酵母宿主菌 .然后将约 1 0 5个酵母菌落接种于选择性平板上进行筛选 ,得到了 1 82个可在选择性培养基上生长的菌落 .PCR... PCR扩增 1 1d小鼠胚胎cDNA文库插入片段 ,将 0 .5～ 2 0kb的扩增产物插入筛选载体的多克隆位点 ,转化suc2基因缺陷酵母宿主菌 .然后将约 1 0 5个酵母菌落接种于选择性平板上进行筛选 ,得到了 1 82个可在选择性培养基上生长的菌落 .PCR扩增显示 ,插入片段大小分布于 0 1～ 1 5kb之间 .对其中 1 4个阳性菌落的重组子进行序列测定 ,分别代表 6种不同的基因序列 ,与报告基因都有正确的读框内融合 .其中两种基因序列反复被筛到 ,分别命名为spt1、spt2 .spt1 [gi:2 772 876 6 ],可能以非编码RNA的身份参与蛋白质向细胞外分泌的过程 ,而spt2编码多个连续的赖氨酸 。 展开更多

关键词 cDNA文库筛选 非编码RNA 蛋白质分泌

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硫藤黄链霉菌基因组表达文库的构建及筛选

12

作者 杨丽鸳 朱梦奕 何璟 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期39-44,共6页

为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制,以链霉菌整合型质粒pJTU2554为载体,构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主,通过生物活性筛选获得9株具有抑菌活性的异源表达突变菌... 为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制,以链霉菌整合型质粒pJTU2554为载体,构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主,通过生物活性筛选获得9株具有抑菌活性的异源表达突变菌株,同时通过PCR筛选获得多个含有聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的克隆子。TLC及HPLC-MS分析发现6个携带有aureothin生物合成基因簇的cosmid,通过异源表达在变铅青链霉菌中成功合成聚酮类抗生素aureothin,证实文库异源表达及筛选的有效性。 展开更多

关键词 硫藤黄链霉菌 天然产物 基因组文库 异源表达 文库筛选

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利用番茄cDNA酵母双杂交文库筛选Pti4互作蛋白 被引量：6

13

作者 王洋 张政 +4 位作者 王莹莹 冯国栋 陈丹阳 周宇 牛向丽 《安徽农业科学》 CAS 2019年第18期111-114,共4页

以番茄的根、叶、花及不同发育时期的果实提取RNA,构建酵母双杂交文库。经检测,文库容量为1.1×10 7 CFU,阳性率大于95%,插入片段平均长度大于1 000 bp,可用于互作蛋白的筛选。依据番茄抗病途径相关基因 Pti4 编码序列设计引物,构... 以番茄的根、叶、花及不同发育时期的果实提取RNA,构建酵母双杂交文库。经检测,文库容量为1.1×10 7 CFU,阳性率大于95%,插入片段平均长度大于1 000 bp,可用于互作蛋白的筛选。依据番茄抗病途径相关基因 Pti4 编码序列设计引物,构建重组诱饵载体并转化酵母菌,筛选与Pti4相互作用的蛋白质。经初步检测获得6个可能与Pti4互作的转录因子,为进一步研究番茄 Pti 基因的作用机制提供了基础。 展开更多

关键词 番茄 酵母双杂交 Pti4 文库筛选 蛋白质相互作用

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番茄叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及Pti互作蛋白筛选 被引量：4

14

作者 王洋 王莹莹 +3 位作者 张政 冯国栋 周宇 牛向丽 《合肥工业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2021年第10期1420-1424,共5页

酵母双杂交技术作为检测蛋白质之间相互作用的有效手段,不仅能验证与已知蛋白质的相互作用,还可从文库中筛选与特定蛋白互作的未知蛋白。文章为研究番茄抗病相关蛋白Pti(Pto interaction protein)的生物学功能,筛选与其互作的蛋白,以未... 酵母双杂交技术作为检测蛋白质之间相互作用的有效手段,不仅能验证与已知蛋白质的相互作用,还可从文库中筛选与特定蛋白互作的未知蛋白。文章为研究番茄抗病相关蛋白Pti(Pto interaction protein)的生物学功能,筛选与其互作的蛋白,以未处理野生型番茄叶片、真空渗透法接种丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC 3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000)的感病株系prf3、抗性株系PtoR的植株叶片提取RNA,构建酵母双杂交文库。经检测,文库容量为1.25×107 CFU,阳性率大于95%,插入片段平均长度约1200 bp。通过构建Pti5重组诱饵载体并转化酵母菌,筛选与其相互作用的蛋白质。初步获得的Pti5互作的靶标基因,可用于进一步研究番茄抗病基因Pti的作用机制。 展开更多

