病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测方法的建立

1

作者 肇慧君 胡强 +2 位作者 于灵 吴斌 易佳颖 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期111-120,共10页

为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性... 为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至105倍数时,数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。利用构建的数字PCR方法,对收集到的国内及进境鱼类样品共计1210批次进行病毒性出血性败血症病毒检测,结果显示,数字PCR阳性样本检出率为9.5%,常规实时荧光定量RT-PCR阳性样本检出率为7.69%~7.77%。临床试验结果表明,研究建立的病毒性出血性败血症病毒数字PCR方法较常规技术具有更高的检测灵敏性,适用于水生动物疫病精准检测的需求。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 数字PCR 实时荧光定量RT-PCR 水产品

在线阅读 下载PDF 职称材料

应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV) 被引量：10

2

作者 倪穗 余晓巍 +3 位作者 王建平 雷爱莹 曾地刚 吴雄飞 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期489-493,共5页

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化。结果表明... 参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化。结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带。巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致。该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA。初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 巢式逆转录聚合酶链反应 检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

病毒性出血性败血症病毒RNA标准物质的研制 被引量：4

3

作者 刘志玲 陈茹 +5 位作者 朱道中 吴晓薇 林志雄 田纯见 罗琼 段燕喻 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2018年第3期15-19,共5页

利用基因克隆和体外转录技术制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)核酸检测标准物质。设计VHSV N基因的克隆引物,RT-PCR获得相应片段,连接至pGEM-T载体,测序后采用体外转录方法制备RNA纯品。初步定量稀释后,混合分装作为核酸标准物质候选... 利用基因克隆和体外转录技术制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)核酸检测标准物质。设计VHSV N基因的克隆引物,RT-PCR获得相应片段,连接至pGEM-T载体,测序后采用体外转录方法制备RNA纯品。初步定量稀释后,混合分装作为核酸标准物质候选物。采用核酸浓度测定与拷贝数换算的方法对转录的RNA片段进行定值。通过绘制荧光定量标准扩增曲线计算标准物质含量(拷贝数),并根据委托单位的定值结果进行不确定度的估算。均一性结果显示瓶间差异小于5%,稳定性试验表明室温20℃~25℃(相对湿度20%~25%)7 d,2℃~8℃保存1个月及-20℃保存6个月的含量均无明显变化。核酸标准物质定值为(6.625±0.149)×10~8copies/μL,可用作VHSV核酸检测的标准质控品。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症 实时定量RT-PCR 标准物质

在线阅读 下载PDF 职称材料

病毒性出血性败血症的传入风险分析 被引量：4

4

作者 孙涛 张利峰 +3 位作者 邓明俊 王群 郑小龙 岳志芹 《中国动物检疫》 CAS 2016年第11期31-36,共6页

迄今为止我国还未有病毒性出血性败血症(VHS)暴发的报道。VHS一旦随进口贸易传入,将给我国的水产养殖造成很大的经济损失。为评估病毒性出血性败血症病毒(VHSV)传入的风险,对导致病毒传入的可能因素进行了风险分析,并提出了相应的风险... 迄今为止我国还未有病毒性出血性败血症(VHS)暴发的报道。VHS一旦随进口贸易传入,将给我国的水产养殖造成很大的经济损失。为评估病毒性出血性败血症病毒(VHSV)传入的风险,对导致病毒传入的可能因素进行了风险分析,并提出了相应的风险管理措施。风险分析结果显示:活的敏感动物(包括亲鱼、鱼卵和鱼苗)、冰冻和冰鲜的敏感鱼类和用做鲜活饵料的鱼类(野杂鱼)传入VHSV的风险较高,应禁止从疫区进口;敏感鱼类的鱼肉(除掉头和内脏的部分)、敏感鱼加工后的产品、其它非敏感鱼类传入VHSV的风险较低,可以自由贸易;通过运输活鱼的水、包装、运输工具和用具传入VHSV的风险不明,需要对其强制进行常规消毒。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症 传入风险分析 风险因素 风险管理

在线阅读 下载PDF 职称材料

病毒性出血性败血症病毒(VHSV)实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立 被引量：5

5

作者 陈进会 陈文 +6 位作者 黄伟 李红梅 石磊 邱杨 刘建丽 叶蕾 唐大运 《中国动物检疫》 CAS 2013年第5期42-46,共5页

根据VHSV的较为保守的glyG基因,设计了三套LAMP引物,筛选出扩增效率最优的第二套引物VHSV-2,引入其环引物以加快其反应。采用ESE-Quant tube scanner(德国QIAGEN公司)恒温实时荧光反应及检测平台,反应温度为63℃,恒温下30min内可得出结... 根据VHSV的较为保守的glyG基因,设计了三套LAMP引物,筛选出扩增效率最优的第二套引物VHSV-2,引入其环引物以加快其反应。采用ESE-Quant tube scanner(德国QIAGEN公司)恒温实时荧光反应及检测平台,反应温度为63℃,恒温下30min内可得出结果。同时评价VHSV引物的灵敏度和特异性,灵敏度结果显示其检测限可达到4.5pg每反应,与几种重要的病原RNA均无交叉反应。本文建立的检测VHSV的RT-LAMP检测方法简单、易操作,同时具有较高的灵敏度和特异性。本研究建立的实时荧光RT-LAMP检测方法可作为VHSV的快速诊断工具,适合VHSV的现场快速检测和大规模监控。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 恒温实时荧光 环介导等温扩增

