慢病毒介导的稳定表达鸭干扰素-γ细胞株的构建

1

作者 陈柳 倪征 +5 位作者 刘可姝 叶伟成 华炯钢 云涛 朱寅初 张存 《浙江农业科学》 2024年第1期208-212,共5页

干扰素-γ是一种具有抗病毒活性和免疫调节能力的细胞因子之一。为了建立稳定表达鸭干扰素-γ(duIFN-γ)的细胞系,本研究优化并合成了duIFN-γ基因,插入到慢病毒表达载体plenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro,获得重组质粒plenti-IFN,将plenti-... 干扰素-γ是一种具有抗病毒活性和免疫调节能力的细胞因子之一。为了建立稳定表达鸭干扰素-γ(duIFN-γ)的细胞系,本研究优化并合成了duIFN-γ基因,插入到慢病毒表达载体plenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro,获得重组质粒plenti-IFN,将plenti-IFN与辅助质粒共转染包装细胞293T,筛选出了携带duIFN-γ基因的重组慢病毒rlenti-IFN,将该病毒感染中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞,利用有限稀释法和抗性加压筛选法,筛选出了30个具有嘌呤霉素抗性基因的单克隆细胞系。利用RT-qPCR荧光定量法对这些单克隆细胞的duIFN-γ mRNA水平进行检测,筛选出了duIFN-γ mRNA水平最高的1个单克隆细胞,对其进行扩大培养,获得了1株稳定细胞系。Western blot检测结果表明,duIFN-γ稳定表达于该细胞系中。本研究获得了1株稳定表达duIFN-γ蛋白的细胞系,该研究为开展duIFN-γ生物学功能研究、建立duIFN-γ检测方法及生产廉价鸭(禽)用干扰素奠定了基础。 展开更多

关键词 鸭干扰素-γ 慢病毒 CHO细胞 稳定表达

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稳定表达猪BRD4-BD1/2蛋白的猪肺泡巨噬细胞传代细胞系的构建及其用于ASFV增殖的效果观察

2

作者 吴梦丽 孙华林 +4 位作者 杨吉飞 赵亚茹 关贵全 殷宏 牛庆丽 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4646-4659,共14页

前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD... 前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD1/2结构域,利用慢病毒表达系统成功构建稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系,分析ASFV在3D4/21-BRD4-BD1/2细胞系与WT细胞系之间的复制差异。首先,以家猪基因BRD4-BD1/2为靶标,构建了含有3x Flag标签的重组质粒pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2,并将其与质粒pMD2.G和pSPAX2共同转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装,获得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染3D4/21细胞后通过嘌呤霉素药物筛选,成功获得了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染3D4/21-BRD4-BD1/2细胞后CP204L和B602L基因的转录水平以及相应蛋白表达水平,并通过HAD50测定评价ASFV的复制能力。研究结果表明:成功构建了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。与3D4/21-WT细胞系相比,BRD4-BD1/2稳定表达细胞系能够显著促进ASFV复制。本研究提供了深入研究BRD4蛋白在ASFV复制中功能的生物材料,并为ASFV疫苗候选株的开发提供了理论基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 BRD4 BD1/2 3D4/21细胞 稳定表达细胞系

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β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在海藻裙带菜中的稳定表达 被引量：13

3

作者 秦松 于道展 +2 位作者 姜鹏 滕长英 曾呈奎 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2003年第7期87-89,共3页

借鉴海带遗传转化模式 ,利用基因枪法将 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入裙带菜雄配子体中 ,一部分诱导形成营养增殖的丝状体 ,另一部分和雌配子体受精生成孢子体。五个月后组织化学染色结果表明 5 %的孢子体个体和 30 %的丝状体细胞表现... 借鉴海带遗传转化模式 ,利用基因枪法将 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入裙带菜雄配子体中 ,一部分诱导形成营养增殖的丝状体 ,另一部分和雌配子体受精生成孢子体。五个月后组织化学染色结果表明 5 %的孢子体个体和 30 %的丝状体细胞表现了lacZ的稳定表达 ,利用PCR和PCR Southern检测得到了预期的阳性信号。本文结果提示了利用基因枪转化方法 。 展开更多

