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禽β-防御素6和9基因的克隆、表达及活性分析 被引量：2
1
作者 李怡彤 耿姝 +5 位作者 殷冬冬 邵颖 薛媚 涂健 宋祥军 祁克宗 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2020年第6期996-1003,共8页
【目的】探究重组禽β-防御素6(AvBD6)、禽β-防御素9(AvBD9)蛋白的原核表达及其生物学特性。【方法】将AvBD6和AvBD9成熟肽基因克隆到表达载体pGEX-6P-1上,进而将重组表达质粒转化到BL21(DE3)pLysS感受态中,用IPTG进行诱导表达后对其... 【目的】探究重组禽β-防御素6(AvBD6)、禽β-防御素9(AvBD9)蛋白的原核表达及其生物学特性。【方法】将AvBD6和AvBD9成熟肽基因克隆到表达载体pGEX-6P-1上,进而将重组表达质粒转化到BL21(DE3)pLysS感受态中,用IPTG进行诱导表达后对其进行纯化,SDS-PAGE电泳分析重组蛋白AvBD6和AvBD9的表达情况,继而检测其体外抗菌活性并用透射电镜观察细菌形态变化,检测重组蛋白对鸡红细胞的溶血活性。【结果】重组AvBD6和AvBD9蛋白诱导表达的分子量约为30 ku,且主要在上清中表达。2种重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抗菌活性。电镜观察显示:菌体内容物外泄,损伤严重,并且重组蛋白对鸡红细胞无溶血活性。【结论】本研究制备的AvBD6和AvBD9重组蛋白具有良好的生物安全性和抑菌效果,为进一步研究其抗菌机制及临床初步应用奠定了基础。 展开更多
关键词 禽β-防御素6 禽β-防御素9 原核表达 重组蛋白 抗菌活性
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雏鸡感染鸡白痢沙门菌后禽β-防御素6和鸡Toll样受体15在肠道转录与定位研究 被引量：4
2
作者 王燕 周秀红 +3 位作者 祁克宗 涂健 刘红梅 潘孝成 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1711-1717,共7页
旨在分析雏鸡感染鸡白痢沙门菌后,禽β-防御素6(AvBD6)和鸡Toll样受体15(ChTLR15)在小肠内的分布及表达规律。本研究用鸡白痢沙门菌感染14日龄的雏鸡,感染后不同时间点采取雏鸡的小肠组织(十二指肠、空肠和回肠),利用实时荧光定量RT-PC... 旨在分析雏鸡感染鸡白痢沙门菌后,禽β-防御素6(AvBD6)和鸡Toll样受体15(ChTLR15)在小肠内的分布及表达规律。本研究用鸡白痢沙门菌感染14日龄的雏鸡,感染后不同时间点采取雏鸡的小肠组织(十二指肠、空肠和回肠),利用实时荧光定量RT-PCR和原位杂交方法,检测AvBD6和ChTLR15在小肠组织内的定位和mRNA的转录水平变化。结果显示,雏鸡感染鸡白痢沙门菌后,AvBD6和ChTLR15在各肠段组织中均有转录,其中在十二指肠相对转录量最高,在0~24h内呈上升趋势,24~48h相对转录量呈下降趋势,在24h的转录量极显著高于0和6h(P<0.01),且AvBD6在24h的转录量显著高于12h(P<0.05)。AvBD6和ChTLR15mRNA在小肠内均有不同程度的分布,其主要分布在肠绒毛的中央乳糜管中,在十二指肠中荧光信号最强。结果表明,雏鸡感染鸡白痢沙门菌后,AvBD6和ChTLR15mRNA在鸡小肠中的分布和表达具有一定的规律性,并参与肠道免疫调节功能。 展开更多
关键词 鸡白痢沙门菌 荧光定量RT-PCR 原位杂交 禽β-防御素6 鸡Toll样受体15
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表达禽β-防御素6重组乳酸菌的构建及其免疫调节活性检测 被引量：2
3
作者 王婷婷 王志浩 +10 位作者 米洁兰 王文骞 高玉龙 刘长军 祁小乐 张艳萍 李凯 高立 潘青 王笑梅 崔红玉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期931-937,共7页
