水牛SFRP 1基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

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作者 黄丽清 段安琴 +2 位作者 郑海英 杨春艳 尚江华 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1807-1818,共12页

【目的】获取水牛分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因CDS区序列,并预测其编码蛋白的结构功能,构建SFRP 1基因真核表达载体,检测SFRP 1基因在水牛不同组织中的表达情况,为探索SFRP 1基因在水牛生长发育中的作用奠定基础。【方法】以水牛卵... 【目的】获取水牛分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因CDS区序列,并预测其编码蛋白的结构功能,构建SFRP 1基因真核表达载体,检测SFRP 1基因在水牛不同组织中的表达情况,为探索SFRP 1基因在水牛生长发育中的作用奠定基础。【方法】以水牛卵巢组织cDNA为模板,通过RT-PCR对SFRP 1基因CDS区序列进行扩增并测序,利用生物信息学在线分析软件对水牛SFRP 1基因与不同物种进行比对和系统进化树构建,并预测SFRP1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构等。将获得的目的基因连接至pCMV-HAhyPBase-mcheery载体并转染至水牛颗粒细胞,检测转染后荧光和基因表达情况。通过实时荧光定量PCR检测水牛不同组织中SFRP 1基因表达情况。【结果】水牛SFRP 1基因CDS区长927 bp,共编码308个氨基酸。多重序列比对结果显示,水牛SFRP 1基因氨基酸序列与黄牛、牦牛、山羊、虎鲸、黑猩猩、北极狐、猫、人、小鼠的相似性分别为100%、100%、99.65%、98.58%、98.23%、98.23%、98.58%、98.23%、96.45%,存在CRD_FZ、NTR_like和DUF3367结构域。水牛SFRP 1基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、山羊、牦牛、野牛、马鹿、野骆驼、猪、人的相似性分别为97.3%、95.9%、95.8%、94.5%、94.2%、93.7%、80.4%、78.5%和77.3%。系统进化树结果显示,水牛与黄牛、牦牛、野牛聚为一支。生物信息学分析结果显示,SFRP1蛋白呈碱性,为不稳定蛋白;第1—15位氨基酸处存在信号肽,为分泌型蛋白,存在跨膜结构,主要定位于细胞外;存在21个磷酸化位点和8个O-糖基化修饰位点。二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲构成;水牛、黄牛、人的SFRP1蛋白三级结构高度相似。成功构建pCMV-mcheery-SFRP1真核表达载体并转染水牛颗粒细胞,转染72 h后pCMV-mcheery-SFRP1重组质粒组细胞内SFRP 1基因表达量极显著高于对照组(P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,SFRP 1基因在水牛不同组织中均有表达,且在脾脏中表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01)。【结论】SFRP 1基因在不同物种以及遗传进化过程中具有高保守性,在水牛不同组织中广泛表达。研究结果为今后探究SFRP 1基因在水牛生长发育中的功能及分子机制奠定基础。 展开更多

关键词 水牛 SFRP 1基因 序列分析 真核表达载体 组织表达

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先天性长QT综合征KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建 被引量：3

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作者 李伟 杨钧国 +4 位作者 杜戎 徐秋梅 管思明 柯琴梅 王斌 《医学研究生学报》 CAS 2007年第11期1126-1129,I0003,共5页

目的:克隆先天性长QT综合征KCNE1基因,并构建真核表达载体。方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出KCNE1基因;采用T-A克隆法,将KCNE1基因克隆入pCR2.1 TOPO载体中,经限制性酶切基因重组后,构建真核表达载... 目的:克隆先天性长QT综合征KCNE1基因,并构建真核表达载体。方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出KCNE1基因;采用T-A克隆法,将KCNE1基因克隆入pCR2.1 TOPO载体中,经限制性酶切基因重组后,构建真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1,经DNA测序鉴定,用E ffectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果:采用基因克隆和重组法,得到了KCNE1真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1,并在HEK293细胞中得到了表达。结论:KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建和表达为进一步的功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 长QT综合征 KCNE1基因 克隆 真核表达载体

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pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定 被引量：1

