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重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达 被引量:13
1
作者 金光泽 段作营 +2 位作者 张莲芬 金坚 李华钟 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期595-601,共7页
构建编码人血清白蛋白-人白介素-2 C125A的重组表达质粒,在Pichia pastorisGS115中表达,获得具有较高IL-2活性的融合蛋白。设计并合成符合P.pastoris密码子偏好,且含有C125A突变的IL-2编码基因IL-2m,通过酶切连接方法将其与人血清白蛋白... 构建编码人血清白蛋白-人白介素-2 C125A的重组表达质粒,在Pichia pastorisGS115中表达,获得具有较高IL-2活性的融合蛋白。设计并合成符合P.pastoris密码子偏好,且含有C125A突变的IL-2编码基因IL-2m,通过酶切连接方法将其与人血清白蛋白(HSA)的编码基因连接为融合蛋白HSA-IL2m的编码基因。克隆到表达质粒pPIC9K中,电击转化P.pastorisGS115感受态细胞,获得重组P.pastorisGS115/pPHIm基因工程菌。摇瓶发酵获得分泌表达产物。结果:Western blot鉴定结果显示该融合蛋白与IL-2、HSA的抗体都能发生免疫反应。经脱盐、冻干制备的粗蛋白的IL-2生物学活性为1.51×10^(6)IU/mg。结论:在P.pastorisGS115中成功表达了具有人白介素-2生物学活性的HSA-IL2m融合蛋白。 展开更多
关键词 突变型人白介素-2 人血清蛋白 毕赤酵母 融合蛋白
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人白介素-2/人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达 被引量:6
2
作者 郭泽峰 段作营 +2 位作者 张莲芬 金坚 李华钟 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期82-86,共5页
目的:构建编码人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,在毕赤酵母(Pichiapastria)中进行表达,获得具有白介素-2(IL-2)活性的融合蛋白。方法:通过逆转录方法从人外周血单核细胞得到人IL-2的cDNA,再通过重叠PCR方法,将编码人IL-2的c... 目的:构建编码人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,在毕赤酵母(Pichiapastria)中进行表达,获得具有白介素-2(IL-2)活性的融合蛋白。方法:通过逆转录方法从人外周血单核细胞得到人IL-2的cDNA,再通过重叠PCR方法,将编码人IL-2的cDNA和编码人白蛋白的cDNA拼接起来,克隆至T载体获得含有融合基因IH的质粒pMD19/IH。用EcoRI和NotI双酶切pMD19/IH和pPIC9K两种质粒,通过琼脂糖凝胶电泳分离,试剂盒纯化,将IH片段和pPIC9K连接获得表达型pPIH的重组质粒,利用电转化方法转化毕赤酵母KM71获得重组表达质粒pPIH;CTLL-2/MTT法测定融合蛋白中人IL-2活性。结果:成功构建了人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,融合蛋白得到了较理想的表达;重组菌经甲醇诱导表达后含有融合蛋白IL-2-HSA发酵上清液表现100U/mL的生物学活性。结论:成功获得具有人IL-2生物活性的重组人白介素-2/血清白蛋白融合蛋白,该研究结果未见文献报道。 展开更多
关键词 白介素-2 人血清蛋白 毕赤酵母 融合蛋白 表达
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人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性鉴定 被引量:3
3
作者 李波 段作营 +5 位作者 张红梅 雷楗勇 陈蕴 唐瑜菁 金坚 李华钟 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期289-293,共5页
采用课题组已构建的携带人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白(rhIL-2-HSA)基因的重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115进行rhIL-2-HSA的分离纯化研究。发酵上清液经超滤浓缩、Blue Sepharose亲和层析、Octyl Sepharose疏水层析和DEAE Sepharos... 采用课题组已构建的携带人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白(rhIL-2-HSA)基因的重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115进行rhIL-2-HSA的分离纯化研究。发酵上清液经超滤浓缩、Blue Sepharose亲和层析、Octyl Sepharose疏水层析和DEAE Sepharose离子交换层析纯化获得较高纯度的目的产物,SDS-PAGE检测为单一条带。Western Blot分析结果显示,目的产物同时具有HSA和IL-2的抗原性,为HSA和IL-2的融合分子。经CTLL-2/MTT细胞增殖法测定,纯化的融合蛋白的生物学活性为1.147×107 IU/mg。 展开更多
关键词 白介素2 人血清蛋白 融合蛋白 纯化
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单克隆抗体-白介素2融合蛋白一级结构的确证
