酸枣仁醇提物及白桦脂酸抗神经坏死病毒的作用机制

1

作者 徐伟强 玉洁莹 +7 位作者 黄琳 余庆 刘明珠 王劭雯 孙云 韩书煜 秦启伟 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1787-1801,共15页

【目的】探究酸枣仁醇提物(SZSE)及其活性成分白桦脂酸(BA)抗鱼类神经坏死病毒(NNV)的作用机制,为研发绿色、高效、无污染的抗NNV渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光试验确定SZSE及其活性成分BA的... 【目的】探究酸枣仁醇提物(SZSE)及其活性成分白桦脂酸(BA)抗鱼类神经坏死病毒(NNV)的作用机制,为研发绿色、高效、无污染的抗NNV渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光试验确定SZSE及其活性成分BA的细胞安全工作浓度,再利用光学显微镜观察、结晶紫染色及实时荧光定量PCR检测SZSE及其活性成分BA的抗NNV效果,并以实时荧光定量PCR探析二者的抗NNV作用机制。【结果】SZSE及其活性成分BA的细胞安全工作浓度分别为:SZSE≤50μg/mL,BA≤6.25μg/mL,且50μg/mL SZSE或6.25μg/mL BA对卵形鲳鲹脾脏成纤维细胞(TOSF)无毒性作用。NNV与50、25、12.5μg/mL的SZSE或6.25、3.125、1.5625μg/mL的BA分别共孵育TOSF细胞,48 h后发现药物处理的TOSF细胞病变效应(CPEs)明显低于NNV组;结晶紫染色发现药物处理后活的TOSF细胞数量也明显多于NNV组;实时荧光定量PCR检测结果表明,经药物处理后TOSF细胞中NNV的CP基因相对表达量均极显著低于NNV组(P<0.01),且呈剂量依赖关系。SZSE及其活性成分BA在NNV感染前后2 h分别处理TOSF细胞均具有抗病毒效果,表明SZSE及其活性成分BA不仅具有预防病毒感染的作用,还能用于治疗病毒感染。此外,SZSE及其活性成分BA通过与NNV粒子相互作用、干扰NNV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制阶段,以及调控CAT、GSH-Px、HO-1、TGF、Keap1和Nrf2等免疫相关基因的表达,而发挥抗病毒作用。【结论】SZSE及其活性成分BA具有抑制NNV感染的功能,不仅能干扰NNV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制阶段,还通过调控免疫相关基因的表达而发挥抗病毒作用。可见,SZSE及其活性成分BA具有开发为绿色、高效抗NNV渔用药物的潜力。 展开更多

关键词 酸枣仁醇提物(SZSE) 白桦脂酸(BA) 神经坏死病毒(nnv) 抗病毒 安全工作浓度

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于RPA-CRISPR/Cas12a的神经坏死病毒快速检测方法建立

2

作者 闫光达 马红玲 +3 位作者 徐力文 邓益琴 郭志勋 冯娟 《南方水产科学》 北大核心 2025年第4期11-21,共11页

赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)是危害中国海水养殖鱼类的主要病原体之一,尽早检出RGNNV是防控该病毒感染和减少养殖损失的关键措施。为建立快速检测RGNNV的方法,将重组酶聚合酶扩增(Recomb... 赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)是危害中国海水养殖鱼类的主要病原体之一,尽早检出RGNNV是防控该病毒感染和减少养殖损失的关键措施。为建立快速检测RGNNV的方法,将重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)技术与CRISPR/Cas12a(CRISPR,成簇规律间隔短回文重复序列;Cas12a,CRISPR相关蛋白)检测系统相结合,通过设计和筛选RPA引物与crRNA(CRISPR RNA),优化RPA反应条件与CRISPR/Cas12a检测体系,评估该方法的灵敏度与特异性。同时,对临床石斑鱼样本进行检测,并与行业标准《SC/T 7216—2022鱼类病毒性神经坏死病诊断方法》中规定的qPCR法进行一致性比较。结果显示,该检测方法最短可在45 min内得到结果,灵敏度为1.5×10^(1)拷贝·μL^(−1),检测特异性良好,实际样本检测与行标qPCR法对比符合率为100%。研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a-RGNNV检测方法具有快速、便捷、高灵敏度、强特异性和可视化检测结果等特点,为RGNNV的现场快速检测提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 神经坏死病毒 CRISPR/Cas12a 重组酶聚合酶扩增 快速检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