3

作者 任艳鑫 赵留芳 +4 位作者 杨洁 孙瑞梅 王虎 李晓江 隋军 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期263-266,共4页

目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pE... 目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果 PCR扩增片段、双酶切出现722bp大小的目的基因条带与预期结果相符;插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子 真核表达载体 质粒pEGFP—N1 基因疗法 CIK细胞

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水牛p21基因在卵母细胞体外成熟过程中的表达及其真核表达载体构建 被引量：1

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作者 郑海英 黄玥萌 +6 位作者 杨春艳 鄢胜飞 李孟琪 于农淇 郑威 黄加祥 尚江华 《动物医学进展》 北大核心 2018年第10期18-24,共7页

旨在检测p21基因在水牛卵母细胞体外成熟过程中的表达变化,并克隆摩拉水牛p21基因CDs序列,构建真核表达载体。收集体外成熟培养不同时期(0、6、12、24h)和不同形态[有第1极体(first polar body,PB1)PB1和无PB1]的水牛卵母细胞,通过RT-q... 旨在检测p21基因在水牛卵母细胞体外成熟过程中的表达变化,并克隆摩拉水牛p21基因CDs序列,构建真核表达载体。收集体外成熟培养不同时期(0、6、12、24h)和不同形态[有第1极体(first polar body,PB1)PB1和无PB1]的水牛卵母细胞,通过RT-qPCR检测其p21mRNA相对表达量。同时利用RTPCR技术从摩拉水牛卵巢颗粒细胞中扩增出p21基因编码序列,插入pEGFP-N1真核表达载体中,构建出重组质粒。将重组质粒pEGFP-N1-p21转染水牛颗粒细胞,并于培养24h和48h后观察转染细胞的荧光表达情况。收集转染48h后的颗粒细胞,通过RT-qPCR检测p21mRNA相对表达量。结果显示,成熟培养6h的卵母细胞p21mRNA表达量显著高于成熟培养0、12、24h的表达量(P<0.05),有PB1的卵母细胞中p21mRNA的表达量显著高于无PB1的卵母细胞(P<0.05);重组质粒pEGFP-N1-p21转染颗粒细胞后,有绿色荧光蛋白表达,且与转染pEGFP-N1和空白组相比,pEGFP-N1-p21转染组的p21mRNA表达量显著升高。结果表明,在体外成熟培养过程中均能检测到水牛卵母细胞p21mRNA表达量,成功构建了摩拉水牛p21基因真核表达载体,为下一步研究p21基因在水牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中的功能和调控奠定了基础。 展开更多

关键词 摩拉水牛 P21基因表达 颗粒细胞 pegfp-n1载体

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高原鼠兔HIF-1α基因真核表达载体的构建及细胞表达和定位 被引量：1

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作者 李红阁 赵新全 +2 位作者 常智杰 任永明 王德鹏 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第10期4386-4388,4393,共4页

利用PCR从克隆质粒PMD18-T-pHIF-1α中扩增鼠兔HIF-1α;构建重组质粒pcDNA3.0/6Xmyc-p HIF-1α,用重组质粒转染HEK-293T,HeLa和COS-7细胞,通过免疫印迹分析,检测HIF-1α表达蛋白在细胞中的分布。EcoRI和XhoⅠ酶切鉴定和序列分析表明,构... 利用PCR从克隆质粒PMD18-T-pHIF-1α中扩增鼠兔HIF-1α;构建重组质粒pcDNA3.0/6Xmyc-p HIF-1α,用重组质粒转染HEK-293T,HeLa和COS-7细胞,通过免疫印迹分析,检测HIF-1α表达蛋白在细胞中的分布。EcoRI和XhoⅠ酶切鉴定和序列分析表明,构建的pcDNA3.0/6Xmyc-pHIF-1α真核表达载体序列正确;HIF-1α在真核细胞中能够正确表达,且其表达产物主要存在于细胞核中。 展开更多

关键词 高原鼠兔 HIF-1Α基因 真核表达载体

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绵羊YAP1基因的克隆及其真核表达载体和突变型载体的构建

