结缕草叶肉细胞原生质体瞬时基因表达系统的构建 被引量：1

1

作者 管瑾 郭一荻 +2 位作者 刘凌云 尹淑霞 滕珂 《草业学报》 CSCD 北大核心 2023年第7期61-71,共11页

为了结合转基因方法探索结缕草基因功能,建立高效、快速的结缕草原生质体制备及瞬时基因表达系统,利用正交试验对影响原生质体制备的主要因素进行优化,同时利用原生质体进行亚细胞定位和蛋白互作研究。结果表明,当酶配比为2%(w/v) cellu... 为了结合转基因方法探索结缕草基因功能,建立高效、快速的结缕草原生质体制备及瞬时基因表达系统,利用正交试验对影响原生质体制备的主要因素进行优化,同时利用原生质体进行亚细胞定位和蛋白互作研究。结果表明,当酶配比为2%(w/v) cellulase R10和1.5%(w/v) macerozyme R10,酶解时间为7 h时,原生质体产量和活性均达到最高,分别为1.23×107个·mL^(-1)和98%以上,满足后续转化所需。多次重复试验表明,加入5~10μg质粒,原生质体转化率可达75%以上。利用原生质体转化体系进行了亚细胞定位检测,结果发现结缕草ZjNOL和ZjNYC1定位在叶绿体中,ZjZFN定位在细胞核中。双分子荧光互补分析证明ZjNOL和ZjNYC1在叶绿体中相互作用。原生质体制备及转化方法与遗传学和组学技术相结合,能够为结缕草基因功能研究和基因编辑提供支持。 展开更多

关键词 结缕草 原生质体 瞬时基因表达 亚细胞定位 蛋白互作

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一种在莲花瓣中实现基因瞬时表达的实验设计

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作者 李静 刘瑞珍 黄薇 《实验技术与管理》 CAS 北大核心 2024年第1期78-84,共7页

基因瞬时表达是研究目标基因功能的快速、有效手段,在植物领域得到了广泛应用。为了使学生充分了解基因工程技术在植物次级代谢物研究中的应用,实现科研反哺教学,设计了植物基因瞬时表达并影响其次级代谢物质积累的综合实验。选取非模... 基因瞬时表达是研究目标基因功能的快速、有效手段,在植物领域得到了广泛应用。为了使学生充分了解基因工程技术在植物次级代谢物研究中的应用,实现科研反哺教学,设计了植物基因瞬时表达并影响其次级代谢物质积累的综合实验。选取非模式植物莲(Nelumbo nucifera)转录因子NnWRKY70和NnMYB5为研究对象,运用分子克隆技术构建双元表达载体。利用农杆菌注射法将目标基因导入莲花瓣中实现瞬时转化,发现过表达NnWRKY70和Nn MYB5能促进莲生物碱的合成以及花瓣花青素的积累。该实验是对以往植物生物学及生理学实验内容的扩充,有利于培养和提高学生的科研思维和实践创新能力。 展开更多

关键词 基因瞬时表达 莲 花瓣 转录因子 次级代谢物

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甜菊葡萄糖苷转移酶基因SrUGT76G1启动子的克隆及其功能的瞬时表达分析 被引量：2

