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磁共振报告基因FTH1慢病毒载体构建及其在人神经母细胞瘤细胞中的表达 被引量：3
1
作者 贺小娅 蔡金华 +1 位作者 秦勇 高雅丽 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第23期2338-2342,共5页
目的构建携带人铁蛋白重链多肽1(fevritin heavy chaik 1,FTH1)基因的慢病毒载体,并检测其在人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)中的表达。方法以慢病毒为载体,将FTH1基因转入SK-N-SH细胞中。实验组(SK-N-SHFTH1)、空载组(SK-N-SH-GFP)和空白... 目的构建携带人铁蛋白重链多肽1(fevritin heavy chaik 1,FTH1)基因的慢病毒载体,并检测其在人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)中的表达。方法以慢病毒为载体,将FTH1基因转入SK-N-SH细胞中。实验组(SK-N-SHFTH1)、空载组(SK-N-SH-GFP)和空白组(SK-N-SH),均用含500μmol/L枸橼酸铁铵(FAC)的培养基培养并连续4次传代。CCK-8试剂检测细胞增殖活性;普鲁士蓝染色及透射电镜检测细胞聚铁效能;MR成像(MRI)观察T2WI信号变化;Western blot检测FTH1表达情况。结果 CCK-8试剂检测发现3组细胞未添加FAC培养时,其增殖能力无显著差异[实验组(0.99±0.03),空载组(0.99±0.02),空白组(0.98±0.05);P>0.05];然而,添加500μmol/L FAC后,其增殖能力[实验组(0.73±0.08),空载组(0.76±0.02),空白组(0.73±0.39)]均较前明显减低(P<0.05)。普鲁士蓝染色及透射电镜显示实验组细胞内聚集较多的铁颗粒;MR扫描显示在500μmol/L FAC培养条件下,实验组T2WI信号显著降低;Western blot结果显示实验组FTH1表达,且经4次传代后仍持续稳定表达。结论成功构建携带FTH1基因的慢病毒载体,并证明FTH1在SK-N-SH细胞中长期稳定表达及聚铁能力。 展开更多
关键词 FTH1 慢病毒载体 磁共振报告基因 人神经母细胞瘤细胞
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狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排后在小鼠神经母细胞瘤细胞中的表型分析 被引量：1
2
作者 梅明珠 杨先锋 +9 位作者 龙腾 张琼 赵静 田钦 彭娇娇 罗均 姜贺 林颖仪 林志雄 郭霄峰 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期33-39,共7页
【目的】探究狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排对基因转录和蛋白表达的影响,揭示病毒在小鼠神经母细胞瘤(NA)细胞中的表型变化与M基因重排的相关性。【方法】通过荧光定量PCR、Western blot以及病毒在NA细胞中的生长和扩散试验,对亲本毒株... 【目的】探究狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排对基因转录和蛋白表达的影响,揭示病毒在小鼠神经母细胞瘤(NA)细胞中的表型变化与M基因重排的相关性。【方法】通过荧光定量PCR、Western blot以及病毒在NA细胞中的生长和扩散试验,对亲本毒株rHEP-Flury和M基因重排毒株M2、M4在NA细胞中的基因转录、表达、生长和扩散进行比较。【结果】狂犬病病毒结构基因的转录和表达主要受病毒基因组RNA合成的影响,但是在一个完整转录过程中单个结构基因的转录比例与其所在位置相关,M基因重排病毒的Leader RNA(LeRNA)和L mRNA的转录比例显著高于亲本毒株rHEP-Flury。M基因重排病毒在NA细胞中的生长和扩散都劣于亲本毒株rHEPFlury。【结论】狂犬病病毒亲本毒株rHEP-Flury具有狂犬病病毒原始的基因组顺序,在NA细胞中的生长和扩散都明显优于M基因重排病毒。结构基因在基因组中的位置主要决定其在一次转录过程中的转录比例,进而影响病毒在NA细胞中的生长和扩散。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 HEP-Flury 基因重排 基质蛋白 表型 神经母细胞瘤细胞
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Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体及稳定表达的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株的构建
3
作者 张静怡 邓永宁 +1 位作者 张萌 屈秋民 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2020年第12期1-8,共8页
目的构建Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,建立Sirt3基因稳定干扰的人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞株。方法从Genbank中检索到Sirt3基因序列,根据此序列设计Sirt3基因的4条siRNA干序列和1条阴性对照序列,将它们分别与含绿色荧光蛋白(GFP)编... 目的构建Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,建立Sirt3基因稳定干扰的人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞株。方法从Genbank中检索到Sirt3基因序列,根据此序列设计Sirt3基因的4条siRNA干序列和1条阴性对照序列,将它们分别与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的线性化慢病毒载体连接,获得4种重组慢病毒质粒。