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作者 李达 孙伟 +6 位作者 苏锐 张占英 马月辉 张有法 陈玲 吴文忠 周洪 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1198-1204,共7页

本研究旨在克隆绵羊YAP1基因CDS序列,构建并鉴定其真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1,及其磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A。本研究利用RT-PCR技术,从湖羊背最长肌克隆YAP1基因编码区序列,T-A克隆到pMD 19-T载体中,进行测序。利用酶切和T4... 本研究旨在克隆绵羊YAP1基因CDS序列,构建并鉴定其真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1,及其磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A。本研究利用RT-PCR技术,从湖羊背最长肌克隆YAP1基因编码区序列,T-A克隆到pMD 19-T载体中,进行测序。利用酶切和T4连接酶连接方法,将YAP1基因编码区克隆到pEGFP-C 1载体中,构建pEGFP-C 1-YAP1真核表达载体,以真核表达载体为模板,构建磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A,2种载体均进行PCR、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切、BamHⅠ单酶切及测序鉴定。结果克隆出YAP1基因的全长cDNA序列,获得GenBank登录号JQ 714252,其长度为1 712bp,编码区1 212bp,编码403个氨基酸。重组质粒pEGFP-C1-YAP1经PCR、酶切、测序鉴定,证实YAP1基因CDS区已正确克隆入pEGFP-C1表达载体;经测序鉴定,YAP1第42位丝氨酸成功突变为丙氨酸。本研究成功克隆绵羊YAP1基因全长cDNA序列,并构建了重组真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1及磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1S42A,为进一步研究YAP1蛋白表达及其生物学活性奠定基础。 展开更多

关键词 绵羊 YAP1基因 真核表达载体 磷酸化位点突变体

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陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

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作者 谢婉 何剑雄 +7 位作者 夏攀洁 吴延军 焦迪 陈宝剑 关志惠 兰干球 郭亚芬 谢炳坤 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第8期2049-2056,共8页

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1,GPR1)基因真核表达载体,并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后,使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真... 试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1,GPR1)基因真核表达载体,并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后,使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFPN1-GPR1进行鉴定,并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA,实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况;提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA,实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明,陆川猪GPR1基因CDS全长1 068bp,成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体,重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光,且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实,GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组(P<0.01)。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高,在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达,在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,并获得了GPR1基因组织表达谱,为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。 展开更多

关键词 陆川猪 GPR1基因 pegfp-n1载体 表达谱

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人胰岛素样生长因子-1基因克隆及其真核表达载体的构建

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作者 牛嗣云 岳凤鸣 +2 位作者 陈志宏 高维娟 高福禄 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期646-648,共3页

目的:从胎儿肝组织中克隆人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因,并构建真核表达载体pCI-neo/hIGF-1。方法:提取胎儿肝总RNA,RT-PCR法扩增IGF-1 cDNA片段,重组于pUCM-T载体,测序正确后构建表达载体。结果:扩增得到710bp带有Kozak序列的IGF-1 ... 目的:从胎儿肝组织中克隆人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因,并构建真核表达载体pCI-neo/hIGF-1。方法:提取胎儿肝总RNA,RT-PCR法扩增IGF-1 cDNA片段,重组于pUCM-T载体,测序正确后构建表达载体。结果:扩增得到710bp带有Kozak序列的IGF-1 cDNA片段,成功构建了真核表达载体pCI-neo/hIGF-1。结论:通过RT-PCR的方法克隆了人IGF-1 cDNA,并成功构建了真核表达载体pCI-neo/hIGF-1,为IGF-1基因治疗糖尿病创造了条件。 展开更多

关键词 胰岛素样生长因子-1基因 克隆 真核表达载体

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大鼠Akt1基因真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

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作者 张睿 程颖 刘永锋 《生物医学工程与临床》 CAS 2007年第6期486-488,共3页