3

作者 杨永恒 徐晓洋 +6 位作者 孙玉明 原海燕 刘清泉 张永侠 王银杰 黄苏珍 佟海英 《江苏农业科学》 2018年第6期27-33,共7页

甜菊苷(stevioside,St)和莱鲍迪苷A(rebaudioside A,R-A)是甜菊叶片中两大主要糖苷组分,甜菊糖苷生物合成途径的研究表明SrUGT76G1基因在St向R-A转化中起关键作用。为了进一步研究SrUGT76G1基因的表达调控,本试验采用hiTAIL-PCR的方法,... 甜菊苷(stevioside,St)和莱鲍迪苷A(rebaudioside A,R-A)是甜菊叶片中两大主要糖苷组分,甜菊糖苷生物合成途径的研究表明SrUGT76G1基因在St向R-A转化中起关键作用。为了进一步研究SrUGT76G1基因的表达调控,本试验采用hiTAIL-PCR的方法,经过2次步移从甜菊基因组中克隆到SrUGT76G1基因翻译起始位点上游2 283 bp的启动子序列。采用PlantCARE、PLACE等在线工具对序列进行分析,结果显示在这段序列上共有475个顺式调控元件,除了TATA-box、CAAT-box、MYB结合位点等典型的保守元件外,还包括光照、干旱、厌氧等环境因子响应元件,生长素、赤霉素等植物激素响应元件,芽、胚乳等组织特异性表达元件等。为了初步研究SrUGT76G1基因启动子的功能,本试验通过克隆SrUGT76G1转录起始位点上游1 989 bp带酶切位点的序列,将其替换植物表达载体pCAMBIA1301-220中的CaMV35S启动子,连接下游的GUS报告基因,构建重组植物表达载体pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P,以pCAMBIA1301-220载体作对照,通过农杆菌(EHA105)真空渗透法转入拟南芥和甜菊幼苗。瞬时表达结果表明,该SrUGT76G1启动子序列能驱动GUS基因在拟南芥和甜菊叶片中表达,具有启动子活性。 展开更多

关键词 甜菊 SrUGT76G1启动子 调控元件 植物表达载体 基因瞬时表达

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农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用 被引量：4

4

作者 宋建 刘仲齐 《天津农业科学》 CAS 2008年第1期20-22,共3页

主要介绍了农杆菌介导的基因瞬时表达方法的原理、技术、影响因素及其在外源基因表达分析、启动子分析、基因沉默及防卫反应等方面的应用。

关键词 农杆菌 植物 基因瞬时表达

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利用GUS基因的瞬时表达优化大豆根癌农杆菌介导的遗传转化 被引量：6

5

作者 杨明明 高海京 +5 位作者 马啸燕 孙英楠 邵宇鹏 包格格 李文滨 王志坤 《大豆科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期353-359,共7页

高转化效率是分子育种的重要前提,根癌农杆菌介导的遗传转化由于其有较高的遗传效率和较低的拷贝数成为目前优选方法。为优化大豆遗传转化体系,以本实验室已有转化体系为基础,利用pCAMBIA3301中35S∶GUS基因瞬时表达体系,从萌发时间、... 高转化效率是分子育种的重要前提,根癌农杆菌介导的遗传转化由于其有较高的遗传效率和较低的拷贝数成为目前优选方法。为优化大豆遗传转化体系,以本实验室已有转化体系为基础,利用pCAMBIA3301中35S∶GUS基因瞬时表达体系,从萌发时间、切豆方法、侵染时间、共培养方式以及共培养时间等方面对东农47、垦农18和B12088大豆栽培品种的遗传转化体系进行优化。结果表明:东农47萌发1 d,侵染30 min;垦农18和B12088萌发12 h,侵染30 min,GUS基因瞬时表达率最高。在其它的处理上,3个品种表现结果一致,即蘸取菌液切豆,共培养中子叶伤口朝下摆放,黑暗条件下共培养3～5 d,GUS基因瞬时表达最高。3个品种在最适条件下,GUS染色效率均达到90%以上,垦农18遗传转化效率较高。本研究为大豆农杆菌介导子叶节转化方法提供了一个改进的方案,并且为拓宽可利用于大豆遗传转化的种质资源奠定基础。 展开更多

关键词 根癌农杆菌 大豆遗传转化 转化率 GUS基因瞬时表达

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鼠源抗过敏融合蛋白的瞬时表达及纯化

6

作者 程露 易小萍 +1 位作者 孙祥明 张元兴 《华东理工大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期532-537,共6页