将4种重组的干扰病毒质粒分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,测定病毒滴度。将4种构建的慢病毒载体感染SH-SY5Y细胞,采用Real-time PCR和Western blot检测Sirt3的沉默效果,筛选出最有效干扰Sirt3基因表达组。结果测序证实成功构建了4种Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,病毒滴度分别为:LV-SIRT3-RNAi-18×10^8 TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-23×10^8 TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-38×10^8 TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-48×10^8 TU/mL。与空白对照组(CON)和阴性对照组(NC)相比,LV-Sirt3-RNAi-3组mRNA表达水平及蛋白表达水平显著下降(P<0.001,P<0.001)。结论成功构建Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,并筛选出最佳干扰序列组,获得稳定沉默Sirt3表达的SH-SY5Y细胞株,为后续研究Sirt3在帕金森病细胞模型中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 Sirt3基因 RNA干扰 慢病毒载体 帕金森病 人神经母细胞瘤细胞
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瘤体注射IL-2重组腺病毒基因治疗小鼠胶质母细胞瘤及其免疫机制的初步探讨(英文) 被引量：2
4
作者 洪波 周晓平 +3 位作者 曹雪涛 于益芝 刘建民 岳志健 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第8期717-720,共4页
目的 :观察瘤体直接注射 IL-2重组腺病毒对 G4 2 2皮下荷瘤的治疗作用 ,对体内基因转染效率及治疗的免疫机制进行初步分析。方法 :将 L ac Z、IL -2重组腺病毒直接注射到皮下接种的 G4 2 2胶质母细胞瘤瘤体 ,X-gal染色检测基因转染的效... 目的 :观察瘤体直接注射 IL-2重组腺病毒对 G4 2 2皮下荷瘤的治疗作用 ,对体内基因转染效率及治疗的免疫机制进行初步分析。方法 :将 L ac Z、IL -2重组腺病毒直接注射到皮下接种的 G4 2 2胶质母细胞瘤瘤体 ,X-gal染色检测基因转染的效率 ,观察肿瘤的大小和荷瘤小鼠的存活期 ,采用 4 h5 1Cr释放法检测荷瘤小鼠脾细胞诱导的 NK、L AK、CTL的杀伤活性 ,对治疗后的肿瘤进行常规病理分析。结果 :采用瘤体注射腺病毒具有较高的体内基因转染效率 ,瘤体注射 IL-2重组腺病毒对皮下建立的胶质母细胞瘤有一定的治疗作用 ,肿瘤的生长受抑制 ,荷瘤小鼠的存活期显著延长 ,但没有长期存活小鼠。IL-2基因治疗组小鼠脾细胞的 LAK、CTL杀伤活性显著增强 ,肿瘤局部出现更多的坏死和炎性浸润细胞。结论 :采用瘤体直接注射 IL -2重组腺病毒对胶质母细胞瘤皮下荷瘤有治疗作用 ,其机制可能是增强了宿主的局部和全身抗肿瘤免疫反应。 展开更多
关键词 神经胶质瘤 基因治疗 腺病毒科 白细胞介素2 小鼠 胶质母细胞瘤
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TAZ诱导性过表达慢病毒载体的构建、鉴定及诱导过表达TAZ神经母细胞瘤细胞株的建立 被引量：2
5
作者 阮红峰 应忠明 罗环 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1035-1036,共2页
神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子,参与多种肿... 神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子,参与多种肿瘤细胞的增殖、调控肿瘤转移,并能预测部分肿瘤患者的预后情况[4]。针对Oncomine肿瘤数据库NB肿瘤组织的生物信息学分析发现,TAZ基因在NB肿瘤组织中呈高表达,且随着NB的恶化,表达逐渐升高。而TAZ是否参与NB的形成及恶化尚未完全明确。 展开更多
关键词 TAZ基因 神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 诱导过表达慢病毒载体
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IFN-γ基因修饰对G422胶质母细胞瘤细胞致瘤性及荷瘤小鼠免疫功能的影响
6
作者 岳志健 洪波 +3 位作者 曹雪涛 雷虹 周晓平 王文仲 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第8期721-723,共3页
目的 :观察鼠干扰素 -γ( m IFN-γ)基因修饰的小鼠 G4 2 2胶质母细胞瘤细胞的致瘤性及免疫功能变化。方法 :通过重组腺病毒以 m IFN-γ基因转染 G4 2 2胶质母细胞瘤细胞 ,观察肿瘤的生长和荷瘤小鼠的存活期 ,采用 4 h5 1Cr释放法检测... 目的 :观察鼠干扰素 -γ( m IFN-γ)基因修饰的小鼠 G4 2 2胶质母细胞瘤细胞的致瘤性及免疫功能变化。方法 :通过重组腺病毒以 m IFN-γ基因转染 G4 2 2胶质母细胞瘤细胞 ,观察肿瘤的生长和荷瘤小鼠的存活期 ,采用 4 h5 1Cr释放法检测荷瘤小鼠脾细胞诱导的 NK、LAK、CTL的杀伤活性 ,对治疗后的肿瘤进行常规病理分析。结果 :m IFN-γ基因修饰的 G4 2 2小鼠胶质母细胞瘤体内致瘤生长明显抑制 ( P<0 .0 1 ) ,其荷瘤小鼠生存时间长于对照组 ( P<0 .0 1 )。m IFN-γ组小鼠脾细胞的 LAK、CTL杀伤活性显著增强 ,肿瘤组织有灶性坏死 ,炎细胞浸润。 结论 :m IFN-γ基因对胶质细胞瘤有一定治疗作用 ,其机制可能是增强了宿主的局部和全身抗肿瘤免疫反应。 展开更多