4
作者 董标 梁月琴 +1 位作者 王杰 董方霆 《分析测试学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期125-127,共3页
建立单克隆抗体-白介素2融合蛋白一级结构确证的方法。用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定单克隆抗体-白介素2融合蛋白的精确相对分子质量,毛细管等电聚焦方法测定其等电点,通过N_末端氨基酸序列的测定以及肽图分析,证实了抗体-白介素... 建立单克隆抗体-白介素2融合蛋白一级结构确证的方法。用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定单克隆抗体-白介素2融合蛋白的精确相对分子质量,毛细管等电聚焦方法测定其等电点,通过N_末端氨基酸序列的测定以及肽图分析,证实了抗体-白介素2融合蛋白一级结构表达的正确性,同时为单克隆抗体-白介素2融合蛋白的质量标准研究奠定了基础。 展开更多
关键词 单克隆抗体-白介素2融合蛋白 结构确证 基质辅助激光解吸飞行时间质谱 肽图 毛细管等电聚焦
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白介素-6、基质金属蛋白酶-2在早期胚胎发育中的作用 被引量:10
5
作者 崔世红 赵岚岚 +6 位作者 蔡一鸣 杨培峰 张林东 韩笑 刘博 陶贝贝 于海洋 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2014年第6期905-908,共4页
目的:探讨白介素-6(IL-6)及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在胚胎发育中的可能作用。方法:对30例不明原因胚胎停止发育病例(研究组)和30例正常早孕吸宫流产病例(对照组)的绒毛组织及血清进行研究。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应技术(R... 目的:探讨白介素-6(IL-6)及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在胚胎发育中的可能作用。方法:对30例不明原因胚胎停止发育病例(研究组)和30例正常早孕吸宫流产病例(对照组)的绒毛组织及血清进行研究。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应技术(Real time-PCR)和免疫组织化学技术(SP法)检测两组绒毛组织中IL-6和MMP-2 mRNA的表达和蛋白定位、表达强度;采用双抗体酶联免疫夹心法(ELISA法)测定IL-6在两组血清中的浓度。结果:绒毛组织中,IL-6与MMP-2在合体及绒毛滋养层细胞中均有表达,Real time-PCR及免疫组化结果均显示IL-6在研究组中的表达水平低于对照组,MMP-2在研究组中的表达水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);IL-6在血清中的表达水平组间无统计学差异(P>0.05)。结论:孕早期绒毛组织中IL-6和MMP-2的正常表达对维持早期胚胎发育起到一定作用。 展开更多
关键词 白介素-6 基质金属蛋白2 免疫耐受 胚胎停育
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人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达
6
作者 卢慧惠 彭林 +3 位作者 段作营 蔡燕飞 金坚 李华钟 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期456-460,共5页
白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用,常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病,但因其体内半衰期短而限制了其临床应用。文中构建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chines... 白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用,常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病,但因其体内半衰期短而限制了其临床应用。文中构建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中,利用p MH3质粒所携带的neo基因进行筛选,经96孔板培养并筛选得到稳定表达目的蛋白质的重组细胞,融合蛋白HSA-IL-2表达量达到2.26 mg/L。利用反转录PCR和Western blot对重组细胞鉴定后发现,融合蛋白编码基因整合入重组CHO细胞基因组中,而且融合蛋白同时具有HSA和IL-2双重免疫原性。利用对IL-2具有依赖性的CTLL-2细胞进行活性分析后发现,筛选得到的表达细胞分泌得到的融合蛋白具有较高的生物活性,表明成功构建具有表达IL-2生物活性能力的CHO细胞。 展开更多
关键词 白介素-2 人血清蛋白 融合蛋白 中国仓鼠卵巢细胞
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雾化吸入重组人干扰素α2b对小儿呼吸道合胞病毒毛细支气管炎的疗效及其对患儿血清肺表面活性蛋白D、转化生长因子-β和白介素-4水平的影响 被引量:17
7
作者 何茹 王丽 王静 《中国医学前沿杂志(电子版)》 2020年第5期118-121,共4页
