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细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建 被引量:10
1
作者 丁剑冰 林仁勇 +4 位作者 温浩 王国荃 王笑峰 魏晓丽 傅玉才 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期42-44,共3页
目的 克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法 应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95... 目的 克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法 应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上 ,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果 测序表明所选 pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒 ,可以作为DNA疫苗作进一步的研究。结论 成功构建真核细胞表达载体 pcDNA3-Eg95。 展开更多
关键词 克隆 细粒棘球螺 Eg95抗原基因 真核表达质粒
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结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定 被引量:8
2
作者 蒋玉凤 钟森 +3 位作者 史小玲 王明勇 张建军 邓存良 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第5期65-68,47,共5页
目的 用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物... 目的 用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体pUCm -T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR反应产物克隆于真核表达载体 pcDNA3 1(+)上。并用脂质体介导真核表达重组质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT - 6转染真核细胞COS - 7,72h后 ,通过SDS -PAGE和免疫印迹鉴定ESAT - 6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT - 6构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT-成功 ,通过SDS -PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量 6kDa的特异蛋白 ,免疫印迹证明该 6kDa蛋白能与抗ESAT - 6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒成功构建 ,该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6。 展开更多
关键词 结核分支杆菌 ESAT-6 真核表达质粒 蛋白表达 鉴定 早期分泌性抗原靶蛋白
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人VEGF165基因真核表达质粒的构建及其对血管内皮细胞增殖的影响 被引量:6
3
作者 吴忠均 吴维伟 +2 位作者 余林 时德 郑树森 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期716-720,共5页
目的 :构建人VEGF16 5基因的真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5 ,观察其在血管内皮细胞 (VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响。方法 :用RT PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF16 5基因 ,并将其克隆至真核表达质粒pBud CE4 .1中 ,对... 目的 :构建人VEGF16 5基因的真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5 ,观察其在血管内皮细胞 (VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响。方法 :用RT PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF16 5基因 ,并将其克隆至真核表达质粒pBud CE4 .1中 ,对重组真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5进行酶切鉴定和测序。以脂质体转染法将pBudCE4 .1/VEGF16 5导入VEC中 ,用Northernblot和免疫细胞化学染色法 ,分别从mR NA水平和蛋白质水平检测它们在转染的VEC中的表达 ,并检测表达产物对VEC增殖的影响。结果 :人VEGF16 5基因的RT PCR产物为 5 76bp。测序结果显示 ,扩增的VEGF16 5基因的序列与基因文库中登录的序列完全一致。经HindⅢ和BamHI酶切鉴定证实 ,VEGF16 5基因已成功地克隆至真核表达质粒pBudCE4 .1中。以其转染血管内皮细胞 (VEC)后 ,经Northernblot杂交和免疫细胞化学染色法检测均证实VEGF16 5基因表达。表达产物对VEC增殖有明显的促进作用。结论 :所构建的pBudCE4 .1/VEGF16 5真核表达质粒可在VEC中表达 ,表达产物可明显促进VEC增殖 ,为通过VEGF16 展开更多
关键词 真核表达质粒 血管内皮生长因子165 血管内皮细胞 基因转染 器官移植
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鸡新城疫病毒F基因高效真核表达质粒的构建 被引量:7
4
作者 邓明俊 张彦明 +1 位作者 梁荣 段明星 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2003年第2期9-12,共4页
