九龙牦牛ELOVL3基因克隆、真核表达载体构建及组织表达谱分析

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作者 司比努尔·牙生江 者玉琦 +2 位作者 钟金城 武志娟 柴志欣 《华北农学报》 北大核心 2025年第2期201-209,共9页

极长链脂肪酸延伸酶3(ELOVL3)主要参与合成极长链脂肪酸(VLCFA),在脂肪酸代谢过程中扮演重要角色。旨为克隆九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列,构建ELOVL3基因真核表达载体,并预测分析其生物学功能,通过PCR技术扩增九龙牦牛ELOVL3基因的... 极长链脂肪酸延伸酶3(ELOVL3)主要参与合成极长链脂肪酸(VLCFA),在脂肪酸代谢过程中扮演重要角色。旨为克隆九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列,构建ELOVL3基因真核表达载体,并预测分析其生物学功能,通过PCR技术扩增九龙牦牛ELOVL3基因的CDS区序列,并通过同源重组将其插入到pcDNA3.1载体中以构建重组质粒。采用限制性酶切及PCR技术验证重组质粒,结合测序结果,利用在线预测软件分析其蛋白编码序列的生物学功能。另外,针对ELOVL3基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量,进行qPCR和Western Blot检测。结果表明:九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列全长813 bp,共编码270个氨基酸;酶切、PCR及测序鉴定,确认成功构建pcDNA3.1-ELOVL3真核表达载体。生物信息学分析结果显示,ELOVL3基因编码蛋白属于疏水性蛋白,共有6个跨膜结构域及27个磷酸化位点。系统发育树显示,与九龙牦牛亲缘关系最近的是普通牛,最远的是原鸡。此外,ELOVL3基因在九龙牦牛肺脏组织中表达量最高。 展开更多

关键词 牦牛 ELOVL3基因 基因克隆 真核表达载体构建

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牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建 被引量：1

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作者 康峰 苏广华 +3 位作者 苏建国 段彪 王子东 李光鹏 《中国牛业科学》 2011年第5期9-12,共4页

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因(Follistatin,FSTN)基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载... [目的]克隆牛的卵泡抑素基因(Follistatin,FSTN)基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结果]经酶切及PCR鉴定表明成功构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP1-FSTN。[结论]成功构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP1-FSTN,为促进肌肉生长的转基因优质肉牛品种培育奠定了基础。 展开更多

关键词 牛卵泡抑素基因 基因克隆 真核表达载体构建

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Tec真核表达载体构建及其对细胞信号的影响

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作者 李菲菲 刘雷 +5 位作者 郑红 周颖 余科科 程洁 王本忠 汪思应 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2005年第3期206-210,共5页

目的构建人Tec酪氨酸蛋白激酶真核表达载体;研究Tec参与肝细胞再生的可能信号途径。方法经PCR扩增、酶切、连接等基因重组技术将人Tec插入pCDNA3.1(hismycTec)真核表达载体中,并经酶切、PCR、测序鉴定;用脂质体法将构建的真核表达载体... 目的构建人Tec酪氨酸蛋白激酶真核表达载体;研究Tec参与肝细胞再生的可能信号途径。方法经PCR扩增、酶切、连接等基因重组技术将人Tec插入pCDNA3.1(hismycTec)真核表达载体中,并经酶切、PCR、测序鉴定;用脂质体法将构建的真核表达载体瞬时转染Hela细胞,用Western方法检测Tec蛋白是否表达。用荧光素酶报告基因系统,检测Tec是否参与HGF刺激信号途径的活化。结果构建的Tec真核表达载体使Hela细胞高表达Tec蛋白;并发现Tec在HGF介导下,对Elk信号分子活化的报告质粒中荧光素酶的表达有明显增强作用。结论构建了Tec真核表达载体,并能使HGF介导的MAPK途径活化,提示Tec可能参与HGF介导肝细胞增殖的信号调控。 展开更多