目的探讨雾化吸入重组人干扰素α2b(recombinant human interferon alpha2b,rhINF-α2b)对小儿呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)毛细支气管炎的疗效及其对患儿血清肺表面活性蛋白D(pulmonary surfactant protein D,SP-D... 目的探讨雾化吸入重组人干扰素α2b(recombinant human interferon alpha2b,rhINF-α2b)对小儿呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)毛细支气管炎的疗效及其对患儿血清肺表面活性蛋白D(pulmonary surfactant protein D,SP-D)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)水平的影响。方法选取2017年6月至2018年8月襄阳市中心医院收治的167例RSV毛细支气管炎患儿为研究对象,按照随机数字表法将其分为观察组(84例)和对照组(83例),对照组患儿采用常规治疗,观察组患儿在常规治疗基础上加用雾化吸入rhINF-α2b治疗。比较两组患儿治疗前后血清TGF-β、SP-D、IL-4水平和治疗后喘息改善时间、退热时间、疗效及不良反应发生率。结果观察组患儿治疗有效率显著高于对照组(P<0.05);治疗后,两组患儿血清TGF-β水平均显著高于本组治疗前(均P<0.01),血清SP-D、IL-4水平均显著低于本组治疗前(均P<0.01),且观察组患儿血清TGF-β水平显著高于对照组(P<0.01),血清SP-D、IL-4水平均显著低于对照组(均P<0.01);观察组患儿喘息改善时间和退热时间均显著短于对照组(均P<0.01)。两组患儿不良反应发生率比较差异无统计学意义(χ^2=0.194,P=0.660)。结论雾化吸入rhINF-α2b治疗RSV毛细支气管炎效果较好,其能有效降低患儿血清SP-D、IL-4水平,并升高TGF-β水平,具有一定的临床应用价值。 展开更多
关键词 重组人干扰素Α2B 呼吸道合胞病毒 肺表面活性蛋白D 转化生长因子-Β 毛细支气管炎 白介素-4
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重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性 被引量:6
8
作者 胡志明 林来兴妹 +2 位作者 周明乾 陈泽洪 王小宁 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第3期206-207,214,共3页
目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具... 目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性回收率为80%。结论此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。 展开更多
关键词 重组人细胞介素-2 绿脓杆菌外毒素 融合蛋白 纯化 复性
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重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白体外活性评价方法研究 被引量:5
9
作者 杨晓璐 闫若潜 +4 位作者 李勤楠 赵雪丽 谢彩华 刘梅芬 张书阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第12期3153-3159,共7页
为建立稳定、便捷的重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白(rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白,重组融合蛋白)体外活性评价方法,本研究分别采用ChIFN-α和ChIL-2ELISA方法检测重组融合蛋白与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应... 为建立稳定、便捷的重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白(rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白,重组融合蛋白)体外活性评价方法,本研究分别采用ChIFN-α和ChIL-2ELISA方法检测重组融合蛋白与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性;采用细胞病变抑制法检测重组融合蛋白在DF1细胞上抑制水疱性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)增殖活性;采用MTS法分别测定重组融合蛋白促鸡外周血T淋巴细胞(PBLC)和脾淋巴细胞增殖活性。结果表明,重组融合蛋白可以与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应;重组融合蛋白在DF1细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV活性高于抗IBDV活性,且均明显高于rChIFN-α蛋白对照;不同浓度的重组融合蛋白均具有明显的促鸡PBLC和脾淋巴细胞增殖活性,且其促增殖活性明显高于rChIFN-α蛋白对照。本研究成功建立了重组融合蛋白体外活性检测评价方法,为进一步探究重组融合蛋白在鸡体内协同作用奠定基础。 展开更多
关键词 鸡α干扰素 细胞介素-2 重组融合蛋白 体外活性
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重组人白细胞介素-2/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究 被引量:3
10