采用流加和降温培养工艺,实现在5 L搅拌式生物反应器规模的瞬时基因表达。首先比较了两种表达载体在CHO-S细胞中的瞬时基因表达,发现pID-mAAFP载体介导的瞬时转染表达可以获得mAAFP的高水平表达。采用pID-mAAFP载体在1.3 L搅拌式生物反... 采用流加和降温培养工艺,实现在5 L搅拌式生物反应器规模的瞬时基因表达。首先比较了两种表达载体在CHO-S细胞中的瞬时基因表达,发现pID-mAAFP载体介导的瞬时转染表达可以获得mAAFP的高水平表达。采用pID-mAAFP载体在1.3 L搅拌式生物反应器中进行瞬时基因表达,与分批培养相比,通过流加和降温培养工艺对转染过程进行控制,培养时间延长1倍,蛋白表达浓度提高8倍。在5 L搅拌式生物反应器中对上述工艺进行成功放大,mAAFP质量浓度达到25 mg/L。之后,利用rProtein A Sepharose Fast Flow介质纯化mAAFP,并通过SDS-PAGE、Western blot验证其纯度,为下一步利用小鼠模型研究蛋白功效和作用机理做好准备。 展开更多

关键词 融合蛋白 瞬时基因表达 中国仓鼠卵巢细胞 过敏

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棉纤维起始分化期基因枪介导的GhSuSy表达分析

7

作者 吕淑芳 张红晓 +1 位作者 胥华伟 赵杏利 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2022年第7期1361-1368,共8页

蔗糖合酶(sucrose synthase)通过调节植物糖代谢介导棉纤维的起始和发育。为进一步研究棉纤维起始分化过程中蔗糖合酶的转录调控机制,克隆了GhSuSy基因5′端上游2000 bp的启动子片段,构建了含LUC荧光报告基因的重组载体,采用基因枪瞬时... 蔗糖合酶(sucrose synthase)通过调节植物糖代谢介导棉纤维的起始和发育。为进一步研究棉纤维起始分化过程中蔗糖合酶的转录调控机制,克隆了GhSuSy基因5′端上游2000 bp的启动子片段,构建了含LUC荧光报告基因的重组载体,采用基因枪瞬时转化技术,把重组载体DNA分别转化到棉花叶片和花瓣,比较分析了不同载体膜压力、不同轰击距离与孵育时间等条件下的荧光素酶(luciferase,LUC)活性。用优化后的条件检测了棉纤维起始分化期蔗糖合酶基因GhSuSy偶联的LUC在叶片和花瓣中的活性,并与GhSuSy表达、蔗糖合酶活性比较分析。结果显示:-0.09 MPa真空度下,可裂膜压力设为6.80 MPa,载体膜距离叶片7 cm,轰击2次转化效率最高,转化后样品孵育16 h左右LUC荧光信号最强;与叶片中LUC表达相比,花瓣中LUC荧光信号强、活性高,特别是开花当天(0 d)和开花后1 d(1 DPA)差异明显;在纤维起始分化的开花前3 d(-3 DPA)到开花后3 d(3 DPA),叶片和花瓣中LUC活性先升高后降低,在0和1 DPA的LUC活性最高,这一结果与GhSuSy的定量分析、蔗糖合酶活性检测结果趋于一致,同时纤维起始时期胚珠中GhSuSy的表达和蔗糖合酶活性也显著升高。这些结果暗示GhSuSy基因或编码的蔗糖合酶在0和1 DPA可能调控了棉纤维的起始和分化,表明基因枪介导的瞬时转化系统可用于进一步的GhSuSy基因启动子转录调控分析。 展开更多

关键词 棉纤维 GhSuSy基因 蔗糖合酶 基因枪瞬时表达

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农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究 被引量：8

8

作者 孙蔓莉 孟玉玲 +2 位作者 张强 黄桂艳 单卫星 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期161-165,共5页