为构建表达禽β-防御素6(AvBD6)的重组乳酸菌并检测重组蛋白AvBD6(rAvBD6)的免疫调节活性,本研究根据GenBank AvBD6的参考序列,经过密码子优化后合成了AvBD6:AvBD6(G4S)3 AvBD6(G4S)3 AvBD6(G4S)3 AvBD6(4×AvBD6)串联基因序列,构... 为构建表达禽β-防御素6(AvBD6)的重组乳酸菌并检测重组蛋白AvBD6(rAvBD6)的免疫调节活性,本研究根据GenBank AvBD6的参考序列,经过密码子优化后合成了AvBD6:AvBD6(G4S)3 AvBD6(G4S)3 AvBD6(G4S)3 AvBD6(4×AvBD6)串联基因序列,构建了表达rAvBD6的食品级乳酸菌表达菌株。经western blot检测显示,目的蛋白呈可溶性表达于乳酸菌细胞质中。以重组乳酸菌裂解上清为重组蛋白,与鸡外周血单个核细胞进行体外相互作用试验,荧光定量PCR结果显示,经rAvBD6刺激鸡外周血单个核细胞能够显著提高IL-10(p<0.0001)、IL-12p70(p<0.05)转录水平;重组蛋白与鸡巨噬细胞体外相互作用试验的荧光定量PCR结果显示,经rAvBD6处理的鸡巨噬细胞也能够提高IL-10、IL-12p70的转录水平(p<0.05);重组蛋白刺激干扰素调节因子IRF信号激活报告细胞系774-DualTM,结果显示rAvBD6显著激活了该巨噬细胞的IRF信号通路(p<0.05);SPF鸡注射重组蛋白两周后,采用ELISA检测鸡血清IFN-γ、IL-2和IL-10表达水平,结果显示其IFN-γ、IL-10和IL-2的含量显著高于空菌对照组(p<0.05)。上述结果表明:rAvBD6在体内外显示了较强的免疫激活和免疫调节特性,具有作为免疫佐剂或免疫增强剂的潜力。本研究为新型食品安全级动物免疫佐剂或免疫增强剂的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 禽β-防御素6 重组乳酸菌 免疫调节活性 免疫佐剂 免疫增强剂
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传染性支气管炎病毒对鸡免疫反应及重组禽β-防御素11和12抗病毒作用的研究 被引量：2
4
作者 谢晶晶 任梦婷 +3 位作者 范佳慧 焦亚茹 韩宗玺 马得莹 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期246-259,共14页
【目的】探究呼吸型传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)对蛋鸡免疫反应的影响及重组禽β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)的抗病毒作用。【方法】试验将70只7日龄SPF白来航鸡随机分为2组,每组35只。攻毒组通过滴鼻... 【目的】探究呼吸型传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)对蛋鸡免疫反应的影响及重组禽β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)的抗病毒作用。【方法】试验将70只7日龄SPF白来航鸡随机分为2组,每组35只。攻毒组通过滴鼻点眼途径接种呼吸型IBV强毒(CK/CH/LSD/05I),对照组以相同途径接种等剂量灭菌PBS。定时观察临床症状14 d并记录,在攻毒后12 h、36 h、3 d、7 d和14 d 2组各随机选取5只鸡心脏采血处死,检测血清抗体水平并收集部分气管和肾脏进行组织病理学检测。采集法氏囊、脾脏、肾脏和气管,提取RNA,运用实时荧光定量PCR方法检测组织中IBV的病毒载量、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及信号转导分子、AvBDs基因表达量变化。将重组AvBD11和AvBD12转染鸡胚肾细胞(chicken embryo kidney,CEK)并在病毒感染细胞后6、12、24、36和48 h收取细胞上清和细胞用于提取RNA,通过实时荧光定量PCR方法检测病毒载量。【结果】感染呼吸型IBV强毒后,鸡出现轻微呼吸道症状,剖检无明显病理变化。