关键词 Β-半乳糖苷酶基因 海藻裙带菜 基因枪法 稳定表达 基因工程 配子体 PCR检测 PCR-Southem检测

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GP5^(Δ84-119)稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响 被引量：3

4

作者 王晓红 宋林林 +4 位作者 李亮亮 袁传奇 姜博 周恩民 穆杨 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期315-324,共10页

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白GP5的第二胞外区在病毒复制中的作用及机制,利用PiggyBac Transposon System Vectors构建了表达删除84—119氨基酸残基的截短型GP5的重组质粒(pPBGP5Δ84-119),转染Marc-145细胞通过嘌... 为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白GP5的第二胞外区在病毒复制中的作用及机制,利用PiggyBac Transposon System Vectors构建了表达删除84—119氨基酸残基的截短型GP5的重组质粒(pPBGP5Δ84-119),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆,筛选稳定表达GP5Δ84-119的Marc-145细胞系,并利用cck-8试剂盒检测细胞的增殖情况;用PRRSV SD16株感染筛选的细胞,通过病毒基因拷贝数和病毒滴度检测GP5Δ84-119表达对PRRSV复制影响;通过Real-time PCR和ELISA检测病毒感染前后细胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ的表达情况。经RT-PCR、Western blot和IFA检测,GP5Δ84-119在Marc-145细胞中获得稳定表达,将此细胞命名为Marc-145-GP5Δ84-119;细胞增殖曲线显示GP5Δ84-119的表达不影响细胞的增殖;对病毒基因拷贝数和病毒滴度检测发现GP5Δ84-119的表达可以抑制PRRSV的复制,这种抑制作用可能是通过上调IFN特别是IFN-β的表达而实现的。研究表明GP5第二胞外区在PRRSV复制中发挥重要作用。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5^Δ84-119 稳定表达 复制 干扰素

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山羊FSH真核表达载体pVITRO-FSHαβ构建及在CHO细胞内稳定表达 被引量：2

5

作者 王建武 陈秀萍 +1 位作者 严正杰 丁家桐 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期1130-1134,共5页

在对山羊促卵泡素α、β亚基基因克隆和瞬时表达的基础上,构建促卵泡素αβ双表达载体,并转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cells,CHO),在潮霉素B的抗性筛选下,进行稳定表达,获得了稳定表达的CHO细胞株,为重组激素制剂的研... 在对山羊促卵泡素α、β亚基基因克隆和瞬时表达的基础上,构建促卵泡素αβ双表达载体,并转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cells,CHO),在潮霉素B的抗性筛选下,进行稳定表达,获得了稳定表达的CHO细胞株,为重组激素制剂的研制提供了必备条件。 展开更多

关键词 山羊促卵泡素 双表达载体 CHO 稳定表达

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逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达 被引量：2

6

作者 吴锦艳 田宏 +4 位作者 郑海学 陈妍 靳野 尚佑军 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期527-532,共6页

本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞... 本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性。用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性。结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱。免疫荧光检测发现所表达的T7RNAP蛋白具有良好的反应原性。本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具。 展开更多

关键词 T7RNA聚合酶基因 逆转录病毒载体 PK15细胞 SK6细胞 稳定表达

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人神经营养因子-3在哺乳动物细胞中瞬时表达和稳定表达的初步研究 被引量：1

7

作者 欧阳立明 周涛 +2 位作者 薛冲 刘志敏 张嗣良 《华东理工大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期258-260,共3页