通过探究根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的烟草瞬时表达体系的影响因素,确定烟草瞬时表达的最佳条件,为目的基因的功能研究提供技术支持。利用马铃薯晚疫病抗性基因RB和致病疫霉菌效应基因Avrblb 1作为报告基因,采用农杆... 通过探究根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的烟草瞬时表达体系的影响因素,确定烟草瞬时表达的最佳条件,为目的基因的功能研究提供技术支持。利用马铃薯晚疫病抗性基因RB和致病疫霉菌效应基因Avrblb 1作为报告基因,采用农杆菌介导的注射渗透法,摸索农杆菌菌悬液OD600值和菌系（遗传背景）、烟草品种及其生长时期等因素,确定烟草高效的基因瞬时表达条件。研究结果表明：介导烟草基因瞬时表达的根癌农杆菌菌悬液适宜OD600值为0.3～0.8;在菌悬液OD600值为0.1及以上时,AGL1、GV3101和C58C1介导的报告基因瞬时表达效率相似,均引发较强的叶片坏死反应;在农杆菌菌悬液OD600值小于0.1时,AGL1介导的瞬时表达效率最高。测试的烟草品种都具备较高的瞬时表达效率,苗龄6～8周的烟草适合分析。通过测试农杆菌菌悬液OD600值和菌系（遗传背景）、烟草品种及其生长时期等因素,确定本氏烟和普通烟均可实现基因高效瞬时表达的条件。 展开更多

关键词 烟草 基因瞬时表达 注射渗透法

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山荆子MbLRK10L1.1基因正调控腐烂病抗性 被引量：1

9

作者 鲁远 冒霞 +3 位作者 王超 孙娥 郑艳 左存武 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期552-561,共10页

此前从东北山荆子(Malus baccata)中发现可能参与腐烂病信号响应的WAK基因 MbLRK10L1.1,在此基础上,拟结合生物信息学分析、表达分析和功能验证研究其在腐烂病抗性中的作用机制。结果表明, MbLRK10L1.1响应Valsa mali(Vm)信号,并且在瞬... 此前从东北山荆子(Malus baccata)中发现可能参与腐烂病信号响应的WAK基因 MbLRK10L1.1,在此基础上,拟结合生物信息学分析、表达分析和功能验证研究其在腐烂病抗性中的作用机制。结果表明, MbLRK10L1.1响应Valsa mali(Vm)信号,并且在瞬时表达 MbLRK10L1.1后,‘烟富6号’果实表面病斑扩散速率明显减小, FRK1(Flg22-induced Receptor-like Kinase 1)、TaNOX(Triticum aestivum NADPH oxidase)、 EDS1(Enhanced disease susceptibility 1)等相关抗病基因均有不同程度的上调表达。表明 MbLRK10L1.1可通过JA、SA、SAR以及PTI等途径正调控果实对腐烂病菌的抗性。 展开更多

关键词 腐烂病(Valsa canker) WAK基因 瞬时表达标记基因

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人源化AGR2单抗在不同宿主细胞中表达的比较 被引量：1

10

作者 谢秋玲 汤杰 +2 位作者 黄嘉慧 卢加 刘晨雪璇 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第6期142-148,共7页

Anterior gradient-2(AGR2)基因是一种与肿瘤生长、转移、浸润及耐药性密切相关的基因,以AGR2为靶点的人源化单克隆抗体rhAGR2-mAb有望成为一种新型的抗肿瘤药物.本研究为了进行该抗体的成药性评价,通过瞬时转染的方法分别用HEK293F细胞... Anterior gradient-2(AGR2)基因是一种与肿瘤生长、转移、浸润及耐药性密切相关的基因,以AGR2为靶点的人源化单克隆抗体rhAGR2-mAb有望成为一种新型的抗肿瘤药物.本研究为了进行该抗体的成药性评价,通过瞬时转染的方法分别用HEK293F细胞与CHO细胞这两种最常用的表达系统表达rhAGR2-mAb,获得了纯度为95%的抗体蛋白,同时比较了不同宿主细胞生产的蛋白在分子量、等电点、糖型等方面的差异,发现在分子量、等电点和糖基化的糖型种类方面,两种宿主细胞表达的rhAGR2-mAb并无明显差异,但两者表达的产物在糖型比例上有较大不同,这也导致了两种表达系统所表达的蛋白与抗原AGR2的亲和力略有不同,为rhAGR2-mAb将来选择合适的蛋白瞬时表达系统和稳定生产系统提供依据. 展开更多