关键词 真核表达载体构建 TEC 细胞信号 Hela细胞 酪氨酸蛋白激酶 Western pcDNA3 基因重组技术 MAPK途径 信号途径 荧光素酶 肝细胞再生 PCR扩增 肝细胞增殖 HGF 瞬时转染 脂质体法 基因系统 增强作用 信号分子 信号调控 c蛋白

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内江猪γ干扰素基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建 被引量：9

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作者 黄亚平 郭万柱 李晓琪 《中国畜牧兽医》 CAS 2007年第5期60-63,共4页

将内江猪的外周血淋巴细胞在刀豆素(ConA)的刺激下培养24 h后,提取总RNA,应用一步法RT-PCR扩增γ干扰素(IFN-γ)cDNA,克隆到PMD18-T载体,命名为pMD-N-IFN-γ,测序结果证明克隆的cDNA全长603 bp,其ORF为501bp,编码166个氨基酸,与Genbank... 将内江猪的外周血淋巴细胞在刀豆素(ConA)的刺激下培养24 h后,提取总RNA,应用一步法RT-PCR扩增γ干扰素(IFN-γ)cDNA,克隆到PMD18-T载体,命名为pMD-N-IFN-γ,测序结果证明克隆的cDNA全长603 bp,其ORF为501bp,编码166个氨基酸,与Genbank公布的IFN-γ比对,核苷酸同源性在99.4%以上,从而证实成功地克隆了内江猪IFN-γ基因。以pMD-N-IFN-γ质粒为模板亚克隆完整ORF区,连接到真核表达质粒pcDNA3.1(+)的EcoRI、XhoI两位点之间,经单双酶切鉴定,成功的构建了IFN-γ真核表达载体pcDNA3.1(+)-N-IFN-γs。 展开更多

关键词 Γ干扰素 克隆 序列分析 真核表达载体构建

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抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建 被引量：1

5

作者 陈金顶 赵明秋 +2 位作者 索青利 黄青云 廖明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期164-166,170,共4页

根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物,以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板,通过RT_PCR方法获得了一大小约85bp的DNA片段,并将其克隆到pGEM_T载体上进行序列测定,测序结果显示,猪抗体信号肽基因核苷酸序列长度为57bp... 根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物,以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板,通过RT_PCR方法获得了一大小约85bp的DNA片段,并将其克隆到pGEM_T载体上进行序列测定,测序结果显示,猪抗体信号肽基因核苷酸序列长度为57bp,编码19个氨基酸,核苷酸及推导的氨基酸序列与已发表的抗体信号肽基因序列一致,同时在信号肽基因3’端下游提供可供肽酶切割的窗口和外源基因的克隆位点。然后将信号肽基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,成功构建了一含信号肽序列的真核表达载体3.1_SFc,为外源基因在pcDNA3.1(+)中的表达与分泌提供了一有效的信号肽,也为研究基因的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 抗体信号肽 基因克隆 序列测定 真核表达载体构建 蛋白质

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牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价 被引量：1

6

作者 孙修勤 郑风荣 +4 位作者 李继业 吴兴安 曲凌云 张进兴 洪旭光 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期740-745,共6页

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白（MCP）0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将... 用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白（MCP）0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用. 展开更多

关键词 淋巴囊肿病毒(LCDV) 核酸疫苗 真核表达载体构建 免疫效果

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绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测 被引量：1

7

作者 孟庆文 曹素芳 +2 位作者 李媛 金红 于康震 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 2000年第S1期44-45,共2页

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ，并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_... 拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ，并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3，以ＢａｍＨⅠ鉴定方向，以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ，经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆，荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ，并成功转染ＭＤＣＫ，在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达，并发出绿色荧光，是一良好的报告基因和筛选标记。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白 真核表达载体构建 表达检测

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活化的蛋白激酶C受体1真核表达载体的构建与鉴定

8

作者 张露萍 王海燕 +5 位作者 孙红亚 梁虹 王建军 朱永泽 盛树青 郑英 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期497-499,共3页