珍珠龙胆石斑鱼病毒性神经坏死病综合防控技术

3

作者 董付静 张收元 +2 位作者 李晓爱 李凯 魏绪镇 《科学养鱼》 2025年第3期56-57,共2页

自1980年我国开始养殖石斑鱼后,石斑鱼养殖环境逐渐恶化,随着养殖规模和密度的不断扩大鱼类细菌性及病毒性疾病相继频发。细菌性疾病主要包括皮肤溃疡病、肠炎病、白斑病;寄生虫病有小瓜虫病、吸虫病;病毒性疾病主要有虹彩病毒引起的黑... 自1980年我国开始养殖石斑鱼后,石斑鱼养殖环境逐渐恶化,随着养殖规模和密度的不断扩大鱼类细菌性及病毒性疾病相继频发。细菌性疾病主要包括皮肤溃疡病、肠炎病、白斑病;寄生虫病有小瓜虫病、吸虫病;病毒性疾病主要有虹彩病毒引起的黑身病和神经坏死病毒引起的病毒性神经坏死病,尤其是病毒性神经坏死病具有较强的传染性,主要危害石斑鱼养殖过程中的稚鱼和幼鱼期,患病鱼类死亡率高,严重时会引发鱼苗在一周内全部死亡,对鱼类养殖造成巨大的威胁和经济损失,怎样合理防控病毒性神经坏死病成为当前海水养殖业发展中无法避免的重大问题。 展开更多

关键词 病毒性疾病 细菌性疾病 神经坏死病毒 小瓜虫病 鱼类养殖 肠炎病 虹彩病毒 吸虫病

在线阅读 下载PDF 职称材料

太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化 被引量：8

4

作者 毛明光 温施慧 +4 位作者 姜志强 蒋洁兰 孙航 吕绘倩 李幸 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期117-123,共7页

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.co... 为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。 展开更多

关键词 太平洋鳕 神经坏死病毒 衣壳蛋白 原核表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化 被引量：7

5

作者 陈晓艳 翁少萍 +1 位作者 殷志新 何建国 《中山大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期83-86,共4页

将含有斜带石斑鱼Epinephelus coioides神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus,OGNNV)主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因的重组表达质粒载体pET32a_MCP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合表达,经SDS_PAG... 将含有斜带石斑鱼Epinephelus coioides神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus,OGNNV)主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因的重组表达质粒载体pET32a_MCP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合表达,经SDS_PAGE分析和Western_blot鉴定,证实了重组大肠杆菌融合表达了斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白。表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,提取的包涵体中融合蛋白含量占60%以上,经柱层析纯化蛋白,纯化度达90%以上。 展开更多

关键词 斜带石斑鱼Epinephelus coioides 神经坏死病毒 主衣壳蛋白 原核表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

斜带石斑鱼神经坏死病毒基因组RNA1和RNA2序列测定及分析 被引量：9

6

作者 陈晓艳 翁少萍 +3 位作者 吕玲 黄剑南 殷志新 何建国 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期73-77,共5页

根据GenBank数据库公布的鱼类神经坏死病毒(nervousnecrosisvirus,NNV)同源序列设计了7对特异性引物,采用RT＿PCR方法扩增出目的片断,将PCR产物测序和分析。斜带石斑鱼Epinepheluscoioides神经坏死病毒(orange＿spottedNNV,OGNNV)基因... 根据GenBank数据库公布的鱼类神经坏死病毒(nervousnecrosisvirus,NNV)同源序列设计了7对特异性引物,采用RT＿PCR方法扩增出目的片断,将PCR产物测序和分析。斜带石斑鱼Epinepheluscoioides神经坏死病毒(orange＿spottedNNV,OGNNV)基因组由两个片断(RNA1和RNA2)组成,RNA1由3103个核苷酸组成,含有一个开放阅读框,编码982个氨基酸;RNA2由1433个核苷酸组成,含有一个开放阅读框,编码338个氨基酸。OGNNV基因组与新加坡GGNNV(greasygrouperNNV)的基因组有高度的相似性。分析病毒的RNA2序列发现:OGNNV与DGNNV(dragongrouperNNV)、RGNNV(redspottedNNV)和GGNNV的亲缘关系很近,并且具有相同的中和位点;分析病毒的RNA1序列,发现在OGNNV的RNA1序列中同样可以找到依赖RNA的RNA聚合酶的6个模序(motif)。根据同源性比较和系统进化分析,OGNNV属于RGNNV血清型的成员。 展开更多

