Der p2重组胞壁型E.coli-BCG穿梭表达载体的构建和鉴定 被引量：9

1

作者 史皆然 李元 +2 位作者 戚好文 李别虎 范雄林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期132-135,共4页

目的 :构建能够携带外源蛋白屋尘螨抗原 (Derp2 )基因并能在胞壁表达的E .coli BCG穿梭载体。方法 :用PCR技术 ,从结核分支菌毒株H37Rv基因中 ,扩增结核分支杆菌 19kDa抗原的胞壁区及其上游调控元件 (19 ss)基因 ,并克隆入含有Derp2基因... 目的 :构建能够携带外源蛋白屋尘螨抗原 (Derp2 )基因并能在胞壁表达的E .coli BCG穿梭载体。方法 :用PCR技术 ,从结核分支菌毒株H37Rv基因中 ,扩增结核分支杆菌 19kDa抗原的胞壁区及其上游调控元件 (19 ss)基因 ,并克隆入含有Derp2基因的E .coli BCG穿梭载体 pOLYG中。用间接免疫荧光染色法 ,检测该载体能够携带并表达的Derp2基因在牡牛分支杆菌宿主中表达。结果 :经测序证实 ,所克隆的 19 ss基因序列正确。所构建的含有 19 ss基因的E .coli BCG穿梭载体 (pCW )能完成在大肠杆菌和牡牛分支杆菌细胞之间的穿梭 ,并介导抗生素抗性基因表达。经免疫荧光检查 ,外源基因Derp2以脂蛋白的形式表达于分支杆菌宿主的表面。 结论 :成功地构建了以胞壁嵌合形式表达外源蛋白的E .coli 展开更多

关键词 尘螨抗原 E.coli-BCG穿梭表达载体 结核分支杆菌 调控元件基因 脑壁嵌合形式 外源基因

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结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因穿梭表达载体的构建及在BCG中的表达 被引量：7

2

作者 陈全 朱道银 +2 位作者 骆旭东 蒋英 江山 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第2期105-108,共4页

目的　构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法　以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重... 目的　构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法　以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重组 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG ,将rBCG培养 2 3天 ,于收菌前 3天每天 4 5℃热诱导 4 5min ,对表达产物作SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果　重组质粒 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6经酶切及测序证实构建成功 ,并在BCG中经热诱导成功表达出了具有CFP10及ESAT6抗原性的CFP10 -ESAT6融合蛋白。结论　成功构建能表达CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组BCG ,为发展新型结核病疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 lhp—esat6融合基因 穿梭表达载体 构建 BCG 表达

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hGM-CSF基因穿梭表达载体的构建及其在鱼腥藻7120中的克隆 被引量：6

3

作者 魏兰珍 金锐 +3 位作者 马为民 施定基 甘人宝 王全喜 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期436-440,共5页

人粒—巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)作为一种造血生长因子,能够刺激T细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化,具有极其重要的免疫调解功能。本研究运用PCR方法,从质粒pAG-MT-8中克隆该基因,并在其5′端添加有利于在蓝藻细胞中高效表达的SD序... 人粒—巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)作为一种造血生长因子,能够刺激T细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化,具有极其重要的免疫调解功能。本研究运用PCR方法,从质粒pAG-MT-8中克隆该基因,并在其5′端添加有利于在蓝藻细胞中高效表达的SD序列,然后插入到表达载体(pRL-439)强启动子PpsbA的下游,进一步与穿梭表达载体pDC-08相连构建成穿梭表达载体pDC-GM。利用三亲接合转移方法将该穿梭表达载体(pDC-GM)转入丝状鱼腥藻7120,通过相应抗生素筛选后得到能稳定遗传的转基因藻。以该转基因藻的基因组DNA为模板进行PCR检测,结果表明hGM-CSF基因已转入鱼腥藻7120。这是首次尝试把蓝藻作为制备重组hGM-CSF的新宿主,具有潜在的经济价值和社会效益。 展开更多

关键词 基因穿梭表达载体 鱼腥藻7120 基因克隆 人粒-巨噬细胞集落刺激因子 造血生长因子

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穿梭表达载体pYG43的构建及碱性纤维素酶基因的分泌表达 被引量：5

4

作者 马磊 蔡勇 +6 位作者 杨明明 李青旺 樊俊华 祁艳霞 吴迪 张西峰 齐枫 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2005年第3期448-450,共3页

用枯草杆菌强启动子P43构建了大肠杆菌 -枯草杆菌穿梭表达载体pYG43 ,其可在大肠杆菌胞内高效表达β 半乳糖苷酶 (最高达92 0 0U)。利用该载体分泌表达了枯草杆菌碱性纤维素酶 (最高达 60U/ml) ,在原宿主菌 (B .subtilis 1A747)的基础... 用枯草杆菌强启动子P43构建了大肠杆菌 -枯草杆菌穿梭表达载体pYG43 ,其可在大肠杆菌胞内高效表达β 半乳糖苷酶 (最高达92 0 0U)。利用该载体分泌表达了枯草杆菌碱性纤维素酶 (最高达 60U/ml) ,在原宿主菌 (B .subtilis 1A747)的基础上提高了 5～ 7倍。 展开更多