将人神经营养因子 - 3全长 c DNA克隆入真核表达载体 pc DNA3,分别在 COS- 7细胞和CHO细胞中获得了瞬时表达和稳定表达。经大乳鼠脊髓背根神经节测活 ,瞬时表达和稳定表达产物均能明显促进其神经突起的生长 ,瞬时表达量约为 1 0 -7g/m L... 将人神经营养因子 - 3全长 c DNA克隆入真核表达载体 pc DNA3,分别在 COS- 7细胞和CHO细胞中获得了瞬时表达和稳定表达。经大乳鼠脊髓背根神经节测活 ,瞬时表达和稳定表达产物均能明显促进其神经突起的生长 ,瞬时表达量约为 1 0 -7g/m L,稳定表达量可达 1 0 -8g/m 展开更多

关键词 人神经营养因子-3 真核表达载体pc DNA3 背根神经节 瞬时表达 稳定表达 神经生长

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重组人凝血酶真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达 被引量：1

8

作者 刘霞 刘飞 +2 位作者 刘少英 朱希强 凌沛学 《食品与药品》 CAS 2013年第6期381-384,共4页

目的构建含重组人凝血酶基因的重组真核表达载体,并转染哺乳动物细胞CHO,建立稳定表达重组人凝血酶的细胞株。方法利用限制性内切酶EcoR I和Xba I将凝血酶基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建含人凝血酶基因的重组质粒pcDNA3.1(+)/t... 目的构建含重组人凝血酶基因的重组真核表达载体,并转染哺乳动物细胞CHO,建立稳定表达重组人凝血酶的细胞株。方法利用限制性内切酶EcoR I和Xba I将凝血酶基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建含人凝血酶基因的重组质粒pcDNA3.1(+)/thrombin,利用双酶切和测序法鉴定。采用阳离子脂质体介导方法,将构建的表达载体转染到CHO细胞中,通过G418加压筛选出阳性细胞克隆,建立稳定表达人凝血酶的细胞株,并扩大培养。采用RT-PCR和SDS-PAGE法检测其mRNA和蛋白质的表达,并对其生物活性进行鉴定。结果重组质粒pcDNA3.1(+)/thrombin经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误;经RT-PCR和SDS-PAGE法鉴定,转染的CHO细胞可表达、分泌人凝血酶,得到的重组人凝血酶表观相对分子质量(Mr)为43 000左右,与预测一致,且具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活为234.1 U/mg。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/thrombin,并成功地在CHO细胞中表达了具有生物活性的重组人凝血酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人凝血酶奠定了基础。 展开更多

关键词 CHO细胞 真核表达载体 重组人凝血酶 稳定表达 转染

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干扰和稳定表达GP5对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染早期复制的影响 被引量：1

9

作者 宋林林 贾存瑜 +2 位作者 韩熙梦 周恩民 穆杨 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期1231-1240,共10页

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要结构蛋白GP5对病毒复制的影响及其机制,利用PiggyBac Transposon载体系统构建表达GP5的重组质粒(pPB-GP5),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉... 为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要结构蛋白GP5对病毒复制的影响及其机制,利用PiggyBac Transposon载体系统构建表达GP5的重组质粒(pPB-GP5),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆,获得稳定表达GP5的Marc-145细胞,在确定GP5表达不影响细胞增殖的基础上,用PRRSV感染筛选的细胞,通过N基因拷贝数、N蛋白表达水平和病毒滴度检测确定GP5表达对病毒复制的影响,并采用ELISA方法检测培养上清中IFN-α、IFN-β、IFN-γ的水平;进一步针对PRRSV ORF5编码区设计合成3对特异性siRNA,转染Marc-145细胞6和12h后以0.1 MOI病毒感染细胞,感染后24h收集细胞,采用荧光定量PCR(qPCR)检测GP5mRNA的表达,采用Western blot检测PRRSV N蛋白的表达。结果显示:经RT-PCR、Western blot和IFA检测,确定GP5在Marc-145细胞中获得稳定表达,且不影响细胞增殖,但可以在感染早期促进PRRSV在细胞中的复制,这种促进作用可能是通过下调IFN的表达发挥的;与阴性对照siRNA相比,3对特异性siRNA均能抑制PRRSV复制,其中100nmol·L^(-1)的siRNA GP5-471的抑制效果最好。研究表明GP5在PRRSV复制中发挥着重要作用。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5 小干扰RNA 稳定表达 干扰素