关键词 番茄 丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pst DC3000) 酵母双杂交 文库筛选 蛋白质相互作用

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基于CRISPR基因文库筛选前列腺癌中的RNA结合蛋白及其功能性研究

15

作者 费腾 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期769-770,共2页

RNA在细胞生命活动中发挥着重要作用,既能作为遗传信息的传递者,又能作为重要的结构和功能性分子,参与RNA转录、蛋白质翻译、基因表达调控等生物学进程。RNA一经转录,通常就会和多种特异性的RNA结合蛋白相结合,其命运和功能受到后者的... RNA在细胞生命活动中发挥着重要作用,既能作为遗传信息的传递者,又能作为重要的结构和功能性分子,参与RNA转录、蛋白质翻译、基因表达调控等生物学进程。RNA一经转录,通常就会和多种特异性的RNA结合蛋白相结合,其命运和功能受到后者的严密调控。因此。 展开更多

关键词 前列腺癌 CRISPR 结合蛋白 RNA 功能性 文库筛选

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96孔板-PCR排除法筛选猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因 被引量：1

16

作者 魏冬霞 邓艳 +3 位作者 吴绍强 林瑞庆 宋慧群 朱兴全 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期731-733,共3页

为了从猪蛔虫雌虫cDNA文库中筛选出猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因,本研究根据猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因的EST序列为模板设计引物,采用96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选,并筛选出阳性克隆F993-G10-A10。测序结果表明,该基因序列... 为了从猪蛔虫雌虫cDNA文库中筛选出猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因,本研究根据猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因的EST序列为模板设计引物,采用96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选,并筛选出阳性克隆F993-G10-A10。测序结果表明,该基因序列长621bp,有完整的3'端。经BLAST分析,其推导的氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(C.elegans)的卵黄蛋白原基因(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)的氨基酸序列的一致性分别为35%、35%、34%、34%和35%,核苷酸序列相似性分别为55%、57%、54%、54%和53%。该阳性克隆的获得为该基因的深入研究奠定了基础。同时也证明了96孔-PCR排除法是一种高效、简便、低成本的筛选文库方法。 展开更多

关键词 旋猪蛔虫 卵黄蛋白原基因 96孔板-PCR排除法 文库筛选

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小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定 被引量：6

17

作者 李立群 王冰心 +1 位作者 吕千 杨智全 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期948-957,共10页

以中国春小麦叶、茎、幼穗及花后3、6、9、12、15、20、25d的籽粒为材料,利用Gateway技术构建中国春小麦cDNA初级文库和次级文库,由次级文库质粒转化Y187酵母菌株构建出酵母双杂交文库。通过mating法筛选小麦粒质量基因TaDAR1的互作蛋白... 以中国春小麦叶、茎、幼穗及花后3、6、9、12、15、20、25d的籽粒为材料,利用Gateway技术构建中国春小麦cDNA初级文库和次级文库,由次级文库质粒转化Y187酵母菌株构建出酵母双杂交文库。通过mating法筛选小麦粒质量基因TaDAR1的互作蛋白,以此来鉴定文库的有效性。结果表明:初级文库容量为1.82×10^(7) CFU/mL、次级文库的容量为1.91×10^(7) CFU/mL,文库重组率均大于96%,插入片段平均长度在1000bp以上。酵母双杂交文库转化效率为1.97×10^(5)CFU/μg,文库容量为2.04×10^(7)CFU/mL。构建诱饵载体pGBKT7-TaDAR1并转化Y2H酵母菌株,经检验存在自激活现象,进一步截断检测发现此蛋白N端无自激活,C端有自激活,以BD-TaDAR1-N为诱饵载体,筛选酵母文库,获得其互作蛋白序列,并命名为Ta-DAR1IP,经回转验证TaDAR1-N与TaDAR1IP存在相互作用关系。表明本试验方案构建的酵母文库是高质量的有效的。为初学者构建酵母双杂文库及使用“mating”法筛选酵母文库提供借鉴,也为后续小麦基因功能的研究奠定基础。 展开更多

关键词 小麦 酵母双杂交文库 自激活检测 文库筛选

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基于CRISPR-Cas9技术的鸡成纤维细胞系全基因组敲除文库的建立与初步应用 被引量：3

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作者 徐娟 刘忠媛 +7 位作者 刘彦峰 廖瑛 仇旭升 宋翠萍 谭磊 刘玮炜 孙英杰 丁铲 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第5期50-59,共10页

