目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经...目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。展开更多
目的:构建miR-21的真核表达载体,并使其在骨肉瘤MG63细胞中表达,为研究miR-21对骨肉瘤细胞MG63的作用打下基础。方法:根据miRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共433个碱基序列,设计PCR引物,PCR扩增,退火后用T4连接到线性化的pcDNA3.1(+...目的:构建miR-21的真核表达载体,并使其在骨肉瘤MG63细胞中表达,为研究miR-21对骨肉瘤细胞MG63的作用打下基础。方法:根据miRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共433个碱基序列,设计PCR引物,PCR扩增,退火后用T4连接到线性化的pcDNA3.1(+)质粒中,并对重组质粒进行双酶切、菌落PCR及测序分析,鉴定完全正确的重组质粒转染骨肉瘤细胞MG63,G418(400 mg/L)筛选4周获得miR-21稳定表达细胞系,用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcDNA3.1(+)-miR-21可在真核细胞中过表达。结果:成功构建了miR-21的真核表达载体,并获得稳定转染重组质粒的细胞系。结论:miR-21的真核表达载体在骨肉瘤细胞MG63中稳定高表达,为进一步研究miR-21在骨肉瘤MG63中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。展开更多
文摘目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。
文摘目的:构建miR-21的真核表达载体,并使其在骨肉瘤MG63细胞中表达,为研究miR-21对骨肉瘤细胞MG63的作用打下基础。方法:根据miRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共433个碱基序列,设计PCR引物,PCR扩增,退火后用T4连接到线性化的pcDNA3.1(+)质粒中,并对重组质粒进行双酶切、菌落PCR及测序分析,鉴定完全正确的重组质粒转染骨肉瘤细胞MG63,G418(400 mg/L)筛选4周获得miR-21稳定表达细胞系,用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcDNA3.1(+)-miR-21可在真核细胞中过表达。结果:成功构建了miR-21的真核表达载体,并获得稳定转染重组质粒的细胞系。结论:miR-21的真核表达载体在骨肉瘤细胞MG63中稳定高表达,为进一步研究miR-21在骨肉瘤MG63中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。