目的构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1，观察其在293细胞（人胚肾母细胞）中的表达。方法采用RT-PCR方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1 DNA片段，测序鉴定正确后，插入真核表达载体pDC316的EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位点，构建Akt1真核... 目的构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1，观察其在293细胞（人胚肾母细胞）中的表达。方法采用RT-PCR方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1 DNA片段，测序鉴定正确后，插入真核表达载体pDC316的EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位点，构建Akt1真核表达载体Akt—pDC316，脂质体介导法转染293细胞，36h后Western blot检测转染293细胞中Akt1的含量。结果经测序鉴定，构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞，可见55000位置有Akt1的表达。经Western blot检测，具有良好的表达浓度。结论构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分表达。 展开更多

关键词 AKT1 真核表达载体 293细胞

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人BRCA1真核表达载体的构建及鉴定

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作者 董蕾 李文才 《山东医药》 CAS 北大核心 2009年第51期25-27,共3页

目的构建人BRCA1基因真核表达载体,为BRCA1基因高表达乳腺癌细胞株的研究奠定基础。方法从胎盘中提取总RNA,设计引物,RT-PCR方法克隆BRCA1基因,以羧基端插入pcDNA3.1(+)真核表达载体中。通过DNA序列测定,菌液提取质粒,酶切鉴定插入基因... 目的构建人BRCA1基因真核表达载体,为BRCA1基因高表达乳腺癌细胞株的研究奠定基础。方法从胎盘中提取总RNA,设计引物,RT-PCR方法克隆BRCA1基因,以羧基端插入pcDNA3.1(+)真核表达载体中。通过DNA序列测定,菌液提取质粒,酶切鉴定插入基因片段的正确性。提取无内毒素质粒pcDNA3.1-BRCA1并转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,获得稳定高表达BRCA1细胞株。提取细胞总蛋白,Western blot方法鉴定BRCA1的表达。结果从人胎盘组织中成功克隆出BRCA1基因N端933个碱基。测序及提取质粒酶切鉴定证实pcD-NA3.1-BRCA1中含有插入方向、片段大小和DNA序列均正确BRCA1基因N端933个碱基序列。转染后细胞株中BRCA1表达水平明显高于转染前,P<0.01。结论成功构建了人BRCA1基因的真核表达载体。获得稳定高表达BRCA1的MDA-MB-231细胞株。 展开更多

关键词 乳腺癌 BRCA1基因 真核表达 载体

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人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

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作者 袁成福 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期612-615,共4页

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后... 目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。 展开更多

关键词 黑色素浓集激素受体(MCHR1) 真核表达载体 转染 HEK293细胞系 基因表达

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HO-1不同活性真核表达载体的构建及鉴定

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作者 高涵 周涛 +2 位作者 张春晶 李淑艳 陈宏月 《中国卫生产业》 2014年第25期79-80,共2页

目的构建含有HO-1基因的重组载体并将其稳定转染到肝癌细胞系HepG2中。方法采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1(+)载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞,获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染H... 目的构建含有HO-1基因的重组载体并将其稳定转染到肝癌细胞系HepG2中。方法采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1(+)载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞,获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染HepG2细胞系,G418筛选抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞系中HO-1基因的表达。结果成功制作了HO-1活性增高和降低的细胞模型。结论 HO-1不同活性真核表达载体的成功构建,为进一步研究HO-1的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 HO-1 真核表达载体 稳定转染

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抗mdr1 RNA干扰真核表达载体的构建

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作者 顾玲 刘霆 +3 位作者 龚玉萍 王玉芳 杨志梅 席亚明 《四川生理科学杂志》 2005年第1期6-9,共4页

目的:构建抗mdr1RNA干扰真核表达载体。方法:根据Reynolds的设计原则,针对mdr1的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgenesil-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果:... 目的:构建抗mdr1RNA干扰真核表达载体。方法:根据Reynolds的设计原则,针对mdr1的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgenesil-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果:用PstI和SalI酶切鉴定质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3均符合设计要求,测序证实序列完全正确。结论:通过酶切和测序鉴定重组质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3插入位点正确,与设计序列一致,预期可用于逆转mdr1所致耐药。 展开更多