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绵羊NYD-SP27基因在BHK-21细胞中的稳定表达及其特征鉴定

10

作者 马亚茹 胡广东 +4 位作者 王红红 加米拉 徐锦凤 陈创夫 赛务加甫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期637-644,共8页

旨在构建稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞株,对NYD-SP27基因的表达特征进行分析,为进一步研究NYD-SP27基因功能奠定基础。本研究克隆绵羊NYD-SP27基因,并将其插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,利用猪捷申病毒2A肽(P2A)将NYD-SP27... 旨在构建稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞株,对NYD-SP27基因的表达特征进行分析,为进一步研究NYD-SP27基因功能奠定基础。本研究克隆绵羊NYD-SP27基因,并将其插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,利用猪捷申病毒2A肽(P2A)将NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白连接以实现共表达,将重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转染至BHK-21细胞中,经G418筛选获得稳定转基因细胞株,利用RT-PCR、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot对NYD-SP27基因的表达进行鉴定。结果表明,NYD-SP27基因稳定整合至宿主细胞基因组;NYD-SP27蛋白能够在BHK-21细胞中正常表达,分子大小约为63ku;在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中,P2A成功自我剪切。本研究成功构建了绵羊NYD-SP27基因的真核表达载体,建立了稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞系。 展开更多

关键词 绵羊NYD-SP27基因 稳定表达 BHK-21细胞 P2A

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可诱导稳定表达大电导钙激活钾通道的细胞系构建及蛋白质纯化

11

作者 毛亮 程俊 +4 位作者 黄文俊 谭晓秋 党喜同 曾晓荣 杨艳 《四川生理科学杂志》 2017年第2期55-58,共4页

目的:旨在构建稳定表达人大电导钙激活钾通道(BK_(Ca))的稳定细胞系并对重组蛋白分离纯化。方法:利用基因工程技术将人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)编码基因克隆到表达载体pcDNA5/FRT/TO/FLAG,并转染Flp-InTMT-RExTM-293宿主细胞,用潮霉素B... 目的:旨在构建稳定表达人大电导钙激活钾通道(BK_(Ca))的稳定细胞系并对重组蛋白分离纯化。方法:利用基因工程技术将人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)编码基因克隆到表达载体pcDNA5/FRT/TO/FLAG,并转染Flp-InTMT-RExTM-293宿主细胞,用潮霉素B筛选建立稳定表达的单克隆细胞系。BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后,用anti-FLAG抗体对表达的BK_(Ca)蛋白质进行纯化。用western blot检测BK_(Ca)通道蛋白质的表达,用单通道膜片钳检测通道的电生理特性。结果:BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后表达了高水平的BK_(Ca)-FLAG融合蛋白,BK_(Ca)通道电导值为213.39±9.52pS(n=15,cell-attached)和225.72±10.61pS(n=13,inside-out),BK_(Ca)通道具有典型的大电导特性、电压依赖性、Ca2+依赖性及IbTX敏感性,与在体的人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)通道具有相同的特征。纯化后的BK_(Ca)蛋白质条带单一,纯度约为89%。结论:成功构建BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系并获得纯化的BK_(Ca)蛋白质,为进一步深入研究通道功能及药物筛选奠定了重要的基础。 展开更多

关键词 稳定表达细胞系 BKCa重组蛋白质 膜片钳

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稳定表达甜味受体蛋白T1R2/T1R3的HEK293细胞系的建立 被引量：2

