双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法 被引量：66

1

作者 徐丽华 刘春雷 +4 位作者 常玉梅 梁利群 刘金亮 高国强 韩启霞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期70-75,共6页

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁... 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。 展开更多

关键词 双标准曲线法 相对定量pcr 荧光扩增曲线 试验误差分析 归一化值

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定量RT-PCR及其在植物学研究中的应用 被引量：15

2

作者 胡丹丹 顾金刚 +1 位作者 姜瑞波 董金皋 《植物营养与肥料学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期520-525,共6页

定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-... 定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-PCR)、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR)四种。目前定量RT-PCR在植物学研究中的应用越来越广泛,如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测等方面。本文综述了定量RT-PCR的原理及在植物学中的应用。 展开更多

关键词 相对定量RT—pcr 竞争性定量RT-pcr 比较定量RT-pcr 实时定量RT-pcr 植物学

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金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究 被引量：17

3

作者 周兴文 李纪元 范正琪 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2012年第1期93-99,共7页

利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的cDNA全长,命名为Cn-CHI,GenBank登录号HQ269805.1。碱基序列分析表明,Cn-CHI基因全长953bp,包含56 bp的5’非翻译区、204 bp的3... 利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的cDNA全长,命名为Cn-CHI,GenBank登录号HQ269805.1。碱基序列分析表明,Cn-CHI基因全长953bp,包含56 bp的5’非翻译区、204 bp的3’非翻译区和一个长为693 bp编码230个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列比对分析表明,Cn-CHI基因编码蛋白与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的CHI蛋白同源性都在75%以上,与山茶科山茶属茶树CHI蛋白同源性高达99%。相对荧光定量PCR分析表明,Cn-CHI基因在金花茶花蕾发育过程中呈现先急剧上升后平缓下降的趋势;在花器官的不同部位中,Cn-CHI基因表达量最高的是雌蕊,其次是雄蕊,在萼片和花瓣中的表达量较低且相差不大。 展开更多

关键词 金花茶 查尔酮异构酶基因 序列分析 相对定量pcr 表达特性

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苏尼特羊钙蛋白酶抑制蛋白基因表达规律及其与肉质的相关性研究 被引量：6

4

作者 郭月英 程海星 +4 位作者 王乐 刘树军 张静 任霆 靳烨 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期122-126,131,共6页

选取40只苏尼特羊为研究对象,采用相对定量PCR技术对不同月龄苏尼特羊背最长肌、臂三头肌、股二头肌中CAST基因的表达规律与肉质相关性进行研究,分析基因表达量与肉质指标的关联。结果表明:CAST在三个实验部位中的表达规律相同,5、6、8... 选取40只苏尼特羊为研究对象,采用相对定量PCR技术对不同月龄苏尼特羊背最长肌、臂三头肌、股二头肌中CAST基因的表达规律与肉质相关性进行研究,分析基因表达量与肉质指标的关联。结果表明:CAST在三个实验部位中的表达规律相同,5、6、8月龄有不同程度的增高,12月龄降到最低。4个月龄中,CAST基因的表达量为臂三头肌(Q)>股二头肌(H)>背最长肌(B)。5月龄时股二头肌(H)和背最长肌(B)表达量基本相同,8月龄时,臂三头肌(Q)和股二头肌(H)表达量基本相同。在8、12月龄时,臂三头肌(Q)中CAST基因的表达量显著高于背最长肌(B)。在背最长肌中,CAST基因表达量与剪切力(r=-0.449)、黄度值(r=-0.753)、p H2(r=-0.245)呈负相关;与红度值呈显著负相关(r=-0.950,p=0.050);与亮度值(r=0.171)、p H1(r=0.387)呈正相关;在股二头肌中,CAST基因表达量与剪切力(r=0.520)、黄度值(r=0.846)呈正相关;与红度值(r=-0.091)、亮度值(r=-0.193)、p H1(r=-0.446)、p H2(r=-0.446)呈负相关。在臂三头肌中,CAST基因表达量与剪切力(r=0.333)呈正相关;与红度值(r=-0.494)、黄度值(r=-0.465)、亮度值(r=-0.317)、p H1(r=-0.814)、p H2(r=-0.629)呈负相关。 展开更多

