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裂殖酵母Shelterin五元复合物的电镜结构研究
1
作者
鲁彦伽
孙虹
+1 位作者
吴振芳
雷鸣
《上海交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第3期290-297,共8页
目的·通过电子显微镜(电镜)和负染技术分析裂殖酵母端粒结合蛋白质Shelterin五元复合物(Rap1-Poz1-Tpz1-Ccq1-Pot1)的三维结构。方法·利用大肠埃希菌表达系统在体外重组和表达带有组氨酸-小分子泛素相关修饰物蛋白(histidine-...
目的·通过电子显微镜(电镜)和负染技术分析裂殖酵母端粒结合蛋白质Shelterin五元复合物(Rap1-Poz1-Tpz1-Ccq1-Pot1)的三维结构。方法·利用大肠埃希菌表达系统在体外重组和表达带有组氨酸-小分子泛素相关修饰物蛋白(histidine-small ubiquitin related modifier,His-SUMO)和谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)纯化标签的目的蛋白质,通过两步亲和层析(镍离子金属螯合亲和层析、谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析)以及一步凝胶过滤层析(SuperoseTM610/300 GL)分离纯化目的蛋白质复合物。采用0.75%甲酸双氧铀对蛋白质样品进行染色,用120 kV透射电镜观察,放大倍数设置为92000倍,收集颗粒分散性较好的负染照片。用EMAN2软件和Relion3.0软件,通过单颗粒重构技术研究裂殖酵母Shelterin复合物的三维结构,最后利用UCSF Chimera软件对裂殖酵母Shelterin复合物的重构模型进行分析。结果·经过两步亲和层析以及凝胶过滤层析获得纯度高、组分齐、均一性良好的重组裂殖酵母Shelterin五元复合物的蛋白质样品;利用120 kV透射电镜获得负染电镜照片83张,从中挑选18659个蛋白质复合物颗粒进行三维模型构建,初步解析了该复合物的三维结构;将重构模型与已报道的蛋白质组分的高分辨率结构进行分子对接,确定各组分在复合物中的定位情况,揭示该复合物以二聚体的形式存在。结论·构建了裂殖酵母Shelterin五元复合物(Rap1-Poz1-Tpz1-Ccq1-Pot1)的低分辨率的三维模型。
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关键词
端粒
端粒末端保护
Shelterin复合物
电子显微镜
负染
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职称材料
题名
裂殖酵母Shelterin五元复合物的电镜结构研究
1
作者
鲁彦伽
孙虹
吴振芳
雷鸣
机构
上海交通大学医学院附属第九人民医院上海精准医学研究院
出处
《上海交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第3期290-297,共8页
基金
国家重点研发计划(2018YFA0107004)
国家自然科学基金(31930063)。
文摘
目的·通过电子显微镜(电镜)和负染技术分析裂殖酵母端粒结合蛋白质Shelterin五元复合物(Rap1-Poz1-Tpz1-Ccq1-Pot1)的三维结构。方法·利用大肠埃希菌表达系统在体外重组和表达带有组氨酸-小分子泛素相关修饰物蛋白(histidine-small ubiquitin related modifier,His-SUMO)和谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)纯化标签的目的蛋白质,通过两步亲和层析(镍离子金属螯合亲和层析、谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析)以及一步凝胶过滤层析(SuperoseTM610/300 GL)分离纯化目的蛋白质复合物。采用0.75%甲酸双氧铀对蛋白质样品进行染色,用120 kV透射电镜观察,放大倍数设置为92000倍,收集颗粒分散性较好的负染照片。用EMAN2软件和Relion3.0软件,通过单颗粒重构技术研究裂殖酵母Shelterin复合物的三维结构,最后利用UCSF Chimera软件对裂殖酵母Shelterin复合物的重构模型进行分析。结果·经过两步亲和层析以及凝胶过滤层析获得纯度高、组分齐、均一性良好的重组裂殖酵母Shelterin五元复合物的蛋白质样品;利用120 kV透射电镜获得负染电镜照片83张,从中挑选18659个蛋白质复合物颗粒进行三维模型构建,初步解析了该复合物的三维结构;将重构模型与已报道的蛋白质组分的高分辨率结构进行分子对接,确定各组分在复合物中的定位情况,揭示该复合物以二聚体的形式存在。结论·构建了裂殖酵母Shelterin五元复合物(Rap1-Poz1-Tpz1-Ccq1-Pot1)的低分辨率的三维模型。
关键词
端粒
端粒末端保护
Shelterin复合物
电子显微镜
负染
Keywords
telomere
telomere end-protection
Shelterin complex
electron microscopy
negative-staining
分类号
Q518.2 [生物学—生物化学]
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题名
作者
出处
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1
裂殖酵母Shelterin五元复合物的电镜结构研究
鲁彦伽
孙虹
吴振芳
雷鸣
《上海交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022
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