关键词 斜带石斑鱼Epinephelus coioides神经坏死病毒 基因组序列测定与分析 β诺达病毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

鱼类神经坏死病毒对军曹鱼仔鱼的致病性 被引量：5

7

作者 闫云锋 苏友禄 +4 位作者 郭志勋 徐力文 冯娟 黄剑南 喻达辉 《海洋科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期6-10,共5页

为了确定鱼类神经坏死病毒对军曹鱼(Rachycentron canadum)仔鱼的致病性,本研究通过肌肉注射、浸泡和共浴3种途径分别感染军曹鱼仔鱼,观察了由其导致的发病死亡情况和病理学变化。结果表明,3种感染途径都能造成军曹鱼仔鱼出现厌食、体... 为了确定鱼类神经坏死病毒对军曹鱼(Rachycentron canadum)仔鱼的致病性,本研究通过肌肉注射、浸泡和共浴3种途径分别感染军曹鱼仔鱼,观察了由其导致的发病死亡情况和病理学变化。结果表明,3种感染途径都能造成军曹鱼仔鱼出现厌食、体色发黑和螺旋游泳等典型的病毒性神经坏死症症状,累计死亡率分别达到78%、44%和34%。肌肉注射18h后,利用RT-PCR方法在鱼的脑、眼、脊髓中均可检测到该病毒。患病鱼的脑、视网膜、脊髓等组织发生空泡化,与其他鱼类感染该病毒发生的变化一致。因此,军曹鱼仔鱼是鱼类诺达病毒的易感种群之一,病毒能通过水平传播感染军曹鱼仔鱼。 展开更多

关键词 鱼类神经坏死病毒 军曹鱼(Rachycentron canadum)仔鱼 致病性

在线阅读 下载PDF 职称材料

神经坏死病毒在赤点石斑鱼组织中的分布 被引量：5

8

作者 刘晓丹 胡先勤 +12 位作者 黄剑南 翁少萍 王文文 陈文捷 秦真东 董星星 周洋 刘小玲 姬伟 张学振 郭志勋 何建国 林蠡 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期876-882,共7页

研究采用地高辛原位杂交和免疫荧光检测技术分别检测病毒RNA2和衣壳蛋白在患病赤点石斑鱼Epinephelus akaara稚鱼中分布。地高辛检测结果表明病毒RNA2主要分布在脑、脊髓、视网膜和鳃上;免疫荧光检测结果和地高辛检测结果一致,表明病毒... 研究采用地高辛原位杂交和免疫荧光检测技术分别检测病毒RNA2和衣壳蛋白在患病赤点石斑鱼Epinephelus akaara稚鱼中分布。地高辛检测结果表明病毒RNA2主要分布在脑、脊髓、视网膜和鳃上;免疫荧光检测结果和地高辛检测结果一致,表明病毒靶器官主要也是脑、脊髓、视网膜和鳃。肠道中几乎检测不到阳性信号,可能不是病毒的靶器官。因此可以推测神经坏死病毒感染赤点石斑鱼的主要途径是鳃,而不是肠道。 展开更多