为进一步研究基因疫苗的免疫机制和基因疫苗的免疫效果 ,应用 DNA重组技术 ,根据载体 pc D-NA4 .0 / His Max的多克隆位点设计引物 ,对含有 NDV保护性抗原基因 F的质粒 PCR扩增。将得到的目的片段插入到载体的启动子下游 ,成功得到含有 ... 为进一步研究基因疫苗的免疫机制和基因疫苗的免疫效果 ,应用 DNA重组技术 ,根据载体 pc D-NA4 .0 / His Max的多克隆位点设计引物 ,对含有 NDV保护性抗原基因 F的质粒 PCR扩增。将得到的目的片段插入到载体的启动子下游 ,成功得到含有 NDV F基因的真核表达质粒载体 PC4 F的基因疫苗。 展开更多
关键词 新城疫病毒 F基因 真核表达质粒 基因疫苗 免疫机制 免疫效果
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pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP真核表达质粒构建 被引量:5
5
作者 邵喜英 陈占红 +2 位作者 曹江 方永明 王晓稼 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期189-194,共6页
目的:构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP与pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒,并观察pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒在MCF-7和Bcap-37细胞中的表达。方法:①采用RT-PCR技术扩增... 目的:构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP与pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒,并观察pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒在MCF-7和Bcap-37细胞中的表达。方法:①采用RT-PCR技术扩增CYP19 cDNA,插入pcDNA3.1(+)载体中,构建pcDNA3.1(+)-CYP19表达质粒;酶切pcDNA3.1(+)-CYP19(304bp BamHⅠ)-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19质粒,构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP表达质粒;②以pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒为模板,采用定点突变技术,构建pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP表达质粒;③pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒通过脂质体介导转染MCF-7和Bcap-37细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的表达。结果:①酶切鉴定及测序验证pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP构建成功;②测序验证pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP构建成功;③在经转染的MCF-7和Bcap-37细胞中观察到较强的绿色荧光。结论:pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒已成功构建,并证实pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒能在MCF-7和Bcap-37细胞中表达,为进一步研究CYP19基因单核苷酸多态性的确切功能奠定基础。 展开更多
关键词 细胞色素P450酶系统/遗传学 质粒 遗传载体 真核细胞 CYP19基因 真核表达质粒 GFP
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猪IL-2真核表达质粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠细胞免疫增强作用的研究 被引量:7
6
作者 陈希文 程安春 +6 位作者 汪铭书 希尼尼根 豆文波 张平英 李雪梅 王刚 刘伍梅 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期60-63,共4页
目的 :研究猪白细胞介素 2真核表达质粒 (pcDNA IL 2 )对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 :用pcDNA IL 2与PRRSVORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )共同免疫BALB/c小... 目的 :研究猪白细胞介素 2真核表达质粒 (pcDNA IL 2 )对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 :用pcDNA IL 2与PRRSVORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )共同免疫BALB/c小鼠 ,以空载质粒pcDNA为阴性对照 ,PBS为空白对照 ;采用流式细胞仪 (FACS)、淋巴细胞增殖试验(MTT法 )分别对小鼠外周血中CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数和淋巴细胞的转化功能进行了检测。结果 :pcDNA IL 2与pcDNA PRRSV ORF5共同免疫小鼠后外周血对ConA有明显的反应性 ,CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数在免疫后 7天显著超过对照组 ,共同组与单独pcDNA PRRSV ORF5组有显著差异 (P <0 0 1)。结论 :pcDNA PRRSV ORF5免疫小鼠能够诱导其机体产生良好的细胞免疫应答 ,猪pcDNA IL 2能够显著增强pcDNA PRRSV ORF5诱导小鼠细胞免疫的能力。 展开更多
关键词 猪白细胞介素2真核表达质粒 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 细胞免疫 小鼠
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pcDNA3.1(+)/caveolin-1真核表达质粒的构建及其在MCF-7乳腺癌细胞株中的表达 被引量:5
7