在线阅读 下载PDF 职称材料

病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体的制备及其特性分析 被引量：6

6

作者 景宏丽 王静波 +1 位作者 曹欢 林祥梅 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期400-402,406,共4页

目的制备抗病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的单克隆抗体(mAb)。方法以差速离心法提纯VHSV作为免疫原,免疫BALB/c小鼠。应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,间接ELISA进行筛选检测,且对mAb进行特性分析。结果制备出1株抗VHSV mAb,命名为4A5... 目的制备抗病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的单克隆抗体(mAb)。方法以差速离心法提纯VHSV作为免疫原,免疫BALB/c小鼠。应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,间接ELISA进行筛选检测,且对mAb进行特性分析。结果制备出1株抗VHSV mAb,命名为4A5。对其进行特性分析结果显示该抗体腹水效价104以上;属于IgG3型,κ链;仅与VHSV本身反应,与其他病毒和细胞均不发生交叉反应;对应的抗原位点在VHSV蛋白的相对分子质量(Mr)70 000的条带处,该蛋白带是VHSV的G蛋白。结论制备出的特异性好的抗VHSV mAb,为该病毒的快速诊断及流行病学监测提供了检测试剂。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒(VHSV) 间接ELISA 单克隆抗体

在线阅读 下载PDF 职称材料

病毒性出血性败血症病毒N基因的病毒样颗粒制备及定值 被引量：2

7

作者 王群 姜帆 +4 位作者 岳志芹 孙涛 郑小龙 张晓文 房保海 《中国动物检疫》 CAS 2018年第1期100-103,共4页

为制备含有病毒性出血性败血症病毒(VHSV)N基因的RNA病毒样颗粒标准样品,通过RT-RCR扩增VHSV的N基因,将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS_2his载体中,构建重组原核表达载体pNHMS_2his-N;将重组质粒pNH-MS_2his-N转化至表达菌株BL21(DE3),... 为制备含有病毒性出血性败血症病毒(VHSV)N基因的RNA病毒样颗粒标准样品,通过RT-RCR扩增VHSV的N基因,将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS_2his载体中,构建重组原核表达载体pNHMS_2his-N;将重组质粒pNH-MS_2his-N转化至表达菌株BL21(DE3),用1 mmol/L IPTG诱导表达、纯化;对病毒样颗粒进行鉴定及稳定性试验,使用数字PCR对病毒样颗粒进行定值。结果显示,该病毒样颗粒含VHSV N基因序列,并且稳定性良好,定值结果为8×10~6 copies/m L。结果表明,构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 病毒样颗粒 N基因 数字PCR

在线阅读 下载PDF 职称材料

鱼类病毒性出血性败血症病毒核蛋白基因的原核表达 被引量：1

8

作者 杜娟 兰文升 +2 位作者 刘荭 郑晓聪 陈孝煊 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期376-380,共5页

通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定... 通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 221bp核蛋白基因片段,诱导表达重组质粒pET28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导5h蛋白表达量最高,获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致,约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后,将沉淀和上清分别用于SDS-PAGE电泳,结果表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。表达蛋白经过复性、纯化,得到了较高纯度的可溶性蛋白。经Western-blot检测表明,该表达产物能被羊抗VHSV阳性血清特异性识别。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 核蛋白 基因克隆 原核表达 可溶性蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

鱼类病毒性出血性败血症病毒诊断胶体金免疫层析方法的建立 被引量：2

9

作者 孙涛 高瑞刚 +3 位作者 孙明君 王群 雷质文 岳志芹 《中国动物检疫》 CAS 2017年第12期92-97,共6页

为建立一种快速检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以标记纯化的VHSV G蛋白单克隆抗体(MAb)10A7为捕捉抗体,将纯化的抗VHSV ... 为建立一种快速检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以标记纯化的VHSV G蛋白单克隆抗体(MAb)10A7为捕捉抗体,将纯化的抗VHSV N蛋白的MAb 10EN单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带,经试验条件优化,组装形成胶体金免疫层析试纸条。用本试验研制的胶体金试纸条检测VHSV感染的CHSE细胞培养物。结果显示:在检测线和质控线均呈现红色条带,而健康的CHSE细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的病毒量最低限为10^(4.0) TCID_(50);随机挑取3个不同批次的试纸条,对阳性样品和阴性样品进行重复试验,未发现差异。特异性试验表明,该试纸条与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)无交叉反应。将同一批次的试纸条在4℃条件下保存不同时间后进行检测,发现保存6个月的试纸条仍具有良好的稳定性。本试验研发的胶体金诊断试纸条具有良好的特异性、灵敏性和重复性,在快速辅助检测方面具有推广应用价值。 展开更多