12

作者 钱玲玲 秦玉梅 邓少平 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期142-147,共6页

以小鼠舌组织为对象,提取总mRNA,并以此为模板,使用自行设计的引物通过RT-PCR扩增Gα15、T1R2和T1R3目的片段。构建重组质粒pEGFP-C1-Gα15、pDsRed1-N1-T1R2、pcDNATM6.2/N-YFP-DEST-T1R3。以脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经抗性筛... 以小鼠舌组织为对象,提取总mRNA,并以此为模板,使用自行设计的引物通过RT-PCR扩增Gα15、T1R2和T1R3目的片段。构建重组质粒pEGFP-C1-Gα15、pDsRed1-N1-T1R2、pcDNATM6.2/N-YFP-DEST-T1R3。以脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经抗性筛选后,通过极限稀释法获得稳定表达T1R2/T1R3的HEK293细胞系,最后通过RT-PCR,荧光显微镜及Western blot方法在基因及蛋白质水平上对建立的稳定表达细胞系进行鉴定。基因及蛋白质水平上的结果均表明,目的基因Gα15、T1R2/T1R3成功导入HEK293细胞中,并且稳定表达。该细胞系的建立为细胞水平上甜味机理的体外研究(如甜味识别热动力学等)提供了稳定的细胞来源。 展开更多

关键词 味觉 甜味受体蛋白T1R2 T1R3 HEK293 稳定表达

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乙酰肝素酶稳定表达细胞株的建立 被引量：1

13

作者 瞿小婷 赵华军 +2 位作者 张中华 侯永泰 奚涛 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期72-76,共5页

目的:在真核细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株。方法:构建包含人乙酰肝素酶全长编码序列的真核表达载体pcDNA-hpaFL,转染CHO-K1细胞,G418筛选稳定表达细胞株。通过RT-PCR,Western-blot分析与鉴定蛋白的表达;用荧... 目的:在真核细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株。方法:构建包含人乙酰肝素酶全长编码序列的真核表达载体pcDNA-hpaFL,转染CHO-K1细胞,G418筛选稳定表达细胞株。通过RT-PCR,Western-blot分析与鉴定蛋白的表达;用荧光HPLC法检测蛋白的活性。结果:在CHO-K1细胞中成功地表达出有活性的人乙酰肝素酶,并获得该酶的稳定表达细胞株。结论:成功地建立了人乙酰肝素酶稳定表达细胞株,为其抑制剂的筛选及其功能的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 乙酰肝素酶 肿瘤转移 稳定表达

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稳定表达T7 RNA聚合酶BHK-21细胞株的构建 被引量：2

14

作者 陈宇婧 张艺艺 +5 位作者 黄正阳 石建州 刘阳坤 邱礽 姚伦广 李娜 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第4期1253-1261,共9页

【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号:NZ_CP081489.1)设计引物,并采用PC... 【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号:NZ_CP081489.1)设计引物,并采用PCR扩增T7 RNAP基因片段,将其克隆至慢病毒载体中,构建pCDH-CMV-T7 RNAP重组质粒。筛选阳性克隆及测序鉴定后,利用脂质体将包含重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP的包装系统和辅助包装质粒共转染至HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装及纯化,获得高病毒滴度的重组慢病毒。将收集的病毒液分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1、5、10和20感染BHK-21细胞,72 h后观察荧光情况,筛选最佳MOI。将重组慢病毒在最佳MOI条件下感染BHK-21细胞,通过绿色荧光蛋白copGFP的表达观察感染细胞的阳性率。使用4μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选物进行多轮筛选,最终筛选得到BHK-21-T7 RNAP细胞株。进一步对所筛选的细胞株设计3对检测引物进行RT-PCR检测,并通过检测试验组与空白对照组细胞中海肾荧光素酶(hRluc)报告基因的活性差异来反映T7 RNAP驱动T7启动子下游基因的能力。【结果】本研究成功扩增了大肠杆菌BL21(DE3)细胞基因组中T7 RNAP基因,成功构建重组慢病毒载体,并获得了滴度为1.0×10^(8)TU/mL的重组慢病毒。成功筛选到BHK-21-T7 RNAP细胞株,此重组细胞株经RT-PCR扩增能够检测到T7 RNAP的特异性DNA序列。将含有T7启动子驱动的hRluc的质粒(pT7-hRluc)转染此细胞株后发现,BHK-21-T7 RNAP细胞株中hRluc的活力与空白对照组BHK-21细胞相比极显著升高(P<0.01)。【结论】本研究获得了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株,且所筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株中的T7 RNAP能够驱动pT7启动子下游基因hRluc的转录,研究结果为RNA病毒的反向遗传学平台建立奠定了细胞基础。 展开更多