关键词 神经坏死病毒 赤点石斑鱼 地高辛原位杂交 免疫荧光 组织分布

在线阅读 下载PDF 职称材料

原位杂交技术在斜带石斑鱼神经坏死病毒检测中的应用 被引量：11

9

作者 陈晓艳 何建国 《海洋科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期1-4,共4页

根据斜带石斑鱼(Epinephelus coioids)神经坏死病毒(orange-spotted nervous necrosis virus,OGNNV)的主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因的保守序列,设计一对引物,从感染OGNNV的斜带石斑鱼组织匀浆液提取RNA为模板进行RT-PCR扩... 根据斜带石斑鱼(Epinephelus coioids)神经坏死病毒(orange-spotted nervous necrosis virus,OGNNV)的主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因的保守序列,设计一对引物,从感染OGNNV的斜带石斑鱼组织匀浆液提取RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到426 bp的cDNA片断。用得到的RT-PCR产物加上地高辛(DIG)标记作为核酸探针。通过注射病毒提取液人工感染一组斜带石斑鱼,解剖感染病毒的斜带石斑鱼,从中分离出脑和眼睛,运用原位杂交技术检测组织中的OGNNV。实验表明,原位杂交具有较高的灵敏性和特异性,可以用原位杂交的办法来检测养殖的石斑鱼是否有携带该病毒,达到监控和预防神经坏死病爆发的目的。本实验还采用了H&E染色方法检测了感染NNV的石斑鱼脑部和眼部组织,观察细胞内的坏死部分。与原位杂交做对比,提高了检测的可靠性和准确性。本实验建立的石斑鱼神经坏死病毒的ISH检测方法有着较高的特异性和敏感性,易于操作,有助于石斑鱼神经坏死病毒的组织定位、发病机理的研究。 展开更多

关键词 神经坏死病毒 地高辛 原位杂交

在线阅读 下载PDF 职称材料

赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因原核表达条件优化 被引量：4

10

作者 苏友禄 冯娟 +3 位作者 孙秀秀 郭志勋 闫云锋 黄剑南 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第6期2422-2424,2429,共4页

[目的]优化赤点石斑鱼神经坏死病毒的主衣壳蛋白(MCP)基因的原核表达条件。[方法]采用RT-PCR技术扩增出赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因,构建重组表达载体pRSETA-MCP,以其转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,在不同培养基、温度、pH值条件下进... [目的]优化赤点石斑鱼神经坏死病毒的主衣壳蛋白(MCP)基因的原核表达条件。[方法]采用RT-PCR技术扩增出赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因,构建重组表达载体pRSETA-MCP,以其转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,在不同培养基、温度、pH值条件下进行诱导表达。[结果]重组菌在SOB和LB培养基、pH值7.0、37℃条件下表达量最高,所得的融合蛋白分子量约为44.5 kD。[结论]该研究为RGNNV-MCP疫苗研制奠定了基础。 展开更多

关键词 赤点石斑鱼 神经坏死病毒 主衣壳蛋白 表达条件

在线阅读 下载PDF 职称材料

神经坏死病毒MCP重组疫苗对军曹鱼稚鱼的免疫保护 被引量：3

11

作者 苏友禄 郭志勋 +2 位作者 冯娟 闫云锋 黄剑南 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第S1期228-231,241,共5页

用赤点石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因重组蛋白制备成的疫苗,通过腹腔注射免疫军曹鱼稚鱼,实验鱼分为一次免疫组A(A1、A2、A3)和三次免疫组B(B1、B2、B3)及对照组C。结果显示免疫效果与免疫接种的剂量并不是呈线性关系,免疫剂量为50μg... 用赤点石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因重组蛋白制备成的疫苗,通过腹腔注射免疫军曹鱼稚鱼,实验鱼分为一次免疫组A(A1、A2、A3)和三次免疫组B(B1、B2、B3)及对照组C。结果显示免疫效果与免疫接种的剂量并不是呈线性关系,免疫剂量为50μg的B2组免疫效果明显好过10μg或100μg的B3组。免疫组死亡率和发病率均比对照组低,其中A2、B2组的相对存活率和相对保护率分别为31%、28%和54%、56%。B2组和对照组的累计死亡率和发病率呈现极显著差异,分别为P<0.01和P<0.04。免疫组间比较,三次免疫组死亡率和发病率均比一次免疫组低。在对存活下来的鱼进行RT-PCR检测,免疫组的阳性率只有60%或80%,而对照组的则高达100%。可见,此重组疫苗对军曹鱼有显著的免疫保护效应,可作为预防神经坏死病毒感染的疫苗。 展开更多