关键词 鱼病毒性出血性败血症病毒 胶体金 免疫层析法

在线阅读 下载PDF 职称材料

病毒性出血性败血症病毒夹心ELISA检测方法的建立

10

作者 丁超 曹洁 +3 位作者 周毅 王凤芝 段宏安 徐晔 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期560-563,共4页

为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的夹心ELISA方法,本研究以VHSV单克隆抗体(MAb)IP5B11为捕捉抗体,兔抗VHSV多抗为检测抗体,经反应条件优化建立了VHSV夹心ELISA检测方法。结果表明,该方法与几种常见鱼病病毒无交叉反应,具有较好的特... 为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的夹心ELISA方法,本研究以VHSV单克隆抗体(MAb)IP5B11为捕捉抗体,兔抗VHSV多抗为检测抗体,经反应条件优化建立了VHSV夹心ELISA检测方法。结果表明,该方法与几种常见鱼病病毒无交叉反应,具有较好的特异性;该方法组内和组间变异系数平均值分别为0.046和0.064,重复性良好。采用夹心ELISA和RT-PCR同时检测添加VHSV病毒悬液的40份鳗鱼组织匀浆和未添加病毒的40份阴性对照鳗鱼以及5份星斑川鲽模拟组织样品,结果两种方法检测符合率为100%。本研究建立的夹心ELISA方法可以用于出入境鱼类疫病的检测和国内养殖场的疫情监控。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 夹心ELISA 检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

荧光环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)技术在病毒性出血性败血症(VHS)诊断中的应用 被引量：10

11

作者 安元龙 吴斌 +1 位作者 林长军 肇慧君 《中国动物检疫》 CAS 2012年第12期23-25,38,共4页

运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统,以LAMP法荧光检测为基础,建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。根据对VHSV病毒N基因序列的分析,针对病毒的高保守区域的6个特异性序列,设计了3对特异性引物... 运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统,以LAMP法荧光检测为基础,建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。根据对VHSV病毒N基因序列的分析,针对病毒的高保守区域的6个特异性序列,设计了3对特异性引物,同时加入dsDNA混合染料,对核酸扩增过程进行实时荧光监控。该方法的特异性良好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。敏感度高,检测限为20fgRNA模板。实验结果表明该方法是一种操作简单、快速高效、高特异性高灵敏度的病毒检测方法。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 荧光逆转录LAMP法 诊断

在线阅读 下载PDF 职称材料

病毒性出血性败血症病毒液相芯片检测技术的建立 被引量：3

12

作者 尹伟力 梁君妮 +3 位作者 林超 张四化 岳志芹 刘荭 《中国动物检疫》 CAS 2015年第6期64-68,共5页

为建立检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中VHSV的G基因进行序列分析,设计VHSV特异性引物并标记生物素。探针氨基化修饰并与荧光编码微球偶联后与VHSV RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片仪... 为建立检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中VHSV的G基因进行序列分析,设计VHSV特异性引物并标记生物素。探针氨基化修饰并与荧光编码微球偶联后与VHSV RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。结果表明液相芯片检测体系能够正确检出VHSV。病毒核酸的最低检出量为10pg,检测特异性高,说明初步建立了检测VHSV的液相芯片技术,为VHSV的检测提供了新方法。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒(VHS) 液相芯片 检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

病毒性出血性败血症病毒焦磷酸测序检测技术的建立 被引量：1

13

作者 尹伟力 刘瑶 +3 位作者 黄微 张四化 岳志芹 孙涛 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期564-568,共5页

为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)焦磷酸测序检测技术,本研究通过对VHSV靶基因特异性序列的同源性分析,设计出适合焦磷酸测序特异性扩增和测序的引物,对焦磷酸测序反应体系和反应程序进行优化,建立了VHSV焦磷酸测序检测方法。结果表... 为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)焦磷酸测序检测技术,本研究通过对VHSV靶基因特异性序列的同源性分析,设计出适合焦磷酸测序特异性扩增和测序的引物,对焦磷酸测序反应体系和反应程序进行优化,建立了VHSV焦磷酸测序检测方法。结果表明,该方法仅对目的病毒基因扩增,而对其它病毒检测为阴性,表明该方法特异性好;该方法最低检出核酸量为82拷贝/μL,灵敏度高。选取国内采集与进口的鱼类样本共计1924批次进行VHSV检测,结果显示,焦磷酸测序检测方法检测结果与常规RT-PCR一致,该方法的特异性和灵敏度可以满足水生动物疫病检测的需要。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 焦磷酸测序 检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