关键词 T7 RNA聚合酶 慢病毒载体 细胞株 稳定表达

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外源蛋白在CHO细胞染色体上一个新位点的定点整合和稳定表达 被引量：2

15

作者 胡湾湾 丁学峰 +4 位作者 蔡燕飞 陈蕴 段作营 金坚 李华钟 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期487-495,共9页

寻找中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体上稳定表达位点是解决CHO细胞长期培养表达不稳定问题的有效手段。本课题组前期利用慢病毒转染将示踪基因(Zsgreen1)整合CHO细胞染色体上并发现多个潜在稳定表达位点。本研究验证了其中一个位点稳定表... 寻找中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体上稳定表达位点是解决CHO细胞长期培养表达不稳定问题的有效手段。本课题组前期利用慢病毒转染将示踪基因(Zsgreen1)整合CHO细胞染色体上并发现多个潜在稳定表达位点。本研究验证了其中一个位点稳定表达外源蛋白的能力,该位点位于染色体NW_003614241.1上148052~148157 bp区域。首先观察Zsgreen1基因的表达情况,随后采用CRISPR/Cas9技术将增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点整合至该位点,获得3株EGFP基因定点整合的细胞,经60代悬浮培养,细胞荧光强度无明显变化,证明此位点可稳定表达EGFP基因。采用同样方法构建了表达人血清白蛋白(HSA)基因的重组CHO细胞株,经Western blot验证,此位点可分泌表达HSA,表明上述位点可定点整合和稳定表达外源蛋白。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 定点整合 稳定表达 新位点 中国仓鼠卵巢细胞

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稳定表达IL-10的PK-15细胞的构建及其在PCV2增殖中的应用 被引量：1

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作者 张敬寒 李枝兰 +6 位作者 韩佃刚 何帅 刘金华 吕念词 邹丰才 柴俊 张以芳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第3期1085-1095,共11页

【目的】研究白细胞介素-10(IL-10)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】利用PCR技术扩增猪IL-10... 【目的】研究白细胞介素-10(IL-10)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro)进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验(IFA)观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度(TCID50)。【结果】试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID50在感染后48 h极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) 白细胞介素-10(IL-10) 免疫抑制 慢病毒表达载体 稳定表达细胞系

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稳定表达草鱼LamR鱼类细胞的建立及对基因Ⅱ型GCRV增殖的影响

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作者 黄志深 王庆 +4 位作者 吴斯宇 周文礼 王英英 尹纪元 李莹莹 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2021年第4期21-26,共6页