关键词 神经坏死病毒 重组疫苗 军曹鱼稚鱼 免疫保护力

在线阅读 下载PDF 职称材料

石斑鱼神经坏死病毒RNA干扰的转染条件优化与效果分析 被引量：2

12

作者 黄桂菊 喻达辉 +4 位作者 柳明 潘俐玲 王晓宁 曾令兵 龙华 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期93-98,共6页

克隆了石斑鱼神经坏死病毒（Nervous necrosis virus,NNV）的衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）基因序列并构建了绿色荧光蛋白（EGFP）基因与MCP基因的融合真核表达载体pEGFP-MCP,设计了3对针对MCP基因序列的小片段干扰性RNA（Small... 克隆了石斑鱼神经坏死病毒（Nervous necrosis virus,NNV）的衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）基因序列并构建了绿色荧光蛋白（EGFP）基因与MCP基因的融合真核表达载体pEGFP-MCP,设计了3对针对MCP基因序列的小片段干扰性RNA（Small interfering RNA,siRNA）序列（NNV-001、NNV-002、NNV-003）,开展了转染方法、转染剂量与转染效果的研究,用脂质体转染法将pEGFP-MCP和不同剂量的siRNA共转染导入黑头呆鱼肌肉（FHM）细胞.结果表明,用无血清培养基转染、4-6 h后换液的转染方法,比不换液、只将转染混合物代替同体积培养基的转染方法效率高;当质粒的转染量为50、70、100和150 ng时,100 ng的转染量为最合适;在pEGFP-MCP与siRNA共转染组,3对siRNA序列都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中NNV-002效果最好.当siRNA终浓度为200 nmol/L时,显示出了较好的沉默效果. 展开更多

关键词 石斑鱼 神经坏死病毒 衣壳蛋白基因 RNA干扰

在线阅读 下载PDF 职称材料

中国大亚湾赤点石斑鱼神经坏死病毒分离株的基因型分析 被引量：5

13

作者 黄剑南 林蠡 +4 位作者 翁少萍 王云新 刘付永忠 张海发 何建国 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2004年第11期75-80,共6页

用鱼类细胞株SSN-1(斑鳢细胞株1)对分布在大亚湾赤点石斑幼鱼的神经坏死病毒(大亚湾株)进行感染实验。在25℃的培养条件下接种3天后，病毒株可以导致细胞出现明显的致细胞病变作用：细胞变圆，有颗粒，细胞质有空泡，细胞在接种3～6天... 用鱼类细胞株SSN-1(斑鳢细胞株1)对分布在大亚湾赤点石斑幼鱼的神经坏死病毒(大亚湾株)进行感染实验。在25℃的培养条件下接种3天后，病毒株可以导致细胞出现明显的致细胞病变作用：细胞变圆，有颗粒，细胞质有空泡，细胞在接种3～6天后部分或者全部脱落，表明此病毒株对暖水条件比较适应。病毒在组织中的滴度为10m(TCID50)g^-1。分别用HaeⅢ酶和Sau3AI酶对病毒外壳蛋白基因片段T2(约870bp)进行限制性酶切片段长度多态性研究表明，其结果和日本的赤点石斑神经坏死病毒一致。对19株神经坏死病毒部分外壳蛋白氨基酸序列(276个氨基酸)进行分子进化分析，结果表明大亚湾株属于赤点石斑神经坏死病毒基因型。 展开更多