作者 林来兴妹 周明乾 +4 位作者 陈泽洪 胡志明 刘菁 黄树琪 王小宁 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第4期245-247,共3页
目的 研究重组人白细胞介素-2/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条 件。方法 常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经 DEAE-Sepharose FF离子交换... 目的 研究重组人白细胞介素-2/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条 件。方法 常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经 DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋 白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论 此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。 展开更多
关键词 细胞介素-2 粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子 融合蛋白 包涵体 纯化 复性
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重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白对鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响研究 被引量:4
11
作者 杨晓璐 闫若潜 +6 位作者 吴志明 刘梅芬 张代宝 张书阳 王淑娟 赵雪丽 刘毅 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第11期175-178,共4页
为了研究重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白(rChIFN-α-Linker-ChIL-2,重组融合蛋白)对SPF鸡外周血T淋巴细胞亚群含量影响,本研究采用流式细胞术对重组融合蛋白(第2组)和rChIFN-α蛋白(第3组)注射14日龄SPF鸡后不同时间对各试... 为了研究重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白(rChIFN-α-Linker-ChIL-2,重组融合蛋白)对SPF鸡外周血T淋巴细胞亚群含量影响,本研究采用流式细胞术对重组融合蛋白(第2组)和rChIFN-α蛋白(第3组)注射14日龄SPF鸡后不同时间对各试验组鸡外周血T淋巴细胞(PBLC)中CD3^+CD4^+、CD3^+CD8^+百分含量以及CD4^+/CD8^+比值进行检测。结果表明,与对照组相比,重组融合蛋白和rChIFN-α蛋白在鸡体内接种后3~14d均可明显提高鸡外周血T淋巴细胞中CD3^+CD4^+细胞百分含量,降低CD3^+CD8^+细胞的百分含量,提高CD4^+/CD8^+比值;接种后3~7d期间,第2组鸡的CD3^+CD4^+、CD3^+CD8^+细胞含量及CD4^+/CD8^+比值与PBS对照组(第1组)相比差异均极显著(P〈0.01),第3组与第1组相比差异均显著(P〈0.05)。以上结果表明,重组融合蛋白和rChIFN-α蛋白接种鸡体后均可显著影响鸡PBLC中淋巴细胞亚群百分含量,提高CD4^+/CD8^+比值,增强机体的细胞免疫功能;重组融合蛋白对鸡淋巴细胞亚群百分含量、CD4^+/CD8^+比值影响程度和细胞免疫功能的增强作用优于rChIFN-α蛋白;重组融合蛋白在体内发挥了鸡α干扰素和白细胞介素-2对细胞免疫功能的协同增强作用。 展开更多
关键词 重组鸡α干扰素/细胞介素-2融合蛋白 重组鸡α干扰素蛋白 T淋巴细胞亚群 CD4^+/CD8^+比值 免疫功能
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腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊白细胞介素-2融合基因在PAK/2pfs细胞中的表达与鉴定
12
作者 刘艳环 郑皓 +1 位作者 苗利光 王克坚 《特产研究》 2004年第4期5-7,共3页
将前期工作中筛选出的含有腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊白细胞介素-2(Pilin-IL-2)融合基因表达载体的PAK/2pfs工程菌[1]接种于营养肉汤,40℃培养16~18h,离心,向上清液中加入饱和(NH4)2SO4提取Pilin-IL-2融合基因表达蛋白。用羊抗兔... 将前期工作中筛选出的含有腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊白细胞介素-2(Pilin-IL-2)融合基因表达载体的PAK/2pfs工程菌[1]接种于营养肉汤,40℃培养16~18h,离心,向上清液中加入饱和(NH4)2SO4提取Pilin-IL-2融合基因表达蛋白。用羊抗兔E型节瘤拟杆菌抗血清与提取的融合蛋白进行对流免疫电泳,证明该融合蛋白具有特异性,且有较高的表达量。经SDS-PAGE电泳和Westernblot确证其为Pilin-IL-2融合蛋白。 展开更多
关键词 融合基因 IL-2 细胞介素-2 纤毛 融合蛋白 表达 杆菌 腐蹄病 绵羊 对流免疫电泳
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重组人血清白蛋白-干扰素α-2b 融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒活性评价 被引量:9
13