关键词 苏尼特羊 钙蛋白酶抑制蛋白基因 相对定量pcr 表达规律 肉质

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基于转录组测序的铝胁迫下甘蓝型油菜新内参基因的发掘与引物开发 被引量：6

5

作者 丁戈 黄杨 +3 位作者 陈伦林 李书宇 宋来强 熊洁 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2021年第1期1-9,共9页

为了研究甘蓝型油菜在铝胁迫条件下内参基因的稳定性,在受到主要铝毒害的根组织内发掘新内参基因,以甘蓝型油菜耐铝品种赣油杂7号和铝敏感品种蓉油18的苗期根组织为研究材料,对营养液培养的试验材料分别设置对照组(0 h)和2个时间梯度(3,... 为了研究甘蓝型油菜在铝胁迫条件下内参基因的稳定性,在受到主要铝毒害的根组织内发掘新内参基因,以甘蓝型油菜耐铝品种赣油杂7号和铝敏感品种蓉油18的苗期根组织为研究材料,对营养液培养的试验材料分别设置对照组(0 h)和2个时间梯度(3,24 h)的铝胁迫(100μmol/L AlCl_(3),pH值4.5)处理组。首先,采用有参考基因组的转录组测序技术(RNA-seq)及FPKM值差异基因表达分析,筛选出符合持家基因特征的5个候选内参基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3、UBC9)。随后,依次进行实时荧光相对定量PCR分析,扩增曲线和熔解曲线分析,LinRegPCR扩增效率分析,geNorm、NormFinder和BestKeeper基因表达稳定性分析,REST 2009相对表达量分析等分析步骤。结果表明,新设计开发的5对候选内参基因引物特异性高。从转录组测序数据中筛选出的4个候选内参基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3)的表达稳定性获得了验证。按表达稳定性的综合排名由高至低排序依次为UXS3、SAP5、ARFA1E、Actin7,其中最优组合为SAP5和UXS3。综上所述,本研究开发的候选内参基因引物特异性高,可以提高铝胁迫试验体系实时荧光相对定量PCR试验的准确性,新发掘的内参基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3),可以作为铝胁迫试验体系实时荧光相对定量PCR试验的新内参基因。 展开更多

关键词 甘蓝型油菜 内参基因 转录组测序 实时荧光相对定量pcr 表达稳定性分析 铝胁迫

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PCV2与PPV共感染猪外周血单个核细胞对其细胞凋亡相关因子表达水平的影响 被引量：2

6

作者 郭东辉 张莉娟 +5 位作者 李金磊 寇亚楠 王淑娟 陈红英 崔保安 魏战勇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期71-77,共7页

