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猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立 被引量：1
1
作者 徐建 霍珊珊 +4 位作者 张建楼 张永红 崔丹 仲飞 李秀锦 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期88-92,122,共6页
猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI... 猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。 展开更多
关键词 猪CD163 稳定表达细胞系 CHO-K1细胞 流式细胞术
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鸡APOBEC4稳定表达细胞系的建立与应用
2
作者 石梦雨 张耀丹 +7 位作者 孟春春 孙英杰 谭磊 宋翠萍 刘炜玮 廖瑛 仇旭升 丁铲 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第3期13-21,共9页
鸡APOBEC4是最新发现的载脂蛋白B mRNA编辑酶(APOBEC)家族成员,功能尚不明确。由于具有保守的胞苷脱氨酶基序,该家族蛋白能够诱导机体DNA或RNA发生广泛的胞嘧啶脱氨基突变,参与到机体免疫过程中去,在机体先天性免疫与适应性免疫中均发... 鸡APOBEC4是最新发现的载脂蛋白B mRNA编辑酶(APOBEC)家族成员,功能尚不明确。由于具有保守的胞苷脱氨酶基序,该家族蛋白能够诱导机体DNA或RNA发生广泛的胞嘧啶脱氨基突变,参与到机体免疫过程中去,在机体先天性免疫与适应性免疫中均发挥重要作用。这种RNA编辑作用亦可诱导病毒基因组突变,产生种类众多的突变株,但由于每种突变在群体中的比例极小,自然状态下会被优势准种掩盖难以检测,因此需要能够稳定表达该蛋白的细胞系作为模型进行研究。本实验室前期结果表明,鸡源APOBEC4主要在免疫细胞中表达,而传染性支气管炎病毒、流感病毒感染能够显著刺激鸡APOBEC4的大幅上调。为研究鸡APOBEC4编辑作用对病毒复制的影响,本研究利用慢病毒包装方法,将鸡源APOBEC4基因导入BHK21细胞,通过Real-time quantitative PCR和Western blot方法进行鉴定,得到能够稳定表达鸡APOBEC4的BHK21细胞系BHK21-APOBEC4,并发现鸡传染性支气管炎病毒(IBV)Beaudette株和禽流感病毒(AIV)H9N2株在该细胞系上的复制较对照组受到显著抑制,为进一步研究APOBEC4的生物学功能奠定基础。 展开更多
关键词 载脂蛋白B mRNA编辑酶 抗病毒作用 稳定表达细胞系
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稳定表达猪BRD4-BD1/2蛋白的猪肺泡巨噬细胞传代细胞系的构建及其用于ASFV增殖的效果观察
3
作者 吴梦丽 孙华林 +4 位作者 杨吉飞 赵亚茹 关贵全 殷宏 牛庆丽 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4646-4659,共14页
前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD... 前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD1/2结构域,利用慢病毒表达系统成功构建稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系,分析ASFV在3D4/21-BRD4-BD1/2细胞系与WT细胞系之间的复制差异。首先,以家猪基因BRD4-BD1/2为靶标,构建了含有3x Flag标签的重组质粒pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2,并将其与质粒pMD2.G和pSPAX2共同转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装,获得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染3D4/21细胞后通过嘌呤霉素药物筛选,成功获得了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染3D4/21-BRD4-BD1/2细胞后CP204L和B602L基因的转录水平以及相应蛋白表达水平,并通过HAD50测定评价ASFV的复制能力。研究结果表明:成功构建了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。与3D4/21-WT细胞系相比,BRD4-BD1/2稳定表达细胞系能够显著促进ASFV复制。本研究提供了深入研究BRD4蛋白在ASFV复制中功能的生物材料,并为ASFV疫苗候选株的开发提供了理论基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 BRD4 BD1/2 3D4/21细胞 稳定表达细胞系
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稳定表达鸡氨肽酶N的MDCK细胞系构建及其对传染性支气管炎病毒感染的影响
4
作者 李广兴 郭德启 +5 位作者 王雪 葛旭影 任玉东 任晓峰 黄小丹 张瑞莉 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期63-67,共5页
为研究鸡氨肽酶N(Chicken aminopeptidase N,c APN)在鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染细胞过程中作用,构建稳定表达c APN的MDCK细胞系。将重组质粒pc DNA3.1-c APN通过脂质体转染到MDCK细胞中并利用G418筛选,克隆纯化获得稳定表达c APN的... 为研究鸡氨肽酶N(Chicken aminopeptidase N,c APN)在鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染细胞过程中作用,构建稳定表达c APN的MDCK细胞系。将重组质粒pc DNA3.1-c APN通过脂质体转染到MDCK细胞中并利用G418筛选,克隆纯化获得稳定表达c APN的MDCK细胞系。通过RT-PCR和间接免疫荧光检测表明c APN在MDCK细胞中持续稳定表达。IBV可以感染稳定表达c APN的MDCK细胞并连续传代,该细胞系接种IBV阳性样品24 h即可产生典型细胞融合病变,而对照MDCK细胞接种后没有细胞病变出现。结果表明c APN在介导IBV感染宿主细胞过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 鸡传染性支气管炎病毒 鸡氨肽酶N 稳定表达细胞系 病毒感染