通过构建草鱼LamR(Ctenopharyngodon idella LamR,CiLamR)真核表达质粒,转染GCRV非敏感细胞系鲤鱼上皮细胞(EPC)和敏感细胞系草鱼肾细胞(CIK),利用G418筛选获得稳定表达CiLamR的细胞,经Western Blot验证CiLamR稳定表达细胞系的构建。采... 通过构建草鱼LamR(Ctenopharyngodon idella LamR,CiLamR)真核表达质粒,转染GCRV非敏感细胞系鲤鱼上皮细胞(EPC)和敏感细胞系草鱼肾细胞(CIK),利用G418筛选获得稳定表达CiLamR的细胞,经Western Blot验证CiLamR稳定表达细胞系的构建。采用Ⅱ型GCRV分别接毒CiLamR稳定表达EPC和CIK,检测接毒后Ⅱ型GCRV拷贝数差异,研究草鱼37 kDa/67 kDa层粘连蛋白受体(37 kDa/67 kDa laminin receptor,LamR)对Ⅱ型GCRV增殖的影响。结果显示:经PCR扩增获得927 bp CiLamR完整开放阅读框(ORF),并成功克隆进入真核表达质粒pEYFP-Mem,获得pEYFP-Mem-CiLamR重组质粒,转染并经过G418筛选后获得约80%阳性荧光的细胞。Western Blot证实稳定表达CiLamR的EPC和CIK细胞系构建成功。以不同初始浓度接种EPC-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR细胞均未检测到Ⅱ型GCRV增殖,CIK-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR可检测到病毒增殖,但是增殖量无明显差异。结果表明:CiLamR蛋白对基因Ⅱ型GCRV增殖无明显影响。 展开更多

关键词 草鱼(Ctenopharyngodon idella) 层粘连蛋白受体 稳定表达细胞系 基因Ⅱ型 GCRV

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稳定表达鸡ST3GALⅠ基因BHK-21细胞株的建立

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作者 陈欢 李明义 高轩 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第3期10-15,共6页

筛选稳定表达鸡ST3GalⅠ基因的BHK-21细胞株,为进一步研究禽流感病毒大规模细胞培养生产疫苗奠定基础。克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒pcDNA3.1-EGFP中构建重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GaⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染BHK-21... 筛选稳定表达鸡ST3GalⅠ基因的BHK-21细胞株,为进一步研究禽流感病毒大规模细胞培养生产疫苗奠定基础。克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒pcDNA3.1-EGFP中构建重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GaⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染BHK-21细胞后,ST3GalⅠ基因在细胞中稳定表达,经G418抗性和RT-PCR筛选鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将H9亚型禽流感病毒和H5N1Re-5禽流感病毒按不同比例接种BHK-21-ST3GalⅠ细胞和空白BHK-21细胞,同时设普通胰酶和TPCK-胰酶对照组以检测BHK-21-ST3GalⅠ细胞对H9亚型禽流感病毒和H5N1Re-5禽流感病毒的增殖效果。接毒72h后收获细胞液,常规方法测定血凝素(HA)滴度。通过在BHK-21细胞中稳定表达ST3GalⅠ基因,提高BHK-21细胞表面SAα-2,3Gal受体丰度连续传6代后仍然能检测到其表达,荧光显微镜下能看到绿色荧光,RT-PCR可检出1 029bp的目的条带。结果显示,BHK-21-ST3GalⅠ细胞在接毒量为2%时HA滴度达到1∶256,显著高于空白BHK-21细胞组,表明其更适于流感病毒的增殖,具备生产流感病毒疫苗的潜力。 展开更多

关键词 鸡 ST3GALⅠ基因 重组质粒 稳定表达 BHK-21细胞

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慢病毒介导稳定表达Cas9蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证 被引量：3

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作者 李晓娇 朱新宇 +3 位作者 邹娴 严霞 何燕华 罗成龙 《广东农业科学》 CAS 2023年第2期125-135,共11页

【目的】筛选稳定表达Cas9蛋白的鸡成纤维细胞系(DF-1),并基于单链退火修复机制(Single Strand Annealing, SSA)的报告载体系统,检测DF-1细胞系中的Cas9核酸酶活性。【方法】将携带Cas9蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染293T细胞... 【目的】筛选稳定表达Cas9蛋白的鸡成纤维细胞系(DF-1),并基于单链退火修复机制(Single Strand Annealing, SSA)的报告载体系统,检测DF-1细胞系中的Cas9核酸酶活性。【方法】将携带Cas9蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染293T细胞包装慢病毒,收集慢病毒Cas9上清液感染DF-1细胞,经抗生素筛选得到稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞,分别用PCR和Western blot验证阳性DF-1细胞表达Cas9蛋白的情况;选择鸡卵清白蛋白(OVA)基因的sgRNA序列,将sgRNA退火产物克隆至pYP152构建sgRNA表达载体,并在sgRNA靶位点两端设计引物扩增OVA基因靶片段,将靶片段克隆至报告载体pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ,以破坏mCherry蛋白的表达,之后再将sgRNA表达载体与SSA报告载体共同转染稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞,最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对mCherry蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到27株稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系,采用PCR扩增稳转细胞基因组,结果显示这些细胞具有Cas9蛋白基因序列,Western blots试验结果显示上述稳转细胞株均表达Cas9蛋白;sgRNA表达载体与mCherry-SSA报告载体共转后,通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中mCherry蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系,可为后续在稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。 展开更多