为分析猪圆环病毒2型(PCV2)与猪细小病毒(PPV)体外共感染对猪外周血单个核细胞(PBMC)细胞凋亡相关因子mRNA转录水平的影响,探讨PCV2和PPV共感染机制及宿主—病毒之间的作用关系,运用病毒滴度和相对荧光定量PCR技术,测定和分析PCV2和PPV... 为分析猪圆环病毒2型(PCV2)与猪细小病毒(PPV)体外共感染对猪外周血单个核细胞(PBMC)细胞凋亡相关因子mRNA转录水平的影响,探讨PCV2和PPV共感染机制及宿主—病毒之间的作用关系,运用病毒滴度和相对荧光定量PCR技术,测定和分析PCV2和PPV感染PBMC后PCV2、PPV的病毒滴度含量及Bcl-2、FasL、p53、Caspase-8、PBR、TNF-α等的转录时相变化。结果表明:PCV2、PPV能够感染PBMC细胞,PCV2/PPV共感染中PCV2、PPV的含量分别在24h显著最高(P<0.001);PCV2、PPV单独感染和PCV2与PPV共感染PBMC后引起Bcl-2、FasL、p53、Caspase-8、PBR、TNF-αmRNA转录水平上升;在3h时PCV2/PPV共感染组PBR、P53mRNA转录水平显著高于PCV2、PPV单感染组(P<0.05),12h时PCV2/PPV共感染组FasLmRNA转录水平显著高于PCV2、PPV单感染组(P<0.05),24h时Bcl-2、Caspase-8mRNA转录水平显著高于PCV2、PPV单感染组(P<0.05),PCV2/PPV共感染组TNF-αmRNA转录水平显著高于PPV组(P<0.05),与PCV2组差异不显著。结论:PCV2与PPV共感染引起细胞凋亡相关因子mRNA转录水平上调,加速淋巴细胞凋亡,本试验为PCV2和PPV共感染机制研究提供了理论基础和试验依据。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 猪细小病毒 猪外周血淋巴细胞 细胞凋亡因子 相对定量pcr

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鸳鸯鸭恒定链两异构体组织转录模式研究 被引量：1

7

作者 刘生杰 吴超 +1 位作者 倪庆胜 余为一 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期2034-2042,共9页

为探索鸳鸯鸭恒定链(MDIi)两种异构体MDIi-1和MDIi-2在不同组织或器官中的转录模式,建立了检测MDIi-1和MDIi-2组织转录的实时相对定量PCR方法,检测并分析了MDIi-1和MDIi-2在不同组织或器官中的转录特点。结果显示MDIi-1在法氏囊底部的... 为探索鸳鸯鸭恒定链(MDIi)两种异构体MDIi-1和MDIi-2在不同组织或器官中的转录模式,建立了检测MDIi-1和MDIi-2组织转录的实时相对定量PCR方法,检测并分析了MDIi-1和MDIi-2在不同组织或器官中的转录特点。结果显示MDIi-1在法氏囊底部的转录水平为各组织或器官中最低(设为校正器);和校正器比较,MDIi-1在脾和小肠黏膜呈最高水平转录,而法氏囊颈部、肝、肾、胸腺和血液也呈较高水平转录,其他器官均低水平转录;MDIi-2在脾、法氏囊颈部和小肠黏膜也呈超过校正器的高水平转录,胸腺、肺和肾的转录水平仅略低于校正器,其他组织或器官转录水平都远低于校正器,呈极低水平转录。同一组织或器官中MDIi-1转录水平远高于MDIi-2,但MDIi-1和MDIi-2在所有被检组织或器官中转录具有很高的相关性,相关性系数达0.850 7。MDIi-1和MDIi-2共转录于所有被检组织或器官中,每一组织或器官中MDIi-1是主要转录形式,在所有被检组织或器官中两异构体均高转录于具有免疫防御功能的器官或组织,MDIi-1和MDIi-2差异性转录的试验结果为后续两异构体功能机制和基于MDIi的基因疫苗研究提供了基础资料。 展开更多

关键词 鸳鸯鸭 恒定链 异构体 实时相对定量pcr 特异性转录

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重瓣山茶花器官发育相关基因CjAPL1的全长克隆与表达分析 被引量：6

8

作者 孙迎坤 李纪元 +2 位作者 殷恒福 范正琪 周兴文 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2013年第4期473-479,共7页