作者 马小斌 康华峰 +4 位作者 包兴 代志军 刁岩 闵卫利 王西京 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期16-19,共4页
目的明确正常组织和人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1的表达情况,构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1表达质粒,并鉴定其表达。方法 RT-PCR法检测9种正常人体组织及人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1基因的扩增情况;Western blotting法检测MCF-7... 目的明确正常组织和人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1的表达情况,构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1表达质粒,并鉴定其表达。方法 RT-PCR法检测9种正常人体组织及人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1基因的扩增情况;Western blotting法检测MCF-7细胞中caveolin-1蛋白的表达情况。设计克隆引物和表达引物,RT-PCR法扩增caveolin-1基因,用EcoRⅠ+XbaⅠ内切酶消化回收PCR产物和质粒pcDNA3.1(+),连接后构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒。挑选pcDNA3.1(+)/caveolin-1转染感受态细菌后的单菌落进行PCR鉴定,阳性菌落培养后提取质粒行酶切鉴定及测序鉴定。瞬时转染MCF-7细胞后Western blotting检测caveolin-1蛋白的表达情况。结果①9种正常组织中均有caveolin-1基因扩增,MCF-7细胞中无caveolin-1基因扩增且无蛋白表达;②pcD-NA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒转染MCF-7细胞后caveolin-1蛋白表达良好。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒,瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞后caveolin-1表达稳定。 展开更多
关键词 CAVEOLIN-1 真核表达质粒 真核细胞转染 乳腺癌细胞株
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新城疫病毒HN基因真核表达质粒的构建及其抗肿瘤作用的初步研究 被引量:10
8
作者 魏林 戴建新 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期515-518,共4页
目的 :构建新城疫病毒 (NDV )血凝素神经氨酸酶 (HN)基因真核表达质粒 ,并初步探索其在抗肿瘤治疗中的机制及应用价值。方法 :用 RT- PCR从 NDV中克隆 HN c DNA,并构建 HN的真核表达载体 ,转染 COS- 7细胞表达。注射至小鼠B16黑素瘤模... 目的 :构建新城疫病毒 (NDV )血凝素神经氨酸酶 (HN)基因真核表达质粒 ,并初步探索其在抗肿瘤治疗中的机制及应用价值。方法 :用 RT- PCR从 NDV中克隆 HN c DNA,并构建 HN的真核表达载体 ,转染 COS- 7细胞表达。注射至小鼠B16黑素瘤模型 ,检测其抗肿瘤作用。结果 :成功地克隆了 NDV HN c DNA,所构建的 pc DNA3- HN有良好的表达 ,动物实验显示 ,pc DNA3- HN有增强荷瘤小鼠 CTL ,NK杀伤活性的作用。结论 :NDV HN的真核表达质粒具有增强荷瘤小鼠抗肿瘤CTL ,NK细胞反应的作用。 展开更多
关键词 新城疫病毒 抗肿瘤作用 HN基因 真核表达质粒
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pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒的构建及在HePG_2细胞的表达定位 被引量:3
9
作者 黄湘 谭家余 +3 位作者 邱玉林 梁文军 周铭 李明 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期402-405,共4页
目的:构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HePG2中的表达和亚细胞定位。方法:采用PCR法从pET28b/LOC51255重组质粒中克隆得到LOC51255cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中。构建好的pDsRed... 目的:构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HePG2中的表达和亚细胞定位。方法:采用PCR法从pET28b/LOC51255重组质粒中克隆得到LOC51255cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中。构建好的pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞株HePG2,再用荧光显微镜直接观察LOC51255在其中的表达及定位情况。结果:经双酶切及DNA测序结果证实成功构建重组质粒pDsRed1-C3/LOC51255;荧光显微镜观察证实该重组质粒能在HePG2细胞中表达,且LOC51255蛋白主要定位于HePG2细胞的细胞质。结论:成功构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒,并在HePG2细胞中得到表达,同时证实LOC51255定位于HePG2细胞的胞质,为进一步研究人类LOC51255基因的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 真核表达质粒 HePG_2 LOC51255 构建 表达 亚细胞定位
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猪轮状病毒国内分离株JL94 VP7基因克隆与真核表达质粒的构建 被引量:3
10
作者 师东方 李一经 +4 位作者 范锡龙 贾永清 王君伟 刘宝全 陈淑红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期408-412,共5页