目的:构建活化的激酶C受体1(RACK1)WD1-4真核表达载体,通过细胞转染和Western blot鉴定其是否在细胞中表达。方法:应用PCR法扩增RACK1蛋白中第1～4个WD40区域的片段,将其与PGEM-T载体连接,测序后再将其克隆至pEGFP-N1中。采用脂质体法... 目的:构建活化的激酶C受体1(RACK1)WD1-4真核表达载体,通过细胞转染和Western blot鉴定其是否在细胞中表达。方法:应用PCR法扩增RACK1蛋白中第1～4个WD40区域的片段,将其与PGEM-T载体连接,测序后再将其克隆至pEGFP-N1中。采用脂质体法将重组质粒转染至293T细胞中,观察其在真核细胞中的表达,并用Western blot法进行鉴定。结果:pEGFP-N1-RACK1(WD1-4)重组质粒经酶切鉴定及测序证实,目的基因的序列完全正确。荧光显微镜观察发现,转染了重组质粒的细胞株可见绿色荧光融合蛋白的表达,Western blot结果进一步证实了上述结果。结论:成功构建pEGFP-N1-RACK1(WD1-4)重组质粒且进行了真核表达,为下一步研究RACK1蛋白的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 RACK1蛋白 真核表达载体构建 蛋白表达

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耐碱Mn-SOD基因克隆与真核表达载体的构建

9

作者 陈红漫 马晶 +1 位作者 訾晓男 阚国仕 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2008年第3期80-83,共4页

以高产耐碱Mn-SOD产生菌Bacillussp.110-2总DNA为模板,通过PCR扩增得到耐碱Mn-SOD基因,编码一个完整的开放阅读框,共202个氨基酸,含18个碱性氨基酸,包括12个赖氨酸和6个精氨酸。与地衣芽孢杆菌同源性为99%,与极端耐碱芽孢杆菌(Bacillus ... 以高产耐碱Mn-SOD产生菌Bacillussp.110-2总DNA为模板,通过PCR扩增得到耐碱Mn-SOD基因,编码一个完整的开放阅读框,共202个氨基酸,含18个碱性氨基酸,包括12个赖氨酸和6个精氨酸。与地衣芽孢杆菌同源性为99%,与极端耐碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)同源性为78.7%。克隆片段酶切后,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,获得毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-SOD。 展开更多

关键词 耐碱Mn—SOD 基因克隆 真核表达载体构建

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抗菌肽Defensin基因pcr3.1真核表达载体的构建

10

作者 张守纯 刘潇然 郭宇航 《湖北农业科学》 北大核心 2009年第1期39-41,共3页

通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defensin基因的哺乳动物细胞真核表达载体。把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defensin,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建... 通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defensin基因的哺乳动物细胞真核表达载体。把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defensin,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建和鉴定。结果表明,以果蝇总DNA为模板扩增出280bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除一个碱基外,其余的完全一致,译成的氨基酸序列相同。对重组质粒pcr3.1/defensin进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。所以,重组质粒pcr3.1/defensin由真核载体pcr3.1和defensin DNA片段组成。且插入的defensin DNA片段与已知序列完全相同。 展开更多

关键词 抗菌肽 defensin基因 PCR 真核表达载体构建

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胆汁酸膜受体TGR5真核表达载体的构建及在细胞中的表达 被引量：3

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作者 史琳凯 刘倩 +4 位作者 张子英 刘畅 王旭东 丁月霞 李培锋 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第5期17-22,共6页