作者 张伟 代晓朋 +5 位作者 王鲁燕 武福军 祁碧玉 刘志敏 李军锋 周育森 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期550-555,共6页
目的检测重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法构建含1.6倍HBV基因组及绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP-HBV),感染人肝细胞系HepG2细胞,构建HBV复制细胞模型;ELISA法检测HBV乙肝病... 目的检测重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法构建含1.6倍HBV基因组及绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP-HBV),感染人肝细胞系HepG2细胞,构建HBV复制细胞模型;ELISA法检测HBV乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)表达;MTT法检测HSA-IFNα-2b对HepG2细胞的毒性作用;定量PCR法检测细胞内HBV RNA的相对表达以及细胞上清中HBV DNA绝对表达水平;双报告基因法检测HSA-IFNα-2b对HBV增强子Ⅰ活性的影响。结果 AdGFP-HBV感染HepG2细胞后可以复制表达HBV。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1加入AdGFP-HBV感染的HepG2细胞,使HBsAg表达降低51.32%(P<0.01),HBeAg降低50.26%(P<0.01),而相同浓度的HSA-IFNα-2b并不抑制细胞的增殖。随HSA-IFNα-2b浓度增加,其对HBsAg表达的抑制作用逐渐升高,HSA-IFNα-2b对HBsAg表达的抑制率(Y)与其浓度(X)的回归方程是Y=21.11 lgX+11.91(r2=0.954),IC50为63.76 kU·L-1。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使细胞中HBV RNA下降52.83%(P<0.01),培养上清中HBV DNA降低53.07%(P<0.01)。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使HBV增强子Ⅰ活性下降40.04%(P<0.01)。结论构建了可用于药物评价的HBV复制细胞模型,HSA-IFNα-2b体外具有抗HBV活性。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 血清蛋白 干扰素Α-2B 融合蛋白 乙型肝炎病毒增强子Ⅰ
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双抗体夹心ELISA定量检测IL-2-HSA融合蛋白 被引量:4
14
作者 张红梅 李波 +3 位作者 段作营 雷楗勇 金坚 李华钟 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期175-179,共5页
以抗人IL-2多克隆抗体为包被抗体,以IL-2-HSA融合蛋白为夹心抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定完整的IL-2-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法。包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度分别为为2... 以抗人IL-2多克隆抗体为包被抗体,以IL-2-HSA融合蛋白为夹心抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定完整的IL-2-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法。包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度分别为为2μg/mL和0.5μg/mL,方法的线性检测范围39.06~1250ng/mL,标准曲线回归方程为y=0.4429x-1.1433,r=0.9966,灵敏度可达10.25ng/mL,批内、批间变异系数分别为6.40%和7.81%,发酵上清液中回收率为98.13%~102.94%,与IL-2、HSA基本无交叉反应,健全性分析表明发酵液及小鼠血清组分及稀释倍数对该方法无影响。该方法可用于该融合蛋白的发酵过程优化、分离纯化工艺、后期药动学、临床研究等的定量检测。 展开更多
关键词 双抗体夹心ELISA 定量分析 融合蛋白 白介素2-人血清蛋白
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线粒体融合蛋白-2基因增强人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯的敏感性 被引量:3
15
作者 邱梅清 佟仲生 +2 位作者 贾勇圣 刘晓东 陈悦 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期37-42,共6页