在感染14 d后,鸡血清抗体水平转阳且阳性率为100%。实时荧光定量PCR结果显示,对照组均未检测到病毒,攻毒组仅在感染14 d后的气管中检测到病毒且病毒载量低。与对照组相比,攻毒组脾脏中TLR1、TLR5、AvBD9和AvBD12基因表达量在感染后7 d均显著升高(P<0.05),攻毒组法氏囊中TLR1、TLR2、TLR3、AvBD5和AvBD9基因表达量及气管中核转录因子-κB p65(NF-κB p65)、NF-κB c-Rel、AvBD5、AvBD9、AvBD11和AvBD13基因表达量在感染14 d后均显著升高(P<0.05)。体外抗病毒结果显示,与转染空载体组相比,转染AvBD11的CEK细胞在感染24和48 h后病毒载量显著下调(P<0.05),细胞上清的病毒载量在感染48 h后显著下调(P<0.05);转染AvBD12的CEK细胞在感染12和24 h后病毒载量显著下调(P<0.05),细胞上清的病毒载量在感染12和48 h后显著下调(P<0.05),说明重组AvBD11和AvBD12在CEK细胞中具有抗IBV活性。【结论】呼吸型IBV强毒感染机体后增强了相关受体的基因表达和信号转导,上调了AvBDs基因表达,加强了机体免疫反应。重组AvBD11和AvBD12具有抗病毒作用,为无抗饲料的配制及研究提供了新思路。 展开更多
关键词 传染性支气管炎病毒(IBV) 鸡 TOLL样受体 禽β-防御素 抗病毒作用
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慢病毒介导稳定表达禽β-防御素9的DF-1细胞系的建立及初步应用 被引量：2
5
作者 熊修琦 耿姝 +6 位作者 李芳果 殷冬冬 薛媚 邵颖 涂健 宋祥军 祁克宗 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期530-536,共7页
【目的】为建立能够稳定表达禽β-防御素9(AvBD9)的DF-1细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性。【方法】将AvBD9基因克隆至慢病毒载体pLOV-eGFP中,将重组质粒与psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞,包装成含AvBD9基因的重组慢病毒... 【目的】为建立能够稳定表达禽β-防御素9(AvBD9)的DF-1细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性。【方法】将AvBD9基因克隆至慢病毒载体pLOV-eGFP中,将重组质粒与psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞,包装成含AvBD9基因的重组慢病毒,并将其感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素筛选和纯化,获得稳定表达AvBD9蛋白的DF-1细胞系。利用RT-PCR和Western blot验证AvBD9基因在DF-1中的转录和表达;将细胞培养上清液与耐药大肠杆菌混合培养,检测其抗菌效果,并用扫描电镜观察其对菌体的损伤情况。【结果】筛选出了稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,且AvBD9在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清使耐药大肠杆菌的存活率低于55%,电镜观察显示菌体皱缩,损伤严重。【结论】成功建立能够稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,为抗生素替代品的生产制备提供了借鉴思路,为进一步开展AvBD9的抗菌研究提供依据。 展开更多
关键词 禽β-防御素9 DF-1细胞 稳定表达 抗菌活性
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人工感染鸭源新城疫病毒对绍鸭β-防御素和细胞因子基因表达的影响 被引量：5
6