关键词 RNA干扰 mdr1 真核表达载体 编码DNA序列 RNA序列 二级结构 设计原则 人工合成 DH5Α 大肠杆菌 碱裂解法 酶切鉴定 PstⅠ 设计要求 重组质粒 靶序列 测序 Sal 致耐药 栽体

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广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建 被引量：4

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作者 奉玲丽 张瑞门 +4 位作者 黄叶 夏攀洁 张名媛 梁晶 兰干球 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第4期977-985,共9页

本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏... 本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。 展开更多

关键词 广西巴马小型猪 MyoD1基因 肌细胞 真核表达载体

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人MCHR1真核表达载体的构建

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作者 袁成福 《湖北民族学院学报（医学版）》 2006年第4期18-20,24,共4页

目的构建人MCHR1真核表达载体。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3．1(+),酶切和测序鉴定。结果酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3．1(+)/MCHR... 目的构建人MCHR1真核表达载体。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3．1(+),酶切和测序鉴定。结果酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3．1(+)/MCHR1真核表达载体构建成功。结论pcDNA3．1(+)/ MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础。 展开更多

关键词 MCHR1 真核表达载体 人

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猪11β-HSD1真核过表达载体的构建及其在Hepa1-6细胞中的表达 被引量：1

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作者 夏吉瀚 王超群 +2 位作者 阮进学 杨述林 李奎 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第12期1-5,共5页

11β-羟类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)可使无生物活性的皮质酮催化为有活性的皮质醇,本试验利用长白猪肝脏组织提取的RNA反转录出11β-HSD1基因的cDNA,通过反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和DNA重组技术,将11β-HSD1基因构建到pcDNA3.1... 11β-羟类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)可使无生物活性的皮质酮催化为有活性的皮质醇,本试验利用长白猪肝脏组织提取的RNA反转录出11β-HSD1基因的cDNA,通过反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和DNA重组技术,将11β-HSD1基因构建到pcDNA3.1真核表达载体上,构建了11β-HSD1-pcDNA重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳和测序分析的方法对重组的质粒进行了鉴定,并将其转染了Hepa1-6细胞,通过RT-PCR检测了其过表达强度。试验结果表明,成功构建了猪11β-HSD1-pcDNA真核过表达载体,为转基因动物的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 11β-HSD1 真核表达 基因克隆 载体构建 转基因

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努比亚山羊LMCD1基因生物信息学分析、真核表达载体的构建及表达 被引量：1

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作者 邹剑伟 邹菊红 +9 位作者 申玉建 韦一 张叁保 连子童 徐建建 宋颖 黄艳娜 韦英明 蒋钦杨 郑自华 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2033-2042,共10页

【目的】扩增努比亚山羊LIM结构域基因1(LIM domain gene 1,LMCD1)并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测LMCD1基因的表达情况,为研究努比亚山羊LMCD1基因功能及探究LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的作用提供依据。【方法】从努... 【目的】扩增努比亚山羊LIM结构域基因1(LIM domain gene 1,LMCD1)并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测LMCD1基因的表达情况,为研究努比亚山羊LMCD1基因功能及探究LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的作用提供依据。【方法】从努比亚山羊背最长肌组织中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增LMCD1基因CDS区序列,并进行生物信息学分析;将LMCD1基因以同源重组的方式连接pEGFP-N1载体,经酶切、测序鉴定后重组阳性质粒命名为pEGFP-N1-LMCD1;将pEGFP-N1-LMCD1重组质粒转染至山羊骨骼肌卫星细胞,通过实时荧光定量PCR检测努比亚山羊LMCD1基因的表达情况。【结果】努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列全长1092 bp,编码363个氨基酸。LMCD1蛋白分子式为C_(1775)H_(2818)N_(508)O_(533)S_(29),分子质量为40.73 ku。努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列与山羊相似性最高(99.8%),与斑马鱼相似性最低(55.4%),与其他物种的相似性在87.0%~98.8%之间。LMCD1蛋白无信号肽,不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。通过构建努比亚山羊pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体并转染至骨骼肌卫星细胞,过表达LMCD1基因,产生绿色荧光信号。【结论】试验成功扩增LMCD1基因CDS区序列,构建了pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体,并分析了生物学功能,为后续开展LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的机制研究提供了理论基础。 展开更多