关键词 神经坏死病毒 赤点石斑鱼 病毒株 分离株 外壳蛋白基因 斑鳢 接种 基因型分析 滴度 细胞株

在线阅读 下载PDF 职称材料

七带石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法 被引量：3

14

作者 刘滨 刘新富 +2 位作者 曾霖 孟振 刘江春 《天津农业科学》 CAS 2016年第7期23-28,共6页

报道了一种可以快速、灵敏地检测七带石斑鱼神经坏死病毒(NNV)的逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。该方法参考赤点石斑鱼NNV病毒的主衣壳蛋白(MCP)基因的保守序列,设计1对引物克隆出七带石斑鱼NNV的基因序列,利用Primer Explorer V4... 报道了一种可以快速、灵敏地检测七带石斑鱼神经坏死病毒(NNV)的逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。该方法参考赤点石斑鱼NNV病毒的主衣壳蛋白(MCP)基因的保守序列,设计1对引物克隆出七带石斑鱼NNV的基因序列,利用Primer Explorer V4软件设计了3对针对所克隆NNV基因序列的特异性引物,建立了RT-LAMP的反应体系,并分别对反应系统的引物浓度、反应温度和时间进行了优化,形成了七带石斑鱼NNV病毒RT-LAMP检测技术。实践应用结果表明,在63℃的最佳反应温度下,采用RT-LAMP检测技术经过45 min就能完成一次检测,准确率达到100%。本研究建立的RT-LAMP检测NNV技术设备要求简单,为七带石斑鱼等石斑鱼无NNV受精卵和仔稚鱼的生产现场检测和筛选提供了一种方便、灵敏的检测方法。 展开更多

关键词 七带石斑鱼 神经坏死病毒 检测 RT-LAMP

在线阅读 下载PDF 职称材料

赤点石斑鱼神经坏死病毒主衣壳重组蛋白多克隆抗体的制备 被引量：2

15

作者 苏友禄 郭志勋 +2 位作者 冯娟 闫云锋 喻达辉 《南方水产》 2010年第6期8-13,共6页

把赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)神经坏死病毒(RGNNV)主衣壳蛋白(MCP)基因的重组表达质粒载体pRSETA-MCP转化至大肠杆菌(Estherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示表达的重组蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,分子量... 把赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)神经坏死病毒(RGNNV)主衣壳蛋白(MCP)基因的重组表达质粒载体pRSETA-MCP转化至大肠杆菌(Estherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示表达的重组蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,分子量约44.5kD。通过Ni-NTA-Agarose亲和层析柱纯化,经分析纯度达90%,之后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1:12800以上。Western-blot分析结果显示,该血清与表达的重组蛋白有较强反应,说明通过原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 赤点石斑鱼神经坏死病毒 主衣壳重组蛋白 多克隆抗体 免疫原性

在线阅读 下载PDF 职称材料

石斑鱼神经坏死病毒传播途径阻断的初步研究 被引量：13

16

作者 林克冰 方琼珊 +4 位作者 吴建绍 周宸 何丽斌 林琪 王涵生 《福建水产》 2011年第5期15-19,共5页

本文报告了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)苗种培育中亲鱼、卵、饵料等几个关键环节的病毒携带检测以及几种药物对病毒的消除效果的试验。用RT-PCR法检测斜带石斑鱼亲鱼的粪便、卵、仔鱼、稚鱼,饵料轮虫、桡足类中都有检出神经坏死病... 本文报告了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)苗种培育中亲鱼、卵、饵料等几个关键环节的病毒携带检测以及几种药物对病毒的消除效果的试验。用RT-PCR法检测斜带石斑鱼亲鱼的粪便、卵、仔鱼、稚鱼,饵料轮虫、桡足类中都有检出神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)。聚维酮碘5～10mg/L浸泡卵20min、浸泡轮虫和桡足类30min,盐酸吗啉胍3～5mg/L浸泡卵30min、浸泡轮虫和桡足类40min,聚维酮碘5mg/L+盐酸吗啉胍3mg/L浸泡卵20min、浸泡轮虫和桡足类30min可有效灭活所携带的神经坏死病毒活性。 展开更多

关键词 斜带石斑鱼 神经坏死病毒 传播途径 阻断

在线阅读 下载PDF 职称材料

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)病毒性神经坏死病毒的纯化分析及检测方法建立 被引量：5