为研究A功能基因在山茶花重瓣形成过程中所发挥的功能,利用同源克隆和RACE扩增方法,从重瓣山茶花品种‘金盘荔枝’发育早期的花芽中获得了山茶花AP基因全长cDNA,命名为CjAPL1,GenBank登录号JX657332。该基因全长1 149 bp,其中,开放阅读... 为研究A功能基因在山茶花重瓣形成过程中所发挥的功能,利用同源克隆和RACE扩增方法,从重瓣山茶花品种‘金盘荔枝’发育早期的花芽中获得了山茶花AP基因全长cDNA,命名为CjAPL1,GenBank登录号JX657332。该基因全长1 149 bp,其中,开放阅读框(ORF)长度为741 bp,5’非编码区长度206 bp,3’非编码区长度202 bp。经氨基酸序列分析表明:CjAPL1基因编码一条含有246个氨基酸的蛋白质,与猕猴桃、八仙花等植物的Ap1蛋白同源性均在75%以上。Rea-time PCR结果显示,CjAPL1基因在‘金盘荔枝’不同发育时期花芽中的表达量为:花芽发育早III期>花芽发育早II期>花芽发育早I期>现蕾期,表达趋势表现为先逐渐升高而后急剧降低;花器官不同部位中的表达量为花柱最高,其次为子房和萼片,在雄蕊下部和外轮花上部中的表达量最低。这些差异表明,CjAPL1基因可能在‘金盘荔枝’重瓣花形成中发挥作用。 展开更多

关键词 山茶花 CjAPL1基因 序列分析 相对荧光定量pcr 表达

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越橘查耳酮合酶基因的克隆及表达分析 被引量：6

9

作者 李晓艳 裴嘉博 +4 位作者 张志东 吴林 刘海广 李亚东 李海燕 《东北林业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期60-65,共6页

为研究越橘花色素苷合成的分子机制,利用RT-PCR和RACE技术从越橘(Vaccinium spp.)果实中克隆了查耳酮合酶基因(CHS)的全长cDNA,命名为VcCHS,GenBank登录号为JN654702。VcCHS全长1 438 bp,包含107 bp的5'非编码区、71 bp的3'非... 为研究越橘花色素苷合成的分子机制,利用RT-PCR和RACE技术从越橘(Vaccinium spp.)果实中克隆了查耳酮合酶基因(CHS)的全长cDNA,命名为VcCHS,GenBank登录号为JN654702。VcCHS全长1 438 bp,包含107 bp的5'非编码区、71 bp的3'非编码区和1个长度为1 260 bp编码419个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白具有CHS家族普遍存在的功能活性位点:Cys(C)164、His(H)303、Asn(N)336和特征多肽序列(RLM-MYQQGCFAGGTVLR)。多重比对分析发现越橘VcCHS基因编码的氨基酸序列与葡萄(Vitis vinifera)CHS基因编码的氨基酸序列相似性达90.2%。系统进化分析表明,该序列与杜鹃花目的植物聚为一类。VcCHS基因在果实发育的整个过程均有不同程度的转录表达,花期和果实成熟期表达量较高,绿果期表达量最低。VcCHS相对表达量变化与花色素苷相对含量的变化趋势具有一致性,并均在果皮组织中达到最高。 展开更多

关键词 越橘 查耳酮合酶基因 相对荧光定量pcr

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ORFV感染羔羊后的组织定位及其病毒载量分析 被引量：1

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作者 许国洋 高广亮 +5 位作者 余远迪 牟豪 付利芝 沈克飞 白运川 杨柳 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第10期2393-2397,共5页

【目的】研究山羊传染性脓疱病毒的组织定位及病毒载量情况。【方法】选取健康断奶羔羊,通过口唇部和尾根部划线的方法接种山羊传染性脓疱病毒液,正常饲喂,观察记录其发病情况,待出现典型临床症状时,放血处死,采集不同组织,进行羊传染... 【目的】研究山羊传染性脓疱病毒的组织定位及病毒载量情况。【方法】选取健康断奶羔羊,通过口唇部和尾根部划线的方法接种山羊传染性脓疱病毒液,正常饲喂,观察记录其发病情况,待出现典型临床症状时,放血处死,采集不同组织,进行羊传染性脓疱常规PCR检测,并对阳性组织进行免疫组织化学分析;同时,利用F1L基因片段与GAPDH内参基因建立相对荧光定量PCR检测方法,测定分析阳性组织的病毒载量;制备病毒载量较高的组织病毒悬液,分析其在OFTu中的增殖情况。【结果】断奶羔羊在攻毒后10 d出现典型疱疹症状;唇部、上颚、鼻甲骨、颈前淋巴结、肠系膜淋巴结和尾根部组织经过PCR鉴定后,均扩增出大小为1023 bp的目的条带;病毒载量结果表明,山羊传染性脓疱病毒在鼻甲骨中的含量最高,其更易在鼻甲骨细胞中增殖。【结论】首次明确了山羊传染性脓疱病毒可在在患病羔羊的多个组织中定殖,且其在鼻甲骨中含量最高,为山羊传染性脓疱疫苗候选毒株的分离纯化及其致病机制的深入研究提供数据支撑。 展开更多