作者 许丽文 王秋玲 +2 位作者 王芳芳 刘诚刚 马得莹 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第2期536-547,共12页
试验旨在探讨人工感染鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对绍鸭β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)和细胞因子基因表达的影响。选用45只20日龄SPF绍鸭,随机分为攻毒组(27只)和对照组(18只),攻毒组采用滴鼻点眼的途径(108.38... 试验旨在探讨人工感染鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对绍鸭β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)和细胞因子基因表达的影响。选用45只20日龄SPF绍鸭,随机分为攻毒组(27只)和对照组(18只),攻毒组采用滴鼻点眼的途径(108.38 EID50)接种鸭源NDV强毒株(Md/CH/LGD/1/2005),对照组接种磷酸盐缓冲液。在攻毒后24和48h,从对照组及攻毒组各随机取6只鸭屠宰,分别采集肾脏、肺脏、气管、腺胃、骨髓、脾脏、盲肠扁桃体、哈德氏腺、法氏囊9个组织,运用实时荧光定量PCR法检测组织样品中9种AvBDs和细胞因子的表达量;剩余鸭每天持续观察,每隔4d采血1次,直至24d,检测血清抗体水平;于攻毒后24、48、72和120h采集咽喉及泄殖腔拭子,以确定排毒周期。结果表明,感染该NDV毒株后,鸭没有临床发病症状和死亡情况发生;感染后鸭排毒开始于攻毒后第1天,到第5天停止,在攻毒组咽喉及泄殖腔拭子中均检测到NDV。抗体水平检测结果显示,该NDV能够诱导鸭体内产生抗NDV特异抗体。实时荧光定量PCR结果发现,与对照组相比,感染后24h,部分鸭组织中AvBD1、AvBD2、AvBD5、AvBD6、AvBD9和AvBD16表达量均显著升高(P<0.05);感染后48h,AvBD1和AvBD6在部分鸭组织中表达量均显著上调(P<0.05);感染后48h法氏囊中白细胞介素6(IL-6)和脾脏中干扰素γ(IFN-γ)的表达量明显低于感染后24h的表达量。综上所述,该鸭源NDV毒株感染可诱导绍鸭体内在早期产生天然免疫反应,这些反应可能与病毒在机体内复制有关。 展开更多
关键词 绍鸭 新城疫病毒(NDV) 禽β-防御素(AvBDs) 细胞因子
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禽防御素在雏鸡抗鸡白痢沙门菌感染中的表达及其分子设计 被引量：2
7
作者 涂健 王斌 +4 位作者 祁克宗 温俊柳 周秀红 汪雪雁 刘红梅 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2014年第12期9-12,I0001,共5页
为了探寻有效防治雏鸡感染鸡白痢沙门菌的新型防御素生物制剂,建立雏鸡感染鸡白痢沙门菌（S.Pullorum）的模型,感染3～24 h后检测十二指肠组织禽防御素（AvBDs）抗感染的防御性表达水平,分析AvBDs的理论等电点,选择活性强且结构稳定的Av... 为了探寻有效防治雏鸡感染鸡白痢沙门菌的新型防御素生物制剂,建立雏鸡感染鸡白痢沙门菌（S.Pullorum）的模型,感染3～24 h后检测十二指肠组织禽防御素（AvBDs）抗感染的防御性表达水平,分析AvBDs的理论等电点,选择活性强且结构稳定的AvBD,对其进行分子设计,以期构建出理论生物活性更强且结构更稳定的改型防御素.结果表明,与对照组相比,雏鸡感染鸡白痢沙门菌3～24 h后十二指肠AvBD-6的表达水平明显上升,差异显著（P＜0.05）,结合理论等电点分析,选择AvBD-6做设计出发肽,用天冬氨酸替换AvBD-6原有的中性氨基酸,并在C端增加抗菌肽BF2衍生物的α螺旋,成功构建了改型防御素AvBD6-BF2,其理论生物活性与结构稳定性均强于AvBD6出发肽.本研究将为AvBDs生物制剂用于防治鸡白痢沙门菌病的可行性提供参考. 展开更多
关键词 禽β-防御素 改型防御素 雏鸡 表达分析 分子设计
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