关键词 人源化 AGR2单克隆抗体 瞬时基因表达 CHO细胞 HEK细胞

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农杆菌敏感小麦基因型的筛选研究 被引量：24

11

作者 王艳丽 叶兴国 +2 位作者 刘艳鹏 杜丽璞 徐惠君 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期6-10,共5页

基因型是影响农杆菌转化植物的主要因素之一,筛选对农杆菌敏感的小麦基因型对于进一步提高小麦转化效率具有重要意义.利用c58C1农杆菌菌系(含GUS基因)感染不同小麦品种的幼穗和幼胚,共培养后进行X-Gluc组织化学染色检测,以筛选对农杆菌... 基因型是影响农杆菌转化植物的主要因素之一,筛选对农杆菌敏感的小麦基因型对于进一步提高小麦转化效率具有重要意义.利用c58C1农杆菌菌系(含GUS基因)感染不同小麦品种的幼穗和幼胚,共培养后进行X-Gluc组织化学染色检测,以筛选对农杆菌敏感的小麦基因型.结果表明,83个小麦基因型的幼穗经农杆菌感染后,GUS基因表达率66.7%～82.8%,CA9924、北农49、西农2611、京冬11等基因型对农杆菌感染比较敏感,多数基因型对农杆菌感染不敏感.80个小麦基因型的幼胚经农杆菌感染后,GUS基因表达率在10.0%以上的基因型仅占3.8%,没有GUS基因表达的基因型多达71.3%,绝大多数基因型对农杆菌感染不敏感;当幼胚与农杆菌的共培养在滤纸上进行时,97H2169、轮选208、兰考906、扬麦6号等基因型对农杆菌感染非常敏感,GUS基因表达率达到50.0%～93.3%,没有GUS基因表达的基因型下降到36.8%.表明不同小麦基因型以及相同基因型的不同外植体对农杆菌的敏感性存在着显著差异,兰考906、扬麦6号、西农2611、京冬11等基因型是农杆菌转化小麦较为理想的受体材料;滤纸上共培养方式更有利于农杆菌对小麦外植体的侵染,GUS基因表达率平均比固体培养基共培养方式高16.6个百分点. 展开更多

关键词 小麦 农杆菌 幼胚 幼穗 GUS基因瞬时表达

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甜玉米愈伤组织遗传转化条件优化研究

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作者 杨子龙 钟旎 胡建广 《广东农业科学》 CAS CSCD 2008年第S1期24-26,共3页

利用gus基因瞬时表达技术比较了根癌农杆菌和基因枪两种转化方法,在不同的条件下对甜玉米愈伤组织遗传转化率影响。结果表明,根癌农杆菌培养浓度OD_(600)值达到1.164、稀释浸染浓度OD_(600)值为0.30时,gus基因的瞬时表达率最高,为57.69... 利用gus基因瞬时表达技术比较了根癌农杆菌和基因枪两种转化方法,在不同的条件下对甜玉米愈伤组织遗传转化率影响。结果表明,根癌农杆菌培养浓度OD_(600)值达到1.164、稀释浸染浓度OD_(600)值为0.30时,gus基因的瞬时表达率最高,为57.692%;农杆菌侵染愈伤组织过程中,在真空度为-10 mMPa下处理5 min,转化率略有提高。在基因枪转化中,氦气压力与射程对转化率有较大影响,在压力为1100 psi、射程为6 cm时,gus基因的瞬时表达率最高,转化率为58.333%。 展开更多

关键词 甜玉米 根癌农杆菌 基因枪 gus基因瞬时表达

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