关键词 启动子P43 穿梭表达载体 碱性纤维素酶

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Kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体的构建 被引量：1

5

作者 郑合明 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2002年第2期156-159,共4页

目的 :构建含有目的基因kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体。方法 :应用RT PCR方法 ,从正常人肝脏组织中获得kringle 5基因 ,测序后 ,再通过DNA重组技术 ,将kringle 5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI12 1和pCAMBIA330 1上。结... 目的 :构建含有目的基因kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体。方法 :应用RT PCR方法 ,从正常人肝脏组织中获得kringle 5基因 ,测序后 ,再通过DNA重组技术 ,将kringle 5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI12 1和pCAMBIA330 1上。结果 :得到的kringle 5基因序列测定结果与文献相符 ,重组载体pB1k5和pC33k5经酶切鉴定正确 ,含有植物高效表达CaMV35S启动子。结论 :重组载体pB1k5和pC33k5不仅可以在大肠杆菌中稳定复制 。 展开更多

关键词 血管抑素 kringle5基因 穿梭表达载体 反转录PCR 启动子CaMV35S 真核植物细胞

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基于rhaSR嵌合操纵子的穿梭表达载体及其在鱼腥藻细胞中表达的初步研究

6

作者 贺根和 肖宜安 +1 位作者 许东风 喻富根 《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第5期130-135,共6页

通过PCR等基因重组技术,以pKT-215(起源于RSF1010)为载体,构建了带有PR序列(含rhaSR操纵子表达调控元件、rhaR基因、报告基因gst的嵌合操纵子)和PT序列(含rhaSR操纵子表达调控元件及rhaT基因)的二种穿梭表达载体pKT-PTR、pKT-PR。其中,... 通过PCR等基因重组技术,以pKT-215(起源于RSF1010)为载体,构建了带有PR序列(含rhaSR操纵子表达调控元件、rhaR基因、报告基因gst的嵌合操纵子)和PT序列(含rhaSR操纵子表达调控元件及rhaT基因)的二种穿梭表达载体pKT-PTR、pKT-PR。其中,在RhaR基因上游设计和插入了增强的SD序列。首先将pKT-PTR、pKT-PR分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同培养基条件下,即含鼠李糖与不含鼠李糖的培养基中进行表达,紫外分光光度计测定GST蛋白(谷胱甘肽-S-转移酶)的活性。结果表明,含嵌合操纵子的穿梭表达载体能在L-鼠李糖的诱导下表达,gst基因的表达量诱导条件下比非诱导条件下高3倍左右,且表达载体上的rhaT基因并不能提高gst的表达;其次,利用三亲结合的方法将2种表达质粒转入鱼腥藻Anabaena sp.PCC7120中,抗生素筛选后得到能稳定遗传的转基因藻,并以转基因藻的质粒DNA为模板进行PCR检测。最后,转基因藻GST酶活力分析结果表明,嵌合操纵子PR在蓝藻细胞中的诱导表达效率极低,表达条件还需进一步优化。尝试将诱导型的操纵子转入蓝藻,具有潜在的应用价值。 展开更多

关键词 嵌合操纵子 穿梭表达载体 三亲结合 基因表达

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内切葡聚糖酶基因在穿梭载体中的表达研究

7

作者 杨荣 顾明 夏先林 《山地农业生物学报》 2012年第2期111-115,共5页

将无信号肽编码序列的内切葡聚糖酶基因(GenBankNo.DQ782954)与表达载体PMK4连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-PMK4-egls,并将提取的质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600原生质体内,获工程菌WB600-PMK4-egls。同时,通过刚果红染... 将无信号肽编码序列的内切葡聚糖酶基因(GenBankNo.DQ782954)与表达载体PMK4连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-PMK4-egls,并将提取的质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600原生质体内,获工程菌WB600-PMK4-egls。同时,通过刚果红染色和SDS-PAGE分析表明,该基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达。通过优化培养基因工程菌,胞外上清液中的酶活力达998U,该酶促反应的最适温度为60℃,最适pH为6.0,且pH在4.5～7.5,温度在30℃～65℃范围内,可保持最高酶活的70%以上。 展开更多

关键词 内切葡聚糖酶基因 枯草芽孢杆菌 原核表达 穿梭表达载体 酶学性质

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木糖异构酶基因xylA表达载体构建 被引量：1

8

作者 杨柳 叶菁 +2 位作者 陈小燕 许敬亮 袁振宏 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2014年第3期9-13,共5页

以大肠埃希菌MG1655的基因组为模板,通过PCR扩增获得木糖异构酶基因xylA。利用敲除编码对基因转录起负调控作用的lacIq基因的大肠埃希菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC-XK99E,酶连后转化大肠埃希菌BL21和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。成功构建出... 以大肠埃希菌MG1655的基因组为模板,通过PCR扩增获得木糖异构酶基因xylA。利用敲除编码对基因转录起负调控作用的lacIq基因的大肠埃希菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC-XK99E,酶连后转化大肠埃希菌BL21和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。成功构建出了具有大肠埃希菌BL21表达活性的木糖异构酶表达载体pEC(lacI-)-xylA。 展开更多