目的:探讨线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2,Mfn-2)基因表达对人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯敏感性的影响。方法:Real-time PCR检测不同乳腺癌细胞系(T47D、MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435及HCC38)中Mfn-2 mRNA的表达。LipofectamineTM200... 目的:探讨线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2,Mfn-2)基因表达对人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯敏感性的影响。方法:Real-time PCR检测不同乳腺癌细胞系(T47D、MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435及HCC38)中Mfn-2 mRNA的表达。LipofectamineTM2000体外转染pEGFP和pEGFP-Mfn-2质粒至人乳腺癌T47D细胞,real-time PCR和Western blotting检测T47D细胞中Mfn-2 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测T47D细胞的增殖,流式细胞术检测T47D细胞凋亡率及线粒体膜电位。结果:与正常乳腺细胞相比,Mfn-2 mRNA在乳腺癌HCC38细胞系中高表达,在T47D等其他细胞系中均低表达。pEGFP-Mfn-2转染48 h后,T47D细胞中Mfn-2 mRNA和蛋白的表达均明显上调。与pEGFP转染组相比,pEGFP-Mfn-2转染组T47D细胞在小白菊内酯(0.05 mol/L)作用下的存活率明显降低[(47.93±2.21)%vs(56.93±2.05)%,P<0.05]。流式细胞术检测结果显示:50 mmol/L小白菊内酯作用下,pEGFP-Mfn-2转染组与pEGFP转染组相比,T47D细胞凋亡率升高[(71.2±2.1)%vs(38.8±2.6)%,P<0.05],而线粒体膜电位明显降低[(1.6±0.1)%vs(5.0±0.5)%,P<0.05]。结论:pEGFP-Mfn-2转染可增强T47D细胞对小白菊内酯的敏感性。 展开更多
关键词 乳腺癌 T47D细胞 线粒体融合蛋白-2 菊内酯 敏感性
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hIL-2/mGM-CSF融合蛋白的构建及表达 被引量:3
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作者 夏荣 林来兴妹 +4 位作者 周宏伟 周明乾 陈泽洪 胡志明 王小宁 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第10期534-537,共4页
目的 :构建hIL 2 /mGM CSF原核表达载体 ,获得具有hIL 2和mGM CSF活性的hIL 2 /mGM CSF融合蛋白。方法 :利用PCR重叠延伸术 ,将人白细胞介素 2 (hIL 2 )和鼠粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子 (mGM CSF)基因 ,通过 2个脯氨酸 (Pro)基因的中... 目的 :构建hIL 2 /mGM CSF原核表达载体 ,获得具有hIL 2和mGM CSF活性的hIL 2 /mGM CSF融合蛋白。方法 :利用PCR重叠延伸术 ,将人白细胞介素 2 (hIL 2 )和鼠粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子 (mGM CSF)基因 ,通过 2个脯氨酸 (Pro)基因的中间接头连接起来 ,扩增出hIL 2 /mGM CSF融合基因 ,并克隆于表达载体pBV2 2 0和pLY4中。结果 :获得序列正确的hIL 2 /mGM CSF融合基因 ,并在大肠杆菌中成功表达 ,表达率在 2 0 %左右。活性测定其hIL 2活性为 4 5×10 5U/mg ,mGM CSF活性为 3 85× 10 6U/mg。结论 :获得了具有hIL 2和mGM CSF活性的hIL 2 /mGM CSF融合蛋白 ,为研究hIL 2 /mGM CSF融合蛋白的新生物学功能奠定基础。 展开更多
关键词 细胞介素-2 鼠粒细胞 巨细胞集落刺激因子 细胞因子 融合蛋白 大肠杆菌
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人MD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达 被引量:3
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作者 徐发良 顾长国 +1 位作者 胡承香 李磊 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期206-208,共3页
构建人髓样分化蛋白 2 (humanmyeloiddifferentiatonprotein 2 ,hMD 2 )与谷胱甘肽巯基转移酶 ( glutathione S transferase,GST)的融合蛋白(hMD 2 /GST)表达载体PGEX 4T 1/hMD 2 ,在大肠杆菌中融合表达hMD 2 /GST。以真核表达载体PEF B... 构建人髓样分化蛋白 2 (humanmyeloiddifferentiatonprotein 2 ,hMD 2 )与谷胱甘肽巯基转移酶 ( glutathione S transferase,GST)的融合蛋白(hMD 2 /GST)表达载体PGEX 4T 1/hMD 2 ,在大肠杆菌中融合表达hMD 2 /GST。以真核表达载体PEF BOS/hMD 2为模板 ,用PCR法在MD 2编码序列上下游引入酶切位点和终止密码子 ;将hMD 2编码序列克隆入原核表达载体PGEX 4T 1的相应酶切位点 ;用PCR和酶切筛选、鉴定重组质粒PGEX 4T 1/hMD 2 ,并对插入基因片断测序 ;重组质粒PGEX 4T 1/hMD 2转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导后用SDS PAGE分析表达产物。结果PCR、酶切鉴定和序列测定证实MD 2编码序列正向插入原核表达载体PGEX 4T 1的相应酶切位点 ,片断与PCR扩增产物大小相同、序列无误、阅读框架正确 ;SDS PAGE证实hMD 2 /GST在大肠杆菌中表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 3 0 %。说明成功构建了PGEX 4T 1/hMD 2载体 ,hMD 2 /GST融合蛋白在大肠杆菌中得到初步表达 ,为MD 展开更多