用MA10 4细胞培养增殖了轮状病毒地方分离株JL94。利用一对根据Genebank中已发表的轮状病毒VP7基因cDNA序列而设计并合成的引物 ,通过逆转录—聚合酶链反应 (RT_PCR)从JL94毒株扩增出VP7基因全长cDNA。将其插入pMD18_T载体中 ,构建了重... 用MA10 4细胞培养增殖了轮状病毒地方分离株JL94。利用一对根据Genebank中已发表的轮状病毒VP7基因cDNA序列而设计并合成的引物 ,通过逆转录—聚合酶链反应 (RT_PCR)从JL94毒株扩增出VP7基因全长cDNA。将其插入pMD18_T载体中 ,构建了重组质粒pMD18_T_JL94 /VP7,并对其进行了HindⅢ ,HindⅢ和BamHⅠ的单、双酶切初步鉴定及其核苷酸序列测定 ,证明pMD18_T_JL94 /VP7中的插入基因为轮状病毒的VP7基因。重新设计一个带有Kozak序列的上游引物 ,通过PCR扩增出带有Kozak序列的vp7基因并将其插入pMD18_T载体中构建了重组质粒pMD18_T_VP7,酶切鉴定其大小和方向后 ,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切 ,胶回收纯化后连接。经酶切和核苷酸序列检测鉴定 。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 国内分离株 基因克隆 真核表达质粒 VP7基因 RT-PCR
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变形链球菌表面蛋白pcDNA3/pacA与pcDNA3/pacP真核表达质粒的构建 被引量:6
11
作者 郭丽宏 刘天佳 陈舟 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期408-411,共4页
目的 :构建变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3 pacA与pcDNA3 pacP ,即表面蛋白氨基端与中央区T、B细胞表位的两个基因疫苗。方法 :通过PCR扩增 ,获得分别编码变形链球菌表面蛋白PAc氨基端和中央区T、B细胞表位的两个目的基因pac A和... 目的 :构建变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3 pacA与pcDNA3 pacP ,即表面蛋白氨基端与中央区T、B细胞表位的两个基因疫苗。方法 :通过PCR扩增 ,获得分别编码变形链球菌表面蛋白PAc氨基端和中央区T、B细胞表位的两个目的基因pac A和pac P。将它们与真核穿梭表达载体pcDNA3进行体外重组 ,并转化大肠杆菌XL1 Blue ,采用菌落原位杂交筛选出阳性克隆子后 ,抽提重组质粒 ,进行酶切鉴定、Southern杂交分析和DNA序列测定。结果 :真核表达质粒pcDNA3 pacA与pcDNA3 pacP构建正确 ,目的基因pac A和pac P定向插入至真核表达载体中 ,插入的相位正确 ,未改变目的基因的阅读框架。结论 :真核表达质粒pcDNA3 pacA与pcDNA3 pacP分别包含了变形链球菌表面蛋白PAc氨基端和中央区免疫显性T、B细胞表位的编码基因 ,为基因疫苗进一步研究奠定基础。 展开更多
关键词 变形链球菌 表面蛋白抗原 真核表达质粒 龋齿
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IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建 被引量:3
12
作者 许信刚 李健强 +1 位作者 王笑梅 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 2000年第S1期32-36,共5页
利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)HZ株VP2基因,并对VP2基因全序列测定,序列分析和聚类分析,同时将 VP2基因与真核表达载体 pcDNA3相连接。结果克隆到 ... 利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)HZ株VP2基因,并对VP2基因全序列测定,序列分析和聚类分析,同时将 VP2基因与真核表达载体 pcDNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列共 1356bp,分析表明HZ株与欧洲超强毒株UK661高度相似,同时将VP2基因正向插入pcDNA3的CMV启动子下游,得到了VP2基因的真核表达质粒。为IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础。 展开更多
关键词 IBDV 超强毒株 VP2 克隆 序列分析 真核表达质粒
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弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建 被引量:3
13
作者 袁仕善 吴少庭 +4 位作者 黄达娜 张仁利 高世同 林绮萍 余新炳 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第3期203-206,210,共5页
目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物 ,采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段 ,克隆至 pMD18-T载体 ;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析 ;各组阳性克... 目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物 ,采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段 ,克隆至 pMD18-T载体 ;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析 ;各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX - 4T - 2和真核表达载体 pVAX1,分别转化大肠杆菌BL2 1和JM10 9,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列 ;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达 ;将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠 ,观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段 ,各组阳性克隆的序列正确 ,并分别被亚克隆到原核表达质粒 pGEX - 4T - 2和真核表达载体pVAX1上 ,构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒 ;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白 ;真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论 以pGEX - 4T - 2和 pVAX1为载体 ,分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒。 展开更多