关键词 稳定表达 慢病毒 CRISPR/Cas9 SSA修复 载体构建 DF-1

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芍药切花内参基因筛选及乙烯生物合成关键基因表达分析

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作者 戴睿 段帅帅 +5 位作者 肖士奎 卫志鹏 吕淑芳 史国安 吴疆 范丙友 《北京林业大学学报》 北大核心 2025年第1期106-115,共10页

【目的】筛选芍药切花开放至衰老过程中和盛开期不同组织中稳定表达的最适内参基因,深入解析ACS和ACO基因在乙烯介导的芍药切花开放至衰老过程中的功能。【方法】(1)以芍药‘桃花飞雪’为材料,基于qRT-PCR技术分析13个候选内参基因在芍... 【目的】筛选芍药切花开放至衰老过程中和盛开期不同组织中稳定表达的最适内参基因,深入解析ACS和ACO基因在乙烯介导的芍药切花开放至衰老过程中的功能。【方法】(1)以芍药‘桃花飞雪’为材料,基于qRT-PCR技术分析13个候选内参基因在芍药切花开放至衰老不同时期及盛开期不同组织中表达水平的变化,应用geNorm、NormFinder、BestKeeper等软件和ΔCt法对其表达稳定性进行了评价;通过在线RefFinder网站分析获得候选内参基因表达稳定性的综合排名。(2)利用筛选出的双内参基因,对乙烯生物合成关键基因ACS和ACO在芍药切花开放至衰老不同时期及盛开期不同组织中的表达水平进行定量分析。【结果】(1)在芍药切花开放至衰老的不同时期,geNorm分析表明GAPDH和RAN3表达稳定性最好;NormFinder分析显示RAN3表达最稳定;BestKeeper分析表明18S rRNA表达稳定性最好;RefFinder综合分析表明RAN3和GAPDH为最适内参基因。(2)在盛开期芍药切花花器官不同组织中,geNorm分析表明ARF和PP2A表达稳定性最好;NormFinder分析显示UBQ表达最稳定;BestKeeper分析表明GAPDH表达稳定性最好;RefFinder综合分析表明UBQ和ARF为最适内参基因。(3)在芍药切花开放至衰老过程中,ACS基因表达量显著低于ACO基因表达量,是调控乙烯合成的开关;ACO主要在切花开放前期(瓶插0~12 h)发挥作用;ACS表达量在绽口期和衰败期(瓶插6 h和144 h)均发挥重要作用,并在盛开期对乙烯合成起到限制作用;(4)在芍药切花盛开期不同组织中,ACS基因表达量显著低于ACO,ACS和ACO基因的表达存在组织差异性,且均在茎和花萼中表达较高。【结论】本研究筛选出芍药切花开放至衰老不同时期(RAN3和GAPDH)以及盛开期不同组织中(UBQ和ARF)qPCR定量表达分析的双内参基因组合;乙烯生物合成关键基因ACO主要在芍药切花开放过程发挥作用,ACS基因在芍药切花开放和衰老过程均发挥重要的作用。研究结果将为切花寿命的改良提供参考。 展开更多

关键词 芍药 内参基因 表达稳定性 开花 衰老 乙烯生物合成

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