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稳定表达猪CYP3A29基因的PAM细胞系构建及鉴定
5
作者 郅西柱 方晓敏 +5 位作者 赵芳 周艳红 涂枫 李碧侠 王学敏 任守文 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第3期554-559,共6页
为获得稳定表达CYP3A29基因的猪肺泡巨噬细胞系,利用RT-PCR方法获取猪CYP3A29基因序列后与克隆载体PMD18-T相连,得到PMD18-T-CYP3A29重组质粒并测序验证,利用Xho I和Not I双酶切重组质粒及pcDNA3.1(+)/zeo,回收后连接,构建重组真核表达... 为获得稳定表达CYP3A29基因的猪肺泡巨噬细胞系,利用RT-PCR方法获取猪CYP3A29基因序列后与克隆载体PMD18-T相连,得到PMD18-T-CYP3A29重组质粒并测序验证,利用Xho I和Not I双酶切重组质粒及pcDNA3.1(+)/zeo,回收后连接,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/zeo-CYP3A29,双酶切及测序验证其正确性,并以脂质体2000将其转染至猪肺泡巨噬细胞系3D4/21,经Zeocin抗性筛选,借助RT-PCR及Wesrern-blot鉴定该基因的表达情况。结果表明,成功获得表达CYP3A29的细胞株,且连续培养10代后,RT-PCR及Wesrern-blot仍能检测到该基因表达。说明,稳定表达CYP3A29基因的猪肺泡巨噬细胞系构建成功,该细胞系的成功构建为进一步研究分析猪CYP3A29基因的功能提供了可能。 展开更多
关键词 猪 CYP3A29 肺泡巨噬细胞 稳定表达细胞系
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稳定表达IL-10的PK-15细胞的构建及其在PCV2增殖中的应用 被引量：2
6
作者 张敬寒 李枝兰 +6 位作者 韩佃刚 何帅 刘金华 吕念词 邹丰才 柴俊 张以芳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第3期1085-1095,共11页
【目的】研究白细胞介素-10(IL-10)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】利用PCR技术扩增猪IL-10... 【目的】研究白细胞介素-10(IL-10)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro)进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验(IFA)观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度(TCID50)。【结果】试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID50在感染后48 h极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) 白细胞介素-10(IL-10) 免疫抑制 慢病毒表达载体 稳定表达细胞系
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稳定表达草鱼LamR鱼类细胞的建立及对基因Ⅱ型GCRV增殖的影响
7
作者 黄志深 王庆 +4 位作者 吴斯宇 周文礼 王英英 尹纪元 李莹莹 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2021年第4期21-26,共6页
通过构建草鱼LamR(Ctenopharyngodon idella LamR,CiLamR)真核表达质粒,转染GCRV非敏感细胞系鲤鱼上皮细胞(EPC)和敏感细胞系草鱼肾细胞(CIK),利用G418筛选获得稳定表达CiLamR的细胞,经Western Blot验证CiLamR稳定表达细胞系的构建。采... 通过构建草鱼LamR(Ctenopharyngodon idella LamR,CiLamR)真核表达质粒,转染GCRV非敏感细胞系鲤鱼上皮细胞(EPC)和敏感细胞系草鱼肾细胞(CIK),利用G418筛选获得稳定表达CiLamR的细胞,经Western Blot验证CiLamR稳定表达细胞系的构建。采用Ⅱ型GCRV分别接毒CiLamR稳定表达EPC和CIK,检测接毒后Ⅱ型GCRV拷贝数差异,研究草鱼37 kDa/67 kDa层粘连蛋白受体(37 kDa/67 kDa laminin receptor,LamR)对Ⅱ型GCRV增殖的影响。结果显示:经PCR扩增获得927 bp CiLamR完整开放阅读框(ORF),并成功克隆进入真核表达质粒pEYFP-Mem,获得pEYFP-Mem-CiLamR重组质粒,转染并经过G418筛选后获得约80%阳性荧光的细胞。Western Blot证实稳定表达CiLamR的EPC和CIK细胞系构建成功。以不同初始浓度接种EPC-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR细胞均未检测到Ⅱ型GCRV增殖,CIK-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR可检测到病毒增殖,但是增殖量无明显差异。结果表明:CiLamR蛋白对基因Ⅱ型GCRV增殖无明显影响。 展开更多
关键词 草鱼(Ctenopharyngodon idella) 层粘连蛋白受体 稳定表达细胞系 基因Ⅱ型 GCRV
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比格犬ERβ剪切异构体ERβ419沉默表达载体的构建及筛选
8
作者 甘艺 赵彦斌 +5 位作者 陈福军 孙兆增 胡仲明 刘冰 杨焕民 曾林 《中国比较医学杂志》 CAS 2014年第11期10-14,共5页
目的构建最有效的慢病毒介导RNAi干扰序列,未来将应用于比格犬ERβ419的未知生物学功能的探索。方法模拟比格犬ERβ419靶细胞筛选针对目的基因mRNA设计的最佳干扰序列实验,通过qRT-PCR和Western Blot技术筛选最佳沉默表达载体序列。结果... 目的构建最有效的慢病毒介导RNAi干扰序列,未来将应用于比格犬ERβ419的未知生物学功能的探索。方法模拟比格犬ERβ419靶细胞筛选针对目的基因mRNA设计的最佳干扰序列实验,通过qRT-PCR和Western Blot技术筛选最佳沉默表达载体序列。结果qRT-PCR结果显示,ERβ419-shRNA1(P<0.01)和ERβ419-shRNA3(P<0.01)的差异表达极显著,Western Blot结果与qRT-PCR结果一致,ERβ419-shRNA3的干扰效果最佳。结论 ERβ419-shRNA3最有效地抑制了目的基因的表达,未来将应用于探索比格犬ERβ419未知生物学功能对比格犬生殖系统影响的研究,并进而预防和治疗比格犬繁殖机能障碍性疾病。 展开更多
关键词 比格犬ERβ419 稳定表达细胞系 基因沉默
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