17

作者 葛辉 吴丽云 +8 位作者 周宸 黄种持 吴建绍 郑乐云 林琪 杨求华 吴水清 王艺磊 林克冰 《渔业研究》 2019年第2期96-105,共10页

根据GenBank中已有的鱼类病毒性神经坏死病毒(NNV)RNA2基因序列,设计引物,从福建厦门具有典型NNV发病症状的斜带石斑鱼中克隆了RNA2基因的全长序列,并将序列提交到GenBank获得登录号为MF510920,命名为XMNNV。系统进化树分析结果表明XMNN... 根据GenBank中已有的鱼类病毒性神经坏死病毒(NNV)RNA2基因序列,设计引物,从福建厦门具有典型NNV发病症状的斜带石斑鱼中克隆了RNA2基因的全长序列,并将序列提交到GenBank获得登录号为MF510920,命名为XMNNV。系统进化树分析结果表明XMNNV与RGNNV聚类在一起,与SJNNV、BFNNV和TPNNV等其他鱼类神经坏死病毒亲缘关系较远,说明本研究分离得到的XMNNV属于RGNNV基因型。通过超速离心方法对病毒进行提纯,得到了纯化的NNV病毒。电镜观察结果表明,病毒粒子直径20～25 nm,结构为正二十面体,与已经报道的NNV结构一致。通过对XMNNV与其它RGNNV RNA2基因进行序列比对,在保守区设计引物,运用RT-PCR方法建立了RGNNV的PCR检测方法,该方法灵敏度高达67 copies/μL。纯化的病毒对E11(条纹月鳢细胞系)和大黄鱼肌肉细胞进行感染,结果表明该病毒可以感染这两种鱼类细胞。E11细胞被感染病毒后,细胞出现空泡化,并最终导致细胞分解死亡;大黄鱼肌肉细胞感染后,细胞变圆,慢慢从培养皿壁脱落,最终解体死亡。另外,对感染后细胞进行PCR检测,结果显示为阳性,进一步确定了分离的NNV具有感染这两种细胞的能力。本研究通过电镜观察和PCR检测两种方法确定了患病石斑鱼携带NNV,通过对两种鱼类细胞的感染实验,确定了该病毒具有一定的感染能力。综上,本研究为石斑鱼NNV疾病的诊断提供了有效的方法,对石斑鱼NNV疾病的预防具有一定的指导意义。 展开更多

关键词 斜带石斑鱼 神经坏死病毒 分离纯化 E11细胞系 大黄鱼肌肉细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

臭氧对赤点石斑鱼神经坏死病毒RNA破坏效果的评价方法的建立与应用

18

作者 李晋 史成银 +1 位作者 王胜强 粟子丹 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2015年第1期18-25,共8页

本研究依据赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)RNA2的序列,在其3′端设计反转录引物,在5′端设计PCR扩增引物,构建了一种可以评价RNA链相对完整性的RT-PCR方法,命名为LR RT-PCR(Left reverse tr... 本研究依据赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)RNA2的序列,在其3′端设计反转录引物,在5′端设计PCR扩增引物,构建了一种可以评价RNA链相对完整性的RT-PCR方法,命名为LR RT-PCR(Left reverse transcript Right amplify RT-PCR),并对该方法的引物浓度、Mg2+浓度、d NTPs浓度、退火温度4个重要参数进行了优化。结果显示,优化后的LR RT-PCR反应体系为:引物浓度0.2μmol/L、Mg2+浓度4 mmol/L、d NTPs浓度0.5 nmol、退火温度60℃。本研究建立的LR RT-PCR方法灵敏度高,可以检出1 pg的RGNNV RNA2标准品;该方法特异性强,与RSIV等鱼类常见病毒、鳗弧菌等常见水产病原菌以及石斑鱼RNA均不产生交叉反应。应用建立的LR RT-PCR方法对臭氧破坏RGNNV RNA2的效果进行评价,发现当臭氧浓度由0.3 mg/L依次增加为0.5、1.0、2.0 mg/L时,LR RT-PCR的扩增产物逐渐减少,直至消失。结果表明,建立的LR RT-PCR方法可以快速、准确地评价臭氧对RGNNV RNA2的破坏效果,适用于养殖场评估臭氧对RGNNV的消毒效果,并对RGNNV进行检测和监控。 展开更多