关键词 重组融合蛋白 谷胱甘肽巯基转移酶 人髓样分化蛋白-2 遗传载体
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酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白--泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定 被引量:3
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作者 陈碧 骆艳婷 +1 位作者 刘新光 梁念慈 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期826-832,共7页
蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α... 蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因(UBA52)的cDNA序列有高度同源性(100%).GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用.本实验证明,人泛素-52氨基酸(UBA52)融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白,它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中. 展开更多
关键词 蛋白激酶CK2α′ 酵母双杂交系统 睾丸 人泛素-52氨基酸融合蛋白(UBA52) GST pull-down
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白介素-6与肥胖及2型糖尿病 被引量:8
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作者 张龙江 林汉华 王宏伟 《临床儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期332-334,共3页
关键词 2型糖尿病 白介素-6 胰岛素抵抗 流行病学研究 脂肪细胞分泌 IL-6 T2DM 心血管疾病 内分泌功能 TNF-α 蛋白质分子 社会问题 肝脏疾病 细胞因子 IL-8 进展综述 全球性 肥胖症 发生率 CRP 脂联素 抵抗素
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新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化 被引量:1
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作者 关海容 孙玉英 +6 位作者 袁志宏 张惠丽 梁飞 刘楠 郭斯启 习彩霞 奚永志 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2006年第1期123-127,共5页
为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结... 为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明,在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈,结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性,从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中,由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多,极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是,PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10,可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸,这十分有利于通过Ni-NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性,经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线,用于纯化分离B7-2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95%以上,总回收率为8%。Western-blot实验显示,所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT生物活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用,而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论:建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线,所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。 展开更多
关键词 重组外毒素融合蛋白 B7-2-PE40KDEL 蛋白纯化 靶向杀伤 生物活性
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