关键词 弓形虫 致密颗粒抗原 GRA8 原核 真核表达质粒
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传染性法氏囊病病毒上海超强毒株VP2-4-3基因真核表达质粒的构建与表达 被引量:5
14
作者 蒋静 孙建和 陆苹 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期179-182,共4页
应用Long and Accurate—PCR(LA-PCR)技术,扩增克隆了鸡传染性法氏囊病病毒上海超强毒(wIB-DV)的VP2—4—3基因。应用粘性末端连接策略,将VP2-4-3基因克隆人真核表达载体pALTER-MAX。经酶切鉴定,表明VP2-4-3基因为正向插入,位于CMV启动... 应用Long and Accurate—PCR(LA-PCR)技术,扩增克隆了鸡传染性法氏囊病病毒上海超强毒(wIB-DV)的VP2—4—3基因。应用粘性末端连接策略,将VP2-4-3基因克隆人真核表达载体pALTER-MAX。经酶切鉴定,表明VP2-4-3基因为正向插入,位于CMV启动子下游。该真核表达质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞,经特异性抗IBDV抗体的免疫荧光检测,发现在细胞内有特异蛋白表达。 展开更多
关键词 传染性法氏囊 传染性法氏囊病病毒 上海超强毒株 VP2-4-3基因 真核表达质粒 基因表达 免疫荧光检测
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弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅰ.pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒的构建及鉴定 被引量:3
15
作者 王丹静 舒衡平 +2 位作者 蔡力汀 吴翔 蒋立平 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第2期122-125,共4页
目的 构建 pcDNA3-HBsAg -GRA1真核表达质粒 ,为提高弓形虫DNA疫苗保护性做出新的探索 ,并期望“一 / +-苗两用”。方法 采用PCR分别扩增HBsAg、GRA1;经BclⅠ、EcoRⅠ双酶切HBsAg ;EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切GRA1;BamHⅠ、XhoⅠ双酶切载体 p... 目的 构建 pcDNA3-HBsAg -GRA1真核表达质粒 ,为提高弓形虫DNA疫苗保护性做出新的探索 ,并期望“一 / +-苗两用”。方法 采用PCR分别扩增HBsAg、GRA1;经BclⅠ、EcoRⅠ双酶切HBsAg ;EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切GRA1;BamHⅠ、XhoⅠ双酶切载体 pcDNA3 0 ;HBsAg、GRA1、pcDNA3 0双酶切纯化产物与T4DNA连接酶在 2 2℃连接过夜 ,用双酶切及双脱氧末端终止法测序鉴定重组质粒。结果 成功构建pcDNA3-HBsAg -GRA1真核表达质粒。结论 为进一步研究 pcD NA3-HBsAg -GRA1诱导的保护性免疫奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 乙型肝炎病毒 混合核酸疫苗 I.pcDNA3-HBsAg—GRA1 真核表达质粒 构建 鉴定
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GTF-PAc融合防龋DNA疫苗的研究(Ⅰ)携带GLU基因片段的真核表达质粒pGLU的构建 被引量:6
16
作者 贾荣 樊明文 +3 位作者 边专 张平 陈智 杜民权 《口腔医学纵横》 CSCD 2001年第1期5-8,共4页
目的 :将变形链球菌葡糖基转移酶GTF I的编码葡聚糖结合区 (GLU)的序列克隆到真核载体 pCI中 ,为构建GTF PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法 :用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒 pYNB13的GLU区序列 ;将载体 pCI和GLU扩增片段分别酶切 ... 目的 :将变形链球菌葡糖基转移酶GTF I的编码葡聚糖结合区 (GLU)的序列克隆到真核载体 pCI中 ,为构建GTF PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法 :用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒 pYNB13的GLU区序列 ;将载体 pCI和GLU扩增片段分别酶切 ,体外连接 ,构建成真核表达质粒pGLU ,酶切电泳鉴定。 结果 :PCR获得了glu目的片段 ,质粒 pGLU含有 glu目的片段。 结论 :构建出了含有gtfB基因重要抗原决定簇区的真核表达质粒 展开更多
关键词 GTF基因 DNA疫苗 GLU片段 龋齿 预防 GTF-PAC 真核表达质粒
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IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建 被引量:4
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作者 许信刚 李健强 +1 位作者 王笑梅 童光志 《西北农业大学学报》 CSCD 北大核心 2000年第5期54-60,共7页
利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356... 利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 展开更多
关键词 超强毒株 克隆 序列分析 真核表达质粒 传染性法氏囊病病毒 VP2基因