关键词 赤点石斑鱼神经坏死病毒 RT-PCR 检测 臭氧 消毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性研究 被引量：5

19

作者 蒋方军 高隆英 +1 位作者 何俊强 江育林 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期409-413,共5页

收集福建某渔场的患病石斑鱼苗制备组织切片,同时将患病石斑鱼苗组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系（striped snakehead,SSN-1）,对发生细胞病变（cytopathic effects,CPE）的SSN-1细胞进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、纯化负染,并... 收集福建某渔场的患病石斑鱼苗制备组织切片,同时将患病石斑鱼苗组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系（striped snakehead,SSN-1）,对发生细胞病变（cytopathic effects,CPE）的SSN-1细胞进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、纯化负染,并制备细胞超薄切片,借助SSN-1细胞系从患病石斑鱼苗中分离病毒性神经坏死病毒（viral nervous necrosis virus,VNNV）。试验结果表明：在病鱼脑和视网膜中可见大量的空泡,接种SSN-1后2～3 d出现CPE,PCR检测可扩增出VNNV特异性带,提示这是VNNV病毒。负染及SSN-1细胞超薄切片的电镜观察显示,该病毒为直径25～30 nm的二十面体病毒粒子,在胞质中呈不完全晶体状排列,同时细胞质中有大量空泡,进一步说明分离株为VNNV。对该分离株进行细胞敏感性试验、脂溶剂敏感试验（氯仿处理）、热敏感试验（55℃30 min）、酸碱敏感试验（pH值为3和pH值为11各1 h）,试验结果表明：石斑鱼吻端细胞、鲤上皮瘤细胞、肥头鲤细胞在28℃、25℃、20℃时对该病毒都不敏感;该病毒对氯仿不敏感,对热和酸碱都比较敏感。研究结果表明,用SSN-1细胞系可以从患病鱼中分离VNNV。 展开更多

关键词 病毒性神经坏死病毒 分离 病毒特性

在线阅读 下载PDF 职称材料

引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒病 被引量：5

20

作者 粟子丹 李晋 史成银 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2016年第4期110-115,共6页

2012和2013年,山东某育苗场15–20日龄的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗出现暴发性大规模死亡,7 d内死亡率高达90%–100%。本研究调查了疾病的发生情况和临床特征,采集病鱼样品进行了组织病理学检查,并运用RT-PCR... 2012和2013年,山东某育苗场15–20日龄的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗出现暴发性大规模死亡,7 d内死亡率高达90%–100%。本研究调查了疾病的发生情况和临床特征,采集病鱼样品进行了组织病理学检查,并运用RT-PCR方法进行了病原的检测和基因序列分析。结果发现,半滑舌鳎鱼苗一般在7月和8月发病,发病时养殖水温为22–24℃。病鱼游泳行为异常,表现为上下翻游、螺旋性游动、全身大幅度波浪状浮动症状,但病鱼体表无出血和溃疡症状。组织病理检查发现,病鱼脑和视网膜组织出现严重的空泡化及坏死。病鱼样品的RT-PCR检测结果全部呈鱼类神经坏死病毒阳性。对得到的RT-PCR产物测序,进行BLAST比对,发现该病毒与鱼类神经坏死病毒的赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)基因型的相似性达98%以上,而与鱼类神经坏死病毒的其他3个基因型:黄带拟鲹神经坏死病毒(Striped jack nervous necrosis virus,SJNNV)、红鳍东方鲀神经坏死病毒(Tiger puffer nervous necrosis virus,TPNNV)和条斑星鲽神经坏死病毒(Barfin flounder nervous necrosis virus,BFNNV)的相似性仅为71%–78%。由此可以判定,本研究发现的引起半滑舌鳎鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒为RGNNV基因型,半滑舌鳎也是鱼类神经坏死病毒的天然宿主。该发现在半滑舌鳎疾病防治和鱼类神经坏死病毒的流行机制研究方面都具有重要意义。 展开更多

关键词 半滑舌鳎 赤点石斑鱼神经坏死病毒 RT-PCR 检测

在线阅读 下载PDF 职称材料