关键词 山羊传染性脓疱 组织定位 病毒载量 免疫组化 相对荧光定量pcr

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CMAH基因在小鼠不同组织中的转录水平分析 被引量：1

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作者 李一帆 杨娜 +4 位作者 王瑶 尹德琦 赵旭 桑晓宇 汉丽梅 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2018年第1期70-75,共6页

目的哺乳动物细胞中所含唾液酸及其衍生物主要包括N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)和脱氨神经氨酸(deaminoneuraminic acid,KDN),其中Neu5Ac可在胞苷单磷酸-N-乙... 目的哺乳动物细胞中所含唾液酸及其衍生物主要包括N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)和脱氨神经氨酸(deaminoneuraminic acid,KDN),其中Neu5Ac可在胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)的催化下合成Neu5Gc。本研究应用相对荧光定量PCR方法检测BALB/c小鼠不同组织中CMAH基因的转录水平,为进一步分析不同组织中所含Neu5Gc含量差异提供参考依据。方法在NCBI数据库中查找CMAH基因mRNA序列并设计特异引物,选择小鼠β-actin为内参基因,应用相对荧光定量PCR方法检测正常BALB/c小鼠9种组织中CMAH基因mRNA的转录情况。结果在9种不同的小鼠组织中,肝脏组织中CMAH基因mRNA转录水平最高,其分别为脾脏的2.46倍、肾脏的3.17倍、气管的5.14倍、肺脏的11.70倍、心肌的21.12倍、骨骼肌的31.37倍、小肠的66.90倍以及脑组织的1055.99倍。结论本研究确定BALB/c小鼠CMAH基因在多种组织中均有转录且差异较大。 展开更多

关键词 CMAH 唾液酸 相对荧光定量pcr BALB/C小鼠

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马A3Z3V1抑制马传染性贫血病毒早晚期反转录的鉴定

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作者 吴星亮 张泽力 +3 位作者 尹鑫 艾有为 戈曼 王晓钧 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期695-697,共3页

马A3Z3V1是宿主细胞内的一种APOBEC3免疫因子,它可以有效抑制马传染性贫血病毒(EIAV)在马宿主细胞内的复制。为鉴定马A3Z3V1分子对EIAV早晚期反转录的抑制作用,本实验根据EIAV的R/U5和gag基因序列分别设计了检测EIAV早晚期反转录产物的... 马A3Z3V1是宿主细胞内的一种APOBEC3免疫因子,它可以有效抑制马传染性贫血病毒(EIAV)在马宿主细胞内的复制。为鉴定马A3Z3V1分子对EIAV早晚期反转录的抑制作用,本实验根据EIAV的R/U5和gag基因序列分别设计了检测EIAV早晚期反转录产物的引物并建立了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,利用该方法评价免疫因子A3Z3V1对EIAV逆转录过程的影响。结果显示,在早期反转录过程中,A3Z3V1可以使EIAV的反转录产物最高减少7倍;在晚期反转录过程中,A3Z3V1可以使EIAV的反转录产物最高减少3倍。本实验结果将有助于进一步研究APOBEC3分子的抗病毒作用机制。 展开更多

关键词 马A3Z3V1 马传染性贫血病毒 相对荧光定量pcr 早晚期反转录

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