关键词 努比亚山羊 LMCD1基因 生物信息学分析 真核表达载体 表达

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杂合抗菌肽Me-HNP1真核表达载体的构建与初步表达 被引量：2

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作者 于婷 王思霁 +1 位作者 刘畅 崔敬爱 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第17期126-130,共5页

选择蜂毒肽(Melittin)和人体防御素(HNP-1)部分基因序列进行人工融合,通过生物信息学技术预测其理化性质和功能结构,依据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏爱性原则编码杂合肽Me-HNP1基因,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,P... 选择蜂毒肽(Melittin)和人体防御素(HNP-1)部分基因序列进行人工融合,通过生物信息学技术预测其理化性质和功能结构,依据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏爱性原则编码杂合肽Me-HNP1基因,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增目的基因并定向克隆至穿梭型表达载体pPICZa A上,将构建成功的分泌表达载体pPICZαA-Me-HNP1通过电转化的方式转化到毕赤酵母感受态细胞GS115内,以甲醇为诱导剂进行诱导表达,将得到的粗蛋白进行分离纯化。Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳在5 kDa处得到一条单一清晰条带,表明杂合抗菌肽Me-HNP1在毕赤酵母中成功表达,生物信息学分析得出杂合抗菌肽Me-HNP1分子内带有8个正电荷,等电点为9.55,脂溶性80.44,在酵母体内半衰期大于20 h。表明其具有成为优秀抗菌肽潜力。为抗菌肽的研究奠定了实验基础。 展开更多

关键词 杂合抗菌肽Me-HNP1 真核表达载体 毕赤酵母 表达

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重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响 被引量：1

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作者 尉春艳 张熙 +3 位作者 孙学军 彭慧霞 史玉霞 王桂贤 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期447-450,共4页

目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western b... 目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测Twist基因的表达情况;通过克隆形成实验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果 Twist基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后,Twist基因/蛋白的表达明显上调,转染组较对照组克隆形成明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的克隆形成能力。 展开更多

关键词 重组质粒 TWIST基因 卵巢癌 真核表达载体pegfp-n1 基因克隆

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hGPx-1-198Leu真核表达载体的构建与鉴定及在H9C2细胞中的表达

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作者 王素琴 牛小麟 +2 位作者 朱延河 高登峰 林琳 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期152-156,共5页

目的构建含有人GPx-1基因Pro198Leu多态的真核表达载体,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制提供依据。方法采用全基因合成的方法合成含多态位点的人GPx-1基因cDNA片段,同时在基因5′端和3′端分别引入BamHⅠ和No... 目的构建含有人GPx-1基因Pro198Leu多态的真核表达载体,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制提供依据。方法采用全基因合成的方法合成含多态位点的人GPx-1基因cDNA片段,同时在基因5′端和3′端分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,通过限制性内切酶酶切目的片段和真核表达载体pEGFPN3,再用T4DNA连接酶将含有目的基因的片段定向插入到载体pEGFP-N3真核人巨细胞病毒启动子下游。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆、提取质粒进行鉴定。将hGPx-1-198Leu真核表达载体转染HEK293细胞,观察转染效率,并采用RT-PCR检测转染重组载体后细胞中GPx-1的mRNA表达水平。重组载体转染H9C2细胞,观察补硒之后的GPx-1表达情况。结果获得目的基因cDNA片段全长869bp,PCR和测序鉴定载体中含有人GPx-1-198Leu基因cDNA。重组载体转染HEK293细胞后检测到GPx-1的mRNA水平比未转染组及空质粒转染组明显升高,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制奠定了基础。H9C2细胞在转染后GPx-1蛋白水平升高并且随着硒浓度的升高而升高。结论成功构建了含Pro198Leu多态位点的hGPx-1真核表达载体,并且也插入了保证该基因有效表达的硒代半胱氨酸插入序列。 展开更多

关键词 GPx-1基因 Pro198Leu多态 真核表达载体 转染 H9C2细胞 硒

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