利用DNA环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)设计一对外引物和一对内引物,通过引物特异性识别tlh基因上的六个独立区域来快速检测副溶血弧菌。同时将检测结果与PCR方法进行比较。结果表明,LAMP...利用DNA环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)设计一对外引物和一对内引物,通过引物特异性识别tlh基因上的六个独立区域来快速检测副溶血弧菌。同时将检测结果与PCR方法进行比较。结果表明,LAMP反应在65℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;肉眼观察阳性结果出现白色混浊现象,添加1×SYBRGreenI荧光染料后,绿色的阳性结果很明显区别于橙色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为10CFU/ml,PCR方法为103CFU/ml,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法的100倍。因此,LAMP方法用于快速检测副溶血弧菌具有检测过程简单、反应结果肉眼即辨别并且灵敏度高特异性强的特点。实验装置简便,能够提供稳定热源即可,所以LAMP方法特别适合于现场快速诊断。展开更多
鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)是一种高致病性病原,对鲤科鱼类造成巨大危害,被世界动物卫生组织列为必须通报疫病。2002年,鲤春病毒血症(spring viremia of carp,SVC)在中国首次检出后,迅速在全国蔓延,给我国鲤...鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)是一种高致病性病原,对鲤科鱼类造成巨大危害,被世界动物卫生组织列为必须通报疫病。2002年,鲤春病毒血症(spring viremia of carp,SVC)在中国首次检出后,迅速在全国蔓延,给我国鲤鱼养殖业造成巨大威胁。因此,我国农业农村部将其列为二类动物疫病。迄今为止,早期、快速、准确的诊断仍然是控制其传播和流行的重要手段。本研究基于CRISPR/Cas13a系统结合重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA),通过对GenBank上登录的SVCV全基因序列比对,针对SVCV聚合酶L基因高度保守的区域设计了一组RAA扩增引物和相应crRNA;建立了一种可用于SVCV现场快速检测的RAA-CRISPR/Cas13a的方法,可以覆盖SVCV的4种不同基因型(Ia、Ib、Ic和Id)。按照世界动物卫生组织推荐的检测方法验证程序,经实验验证该检测方法有较好的重复性,最低检出限为115 copies/μL,与其他病原之间不发生交叉反应。通过对实验室分离保存的60份来自进出境水生动物疫病监测、国内重大水生动物疫病监测以及攻毒实验的样本进行检测,RAA-CRISPR/Cas13a检测结果与实时荧光定量PCR、套式RT-PCR和病毒分离培养结果完全一致,诊断灵敏度和诊断特异性均达到100%。采用本研究建立的方法在4个不同实验室开展比对,在相同条件下对20份样本进行检测,4个实验室的检测结果一致。结果表明,本研究建立的方法重现性良好,为首次采用CRISPR-Cas13a系统进行SVCV检测的研究,对SVCV快速诊断和防控具有重要现实意义。展开更多
文摘利用DNA环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)设计一对外引物和一对内引物,通过引物特异性识别tlh基因上的六个独立区域来快速检测副溶血弧菌。同时将检测结果与PCR方法进行比较。结果表明,LAMP反应在65℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;肉眼观察阳性结果出现白色混浊现象,添加1×SYBRGreenI荧光染料后,绿色的阳性结果很明显区别于橙色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为10CFU/ml,PCR方法为103CFU/ml,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法的100倍。因此,LAMP方法用于快速检测副溶血弧菌具有检测过程简单、反应结果肉眼即辨别并且灵敏度高特异性强的特点。实验装置简便,能够提供稳定热源即可,所以LAMP方法特别适合于现场快速诊断。
文摘鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)是一种高致病性病原,对鲤科鱼类造成巨大危害,被世界动物卫生组织列为必须通报疫病。2002年,鲤春病毒血症(spring viremia of carp,SVC)在中国首次检出后,迅速在全国蔓延,给我国鲤鱼养殖业造成巨大威胁。因此,我国农业农村部将其列为二类动物疫病。迄今为止,早期、快速、准确的诊断仍然是控制其传播和流行的重要手段。本研究基于CRISPR/Cas13a系统结合重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA),通过对GenBank上登录的SVCV全基因序列比对,针对SVCV聚合酶L基因高度保守的区域设计了一组RAA扩增引物和相应crRNA;建立了一种可用于SVCV现场快速检测的RAA-CRISPR/Cas13a的方法,可以覆盖SVCV的4种不同基因型(Ia、Ib、Ic和Id)。按照世界动物卫生组织推荐的检测方法验证程序,经实验验证该检测方法有较好的重复性,最低检出限为115 copies/μL,与其他病原之间不发生交叉反应。通过对实验室分离保存的60份来自进出境水生动物疫病监测、国内重大水生动物疫病监测以及攻毒实验的样本进行检测,RAA-CRISPR/Cas13a检测结果与实时荧光定量PCR、套式RT-PCR和病毒分离培养结果完全一致,诊断灵敏度和诊断特异性均达到100%。采用本研究建立的方法在4个不同实验室开展比对,在相同条件下对20份样本进行检测,4个实验室的检测结果一致。结果表明,本研究建立的方法重现性良好,为首次采用CRISPR-Cas13a系统进行SVCV检测的研究,对SVCV快速诊断和防控具有重要现实意义。