关键词 神经胶质瘤 腺病毒科 干扰素Ⅱ型 细胞毒性 免疫功能 基因治疗 胶质母细胞瘤 小鼠
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急性髓系白血病患者中NRAS的共存基因突变分析 被引量：5
7
作者 盛烨萍 华海应 +4 位作者 晁红颖 朱文艳 王志清 张艳 周晔 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期351-356,共6页
目的:探讨在成人急性髓系白血病(AML)患者中神经母细胞瘤RAS病毒致癌基因(NRAS)的共存基因突变情况及其临床意义。方法:采用高通量DNA测序技术联合Sanger测序法检测51种基因突变,探讨NRAS共存基因突变的发生情况、临床特征及治疗疗效。... 目的:探讨在成人急性髓系白血病(AML)患者中神经母细胞瘤RAS病毒致癌基因(NRAS)的共存基因突变情况及其临床意义。方法:采用高通量DNA测序技术联合Sanger测序法检测51种基因突变,探讨NRAS共存基因突变的发生情况、临床特征及治疗疗效。结果:326例AML患者中,共检测出NRAS突变57例(17.5%)。与无NRAS突变组相比,NRAS突变组患者更年轻(P=0.018),外周血小板水平更低(P=0.033),但在外周白细胞、血红蛋白、性别方面无统计学差异;FAB分型方面,NRAS突变与M2亚型互斥(P=0.038)。57例NRAS突变患者中存在51例(89.5%)共存基因突变;双基因突变25例(43.9%),3个基因突变10例(17.5%),≥4个基因突变16例(28.1%)。突变类型方面,最常见的共存基因突变为KRAS(24.6%,14/57),其他由高到低依次为FLT3-ITD(14.0%,8/57)、RUNX1(12.3%,7/57)、NPM1(10.5%,6/57)、PTPN11(10.5%,6/57)、DNMT3A(10.5%,6/57)等。NRAS伴有NPM1或DNMT3A突变患者的年龄(P=0.013,P=0.005)和外周血小板数(P=0.007,P=0.021)明显高于野生型患者,但在外周白细胞数、血红蛋白水平方面的差异无统计学意义。NRAS伴KRAS、FLT3-ITD、RUNX1或PTPN11突变组与野生型组相比,在年龄、外周白细胞数、血红蛋白、外周血小板数间的差异均无统计学意义。NRAS伴有FLT3-ITD的患者完全缓解(CR)率更低(P=0.044)。但伴KRAS、NPM1、RUNX1、PTPN11、DNMT3A突变组与野生型组之间相比,在CR率方面的差异无统计学意义。单基因突变、双基因突变、3个基因突变、≥4个基因突变患者的CR率逐次下降,两两比较,在CR率方面无统计学差异。结论:NRAS突变发生率高达17.5%,89.5%的NRAS突变阳性的AML患者伴有额外基因突变,NRAS共存基因类型对患者的临床参数及疗效有一定影响。 展开更多
关键词 急性髓系白血病 基因突变 神经母细胞瘤ras病毒致癌基因
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小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定 被引量：1
8
作者 孙钦儒 贾宁 《科学技术与工程》 北大核心 2018年第5期169-172,共4页
构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成... 构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P<0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。 展开更多
关键词 Sirt3基因 慢病毒 人神经母细胞瘤细胞
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用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建 被引量：1
9
作者 张纪文 王露露 +3 位作者 李芳 刘杏 赵东明 步志高 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期1292-1295,共4页
为了进行CRISPR文库筛选,本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a细胞构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系。实验将LentiCas9-Blast、pSPA X2和pMD 2.G 3种质粒共转染人胚胎肾细胞(HEK293T)获取高滴度的重组慢病毒,收集重组慢病毒并感染... 为了进行CRISPR文库筛选,本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a细胞构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系。实验将LentiCas9-Blast、pSPA X2和pMD 2.G 3种质粒共转染人胚胎肾细胞(HEK293T)获取高滴度的重组慢病毒,收集重组慢病毒并感染N2a细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,通过有限稀释法获得含有Cas9基因的多个单克隆细胞株。Western blot结果显示候选细胞系高水平表达Cas9蛋白;利用慢病毒表达报告基因载体系统检测显示候选细胞系的Cas9蛋白具有很高的切割活力;利用CellTiter-Glo试剂检测结果显示,Cas9基因在候选细胞系内高表达但不影响细胞增殖活性。本研究利用慢病毒转导系统构建了稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系,为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控狂犬病病毒嗜神经性提供研究基础。 展开更多
关键词 基因编辑 慢病毒 高通量筛选 鼠神经瘤母细胞
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