关键词 谷氨酸棒杆菌 木糖异构酶基因 穿梭表达载体

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枯草芽孢杆菌表达载体的构建及猪源表皮生长因子的表达 被引量：3

9

作者 董兵 肖童 +4 位作者 李志辉 李聪 季明月 陈海清 檀建新 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期71-76,共6页

本文首先以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)穿梭载体pDG150为基础,构建了含有5个克隆位点的表达载体pTD160,并在此基础上构建了带有淀粉酶信号肽的分泌表达载体pTD161和可用于外源蛋白与胞衣蛋白cotG融合表达的表面展示载体pTD162。将脂肪酶基... 本文首先以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)穿梭载体pDG150为基础,构建了含有5个克隆位点的表达载体pTD160,并在此基础上构建了带有淀粉酶信号肽的分泌表达载体pTD161和可用于外源蛋白与胞衣蛋白cotG融合表达的表面展示载体pTD162。将脂肪酶基因lipa分别插入pTD161和pTD162,在B.subtilis 168中表达,其LipA酶活性分别为23.4U/mg和15.3U/mg,表明pTD载体具有良好的表达性能。通过无抗生素压力传代培养10代后,发现其稳定性仍为96.5%和95.0%,证明pTD载体具备较高的稳定性。将密码子优化后的猪源表皮生长因子基因pegf分别导入pTD161和pTD162,转化B.subtilis 168获得工程菌Bs168-pTD161-pegf和Bs168-pTD162-pegf,ELISA法证明pEGF在工程菌中表达量分别达到365ng/mL和285ng/mL,证明pEGF获得高效表达和展示。 展开更多

关键词 枯草芽孢杆菌 穿梭表达载体 表面展示载体 pEGF lipaseA

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启动子对木糖异构酶基因在谷氨酸棒杆菌中表达的影响 被引量：3

10

作者 杨柳 许敬亮 +1 位作者 陈小燕 袁振宏 《新能源进展》 2014年第5期353-357,共5页

以大肠杆菌的强启动子Ptrc和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的内源强启动子Pgro作为大肠杆菌的木糖异构酶基因xylA在谷氨酸棒杆菌中表达的转录起始元件,通过实验表明谷氨酸棒杆菌自身的强启动子Pgro能有效促使外源基因xylA在谷氨酸棒杆菌ATCC 1... 以大肠杆菌的强启动子Ptrc和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的内源强启动子Pgro作为大肠杆菌的木糖异构酶基因xylA在谷氨酸棒杆菌中表达的转录起始元件,通过实验表明谷氨酸棒杆菌自身的强启动子Pgro能有效促使外源基因xylA在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中的表达,同时,核糖体结合位点RBS序列的优化对目的基因的表达水平有一定的影响。 展开更多

关键词 谷氨酸棒杆菌 木糖异构酶基因 穿梭表达载体 启动子 核糖体结合位点

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植物乳杆菌melA基因的克隆及其作为食品级筛选标记的初步研究 被引量：3

11

作者 任大勇 李昌 +3 位作者 秦艳青 杜寿文 诸晴丽 金宁一 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第9期135-139,共5页

以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术成功克隆α-半乳糖苷酶基因(melA基因),与报道的melA基因序列同源性达到99%以上。再以大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e为基本骨架,将melA基因插入该载体,构建melA基因标记的穿梭表... 以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术成功克隆α-半乳糖苷酶基因(melA基因),与报道的melA基因序列同源性达到99%以上。再以大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e为基本骨架,将melA基因插入该载体,构建melA基因标记的穿梭表达载体pMG36e-melA。重组表达质粒pMG36e-melA经Sac I和Sph I双酶切和PCR鉴定与预期片段大小相符。结果表明已初步构建了以melA基因为食品级筛选标记的重组载体。 展开更多

关键词 Α-半乳糖苷酶 melA基因 食品级筛选标记 穿梭表达载体 乳酸乳球菌

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重组卡介苗的应用研究及进展 被引量：1

12

作者 罗文武 刘姣 +2 位作者 朱元东 刘贵军 于高水 《山东畜牧兽医》 2016年第4期47-49,共3页

卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine,BCG）是牛结核分枝杆菌的突变株。上世纪二十年代卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine,BCG）被用于接种新生儿来预防结核病。在其安全性被确定后,卡介苗被在全世界范围内推广应用,是目... 卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine,BCG）是牛结核分枝杆菌的突变株。上世纪二十年代卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine,BCG）被用于接种新生儿来预防结核病。在其安全性被确定后,卡介苗被在全世界范围内推广应用,是目前官方承认的预防结核病最安全有效的疫苗[2],是WHO推荐的,出生时预防接种的疫苗之一。 展开更多

关键词 Calmette Guerin VACCINE 免疫原性 外源基因 细胞免疫应答 融合蛋白 穿梭表达载体 整合表达 免疫佐剂

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