CRISPR-Cas9已被广泛证实是高效强大的第三代基因编辑工具。高通量且系统无偏的靶向全基因组水平编辑技术的应用对充分理解基因功能具有重要的意义。基于CRISPR-Cas9技术的大规模筛选方法已在哺乳动物研究领域取得重要进展,尽管鸡全基... CRISPR-Cas9已被广泛证实是高效强大的第三代基因编辑工具。高通量且系统无偏的靶向全基因组水平编辑技术的应用对充分理解基因功能具有重要的意义。基于CRISPR-Cas9技术的大规模筛选方法已在哺乳动物研究领域取得重要进展,尽管鸡全基因组测序的工作已完成,但至今尚未有关于禽类CRISPR-Cas9文库的研究,严重限制了对其基因功能的解析。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建鸡成纤维细胞系(DF-1)细胞全基因组敲除文库,并利用新城疫病毒(NDV)感染DF-1文库细胞,经过高通量测序筛选到sgRNA富集程度排名前10的影响NDV复制的关键宿主因子。该研究首次构建了鸡CRISPR-Cas9文库筛选模型,为进一步研究家禽免疫学、病毒学等提供强大高效的工具。 展开更多

关键词 CRISPR-Cas9文库筛选 DF-1细胞 新城疫病毒 c-C基序趋化因子类26

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消减cDNA文库差异表达基因检测分析方法的研究进展 被引量：1

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作者 岳洋 王栋 +4 位作者 郝海生 杜卫华 赵学明 朱化彬 路永强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第10期100-104,共5页

同已有的差异表达基因分离方法相比,抑制消减杂交以其快速、高效及假阳性率低等优点被广泛应用,并形成了反向Northern斑点杂交和表达谱基因芯片技术2种差减cDNA文库筛选方法,同时,快速发展的生物信息学为文库中大量阳性差异表达片段的... 同已有的差异表达基因分离方法相比,抑制消减杂交以其快速、高效及假阳性率低等优点被广泛应用,并形成了反向Northern斑点杂交和表达谱基因芯片技术2种差减cDNA文库筛选方法,同时,快速发展的生物信息学为文库中大量阳性差异表达片段的序列分析提供了最有力的技术手段,而RT-PCR和实时荧光定量PCR为进一步在mRNA水平验证基因的表达差异性和初步揭示基因功能奠定了技术基础。作者在简要综述上述各方法的原理、特点及应用基础上指出,先测序后筛库的研究策略可以在成本增加较低的前提下大幅度提高差异表达基因的研究效率。 展开更多

关键词 文库筛选 差异表达基因 检测分析

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酵母双杂交筛选与星状病毒衣壳蛋白ORF2互作的宿主蛋白 被引量：3

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作者 李香雨 于漫 +4 位作者 聂梓陶 陈彦如 王嘉会 韩喜彬 赵微 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期491-495,共5页

目的筛选人星状病毒(HAstV)衣壳蛋白ORF2与宿主细胞互作的蛋白质。方法构建HAstV ORF2蛋白的重组载体pGBKT77-ORF2,以其作为诱饵质粒,采用酵母双杂交方法,从人结肠癌细胞Caco-2 cDNA文库中筛选与ORF2蛋白互作的蛋白。以HAstV-1病毒株的... 目的筛选人星状病毒(HAstV)衣壳蛋白ORF2与宿主细胞互作的蛋白质。方法构建HAstV ORF2蛋白的重组载体pGBKT77-ORF2,以其作为诱饵质粒,采用酵母双杂交方法,从人结肠癌细胞Caco-2 cDNA文库中筛选与ORF2蛋白互作的蛋白。以HAstV-1病毒株的衣壳蛋白为模板,通过PCR扩增定向克隆构建诱饵载体pGBKT7-ORF2。通过菌落PCR和测序验证质粒在酵母细胞Y2H中正确表达。明确ORF2蛋白对酵母细胞无毒性,无自激活活性。将含有pGBKT7-ORF2的酵母菌株与靶标Caco-2 cDNA文库进行杂交、筛选、验证及测序。结果获得15个与ORF2互作的宿主蛋白,分别为FN1、COMMD1、RASAL2、BMP4、RPL11、RBM8A、SUMO1、WWC2、NGDN、HINFP、RPS7、IMMT、UBE2I、EEF1A1和FTL。结论成功筛选出15个与HAstV ORF2互作的蛋白,为研究星状病毒与宿主相互作用、ORF2蛋白功能及病毒的致病机制奠定了基础。 展开更多

关键词 星状病毒 酵母双杂交 ORF2蛋白 蛋白互作 cDNA文库筛选

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