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变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA和pcDNA3/pacP在哺乳动物细胞中的表达 被引量:3
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作者 郭丽宏 刘天佳 杨锦波 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期412-414,共3页
目的 :研究变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3 pacA及pcDNA3 pacP在哺乳动物细胞中的转录及表达情况。方法 :利用脂质体介导的转染技术 ,将真核表达质粒pcDNA3 pacA及pcDNA3 pacP分别转染COS 7细胞 ,1mg·ml 1 G418加压筛选获... 目的 :研究变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3 pacA及pcDNA3 pacP在哺乳动物细胞中的转录及表达情况。方法 :利用脂质体介导的转染技术 ,将真核表达质粒pcDNA3 pacA及pcDNA3 pacP分别转染COS 7细胞 ,1mg·ml 1 G418加压筛选获取稳定转染的COS 7细胞之后 ,采用RT PCR法、LSAB法、流式细胞术及Western印迹法 ,对真核表达质粒中插入基因pac A和pac P的转录及表达产物进行检测。结果 :真核表达质粒pcDNA3 pacA及pcDNA3 pacP的插入基因在导入哺乳动物细胞后具有转录和翻译活性 ,表达的蛋白质产物可位于胞内、胞膜及胞外。结论 :构建的真核表达质粒pcDNA3 pacA和pcDNA3 pacP能在哺乳动物细胞中表达插入基因所编码的蛋白质 ,为进一步的动物实验提供了实验依据。 展开更多
关键词 变形链球菌 表面蛋白抗原 真核表达质粒 龋齿
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人tPA基因真核表达质粒载体构建及其生物学功能研究 被引量:2
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作者 吴忠均 陈地龙 +3 位作者 石正洪 李德卫 郑树森 时德 《兰州大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期34-37,共4页
构建携带组织纤溶酶原激活物(tPA)基因真核表达质粒 pcDNA3.1(+)/tPA,并研究其有无生物学活性.用 RT-PCR 法从人心脏组织中克隆 tPA 基因并将其克隆至真核表达质粒 pcDNA3.1(+)中, 对 pcDNA3.1(+)/tPA 进行酶切鉴定和测序.脂质... 构建携带组织纤溶酶原激活物(tPA)基因真核表达质粒 pcDNA3.1(+)/tPA,并研究其有无生物学活性.用 RT-PCR 法从人心脏组织中克隆 tPA 基因并将其克隆至真核表达质粒 pcDNA3.1(+)中, 对 pcDNA3.1(+)/tPA 进行酶切鉴定和测序.脂质体介导 pcDNA3.1(+)/tPA 转染血管平滑肌细胞, 分别用 Nothern Blot 和斑点印迹法从 mRNA 和蛋白质水平检测 tPA 的表达,并用纤维蛋白板法测定表达产物的生物学活性.成功克隆了人 tPA 基因并构建了 pcDNA3.1(+)/tPA 真核表达质粒, pcDNA3.1(+)/tPA 转染 VSMC 后,tPA mRNA 和蛋白质表达增加,所表达的 tPA 蛋白质具有纤溶活性. 展开更多
关键词 组织纤溶酶原激活物 真核表达质粒 平滑肌细胞
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真核表达质粒pBK-Fas的构建及转染舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑瘤效应 被引量:2
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作者 胡芳芳 陈乔尔 +2 位作者 孙麟 何志良 祖谷 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2009年第4期437-442,共6页
目的研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础。方法采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV... 目的研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础。方法采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV内,构建出重组真核表达质粒pBK-Fas,酶切鉴定并测序。脂质体法将pBK-Fas转染入Tca8113细胞,RT-PCR检测FasmRNA表达及半定量分析,琼脂糖凝胶电泳检测Fas转染细胞凋亡,流式细胞仪检测Fas蛋白表达。通过细胞生长曲线描记和软琼脂集落形成实验研究Fas基因的体外抑瘤效应。结果PCR扩增后的产物在约1008bp处出现明显的特异性条带,重组质粒pBK-Fas经酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的Fas基因片段。经检测Fas基因转染能提高FasmRNA表达水平、Fas蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数。Fas基因转染能提高Fas蛋白的表达强度,由转染前的34.01±4.76上升到转染后的55.72±7.33,差异有统计学意义(P<0.01)。Fas转染细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径。MTT法检测细胞增殖抑制率的结果显示PBK-Fas转染组Tca8113细胞的增殖抑制作用最明显,表明Fas基因转染能增加舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制率,结果与细胞生长曲线测定(计数法)结果具有一致性。软琼脂集落形成实验结果显示,与未转染细胞相比,重组质粒转染的Tca8113细胞群体倍增时间延长,克隆形成能力降低。结论Fas基因片段被成功插入真核表达载体pBK-Fas质粒的多克隆位点。Fas基因转染能有效的抑制体外培养的舌鳞癌Tca8113细胞的生长。 展开更多
关键词 舌肿瘤 鳞状细胞 转染 基因疗法 细胞凋亡Fas基因 真核表达质粒
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