试验旨在构建胆汁酸膜受体TGR5真核表达载体,转染293T细胞并在其中表达。用RT-PCR技术从胎盘组织中得到TGR5基因,克隆至真核表达载体pCMV-EGFP中。双酶切和测序鉴定正确后,将pCMV-EGFP-TGR5瞬时转染293T细胞,并采用实时荧光定量PCR和Wes... 试验旨在构建胆汁酸膜受体TGR5真核表达载体,转染293T细胞并在其中表达。用RT-PCR技术从胎盘组织中得到TGR5基因,克隆至真核表达载体pCMV-EGFP中。双酶切和测序鉴定正确后,将pCMV-EGFP-TGR5瞬时转染293T细胞,并采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测TGR5的表达。结果显示,本试验构建了TGR5真核表达载体pCMV-EGFP-TGR5;转染293T细胞后,荧光显微镜观察到绿色荧光表达;实时荧光定量PCR检测TGR5表达量显著增加;Western blotting结果显示有目的蛋白表达。结果表明,真核表达载体pCMV-EGFP-TGR5构建成功,转染293T细胞后在基因、蛋白水平上均表达TGR5受体。 展开更多

关键词 TGR5基因 克隆 真核表达载体构建

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金针菇免疫调节蛋白FIP-fve在毕赤酵母中的表达研究

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作者 杜婉嘉 陈香利 +3 位作者 毛雪 马银鹏 孔祥辉 林火松 《食药用菌》 2024年第3期176-181,共6页

金针菇免疫调节蛋白FIP-fve是隶属于真菌免疫调节蛋白家族的小分子功能蛋白质,在生物医学研究和功能食品应用中有重要价值,但天然蛋白产量较低。本文构建了真核表达载体pPIC9K-FIP-fve后转入毕赤酵母GS115。结果:甲醇诱导获得高效分泌... 金针菇免疫调节蛋白FIP-fve是隶属于真菌免疫调节蛋白家族的小分子功能蛋白质,在生物医学研究和功能食品应用中有重要价值,但天然蛋白产量较低。本文构建了真核表达载体pPIC9K-FIP-fve后转入毕赤酵母GS115。结果:甲醇诱导获得高效分泌表达的可溶性蛋白,表达率40%以上,经纯化,蛋白产率为121.6 mg/L。本研究为FIP-fve重组蛋白应用奠定了基础。 展开更多

关键词 金针菇免疫调节蛋白 真核重组载体构建与表达 纯化

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GPC3对肝癌细胞株MHCC97-L增殖的影响 被引量：1

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作者 秦如斋 刘斐烨 +4 位作者 陈斌 谢剑明 杨洋 郑大勇 罗荣城 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期448-452,共5页

目的通过构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,研究GPC3对人肝癌细胞株MHCC97-L增殖的影响。方法用基因重组及限制性内切酶技术构建并鉴定表达载体pEGFP-c3-GPC3,通过脂质体介导转染人肝癌细胞株MHCC-97L,流... 目的通过构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,研究GPC3对人肝癌细胞株MHCC97-L增殖的影响。方法用基因重组及限制性内切酶技术构建并鉴定表达载体pEGFP-c3-GPC3,通过脂质体介导转染人肝癌细胞株MHCC-97L,流式细胞术和G418筛选建立稳定细胞株;采用荧光定量PCR、Western blotting分别检测MHCC-97L中GPC3 mRNA和蛋白的表达情况,并在荧光显微镜下观察细胞荧光;MTT法检测GPC3对肝癌细胞MHCC97-L体外增殖能力的影响。结果经酶切及测序鉴定,确认成功构建真核表达载体pEGFP-c3-GPC3,荧光显微镜下观察到绿色荧光表达;从mRNA和蛋白水平证实,GPC3基因在转染后的MHCC-97L中成功表达;MTT生长曲线证实MHCC97-L/GPC3较其他两株细胞增殖显著加强(P<0.001)。结论成功构建pEGFR-c3-GPC3真核表达载体;筛选出稳定表达GPC3基因的MHCC97-L/GPC3细胞株;GPC3基因表达升高可促进肝癌细胞株MHCC97-L的增殖。 展开更多

关键词 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 绿色荧光蛋白 MHCC-97L 真核表达载体/构建 肝癌

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