长毛兔病毒性出血性败血症的诊断与具体防治

14

作者 董榕 《中国动物保健》 2021年第11期51-52,共2页

兔瘟病全称为兔病毒性出血性败血症,属于急性接触性传染性疾病,其病原为兔病毒性出血症病毒,该病传染性极强、传播速度极快,危害性极大,死亡率较高,严重危害兔子健康生长,降低养殖效益,影响兔养殖业的稳定发展,因此积极做好诊治工作显... 兔瘟病全称为兔病毒性出血性败血症,属于急性接触性传染性疾病,其病原为兔病毒性出血症病毒,该病传染性极强、传播速度极快,危害性极大,死亡率较高,严重危害兔子健康生长,降低养殖效益,影响兔养殖业的稳定发展,因此积极做好诊治工作显得至关重要。基于此,本文着重对长毛兔兔病毒性出血性败血症的诊断及防治方法进行了深入探讨分析。 展开更多

关键词 长毛兔 病毒性出血性败血症 诊断 治疗 预防 研究

在线阅读 下载PDF 职称材料

PCR-DHPLC检测方法在病毒性出血性败血病诊断中的应用 被引量：1

15

作者 吴斌 苏立明 +2 位作者 肇慧君 蔡晓萍 关鹏 《水产养殖》 CAS 2018年第7期34-38,共5页

运用RT-PCR与变性高效液相色谱技术(DHPLC)相结合,建立了对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)快速检测方法,根据对VHSV病毒N基因保守序列的分析,设计一对特异性引物,将RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。同时运用荧光RT-PCR方... 运用RT-PCR与变性高效液相色谱技术(DHPLC)相结合,建立了对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)快速检测方法,根据对VHSV病毒N基因保守序列的分析,设计一对特异性引物,将RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。同时运用荧光RT-PCR方法进行平行检测。结果表明,该方法与荧光RT-PCR检测结果相同,其特异性强,灵敏度较高,检测限为3 pg的病毒核酸模板,PCR-DHPLC技术具有高通量、自动化程度高等优势,是一种快速有效的检测方法。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 PCR-DHPLC法 实时荧光PCR 诊断

在线阅读 下载PDF 职称材料

病毒性出血性败血病PCR-DHPLC检测技术的研究

16

作者 吴斌 苏立明 +1 位作者 赵娜 张琼 《当代农机》 2022年第2期66-68,共3页

运用RT-PCR与变性高效液相色谱技术相结合,建立了对病毒性出血性败血症病毒快速检测方法,根据对VHSV病毒N基因保守序列的分析,设计一对特异性引物,将RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。同时运用荧光RT-PCR方法进行平行检测。

关键词 病毒性出血性败血症病毒 DHPLC 实时荧光PCR 检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于环介导等温扩增微流控芯片技术检测4种鱼类病毒方法的建立

17

作者 任向阳 丁宁 +7 位作者 苗子毅 黄献培 潘一峰 柏建山 黎浩权 袁建文 陈进会 张险朋 《广东海洋大学学报》 北大核心 2025年第5期106-112,共7页

【目的】建立适合鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)和病毒性出血性败血症病毒(VHSV)联合检测的环介导等温扩增(LAMP)微流控芯片检测体系,为4种鱼类病毒等温快速联检提供技术支撑。【方法】根据病毒SVCV、... 【目的】建立适合鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)和病毒性出血性败血症病毒(VHSV)联合检测的环介导等温扩增(LAMP)微流控芯片检测体系,为4种鱼类病毒等温快速联检提供技术支撑。【方法】根据病毒SVCV、KHV、NNV和VHSV各自保守基因设计LAMP引物,预包埋LAMP引物至微流控芯片,注入等温扩增反应试剂,通过电浸润法将反应试剂驱动至各反应位点,复溶预包埋的LAMP引物,在各反应位点进行等温扩增反应。分析该检测体系的特异性、灵敏性和重复性验证,并应用于实际样品检测。【结果】本研究建立的LAMP微流控芯片检测体系对SVCV、KHV、NNV和VHSV阳性样品均出现特异性扩增反应,且不同病毒间未出现交叉反应;对鱼类易感的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、大口黑鲈虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、本尼登虫(Benedenia girellae)和刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)等8种常见病原体阳性样品均无特异性扩增反应。灵敏度实验结果表明,对SVCV、VHSV的检测限均为10 fg/μL,对KHV、NNV的检测限均为1 fg/μL。重复性实验结果表明,4种病毒的变异系数均<5%。该检测体系与实时荧光PCR方法相比,对20份实际样品的检测结果均保持一致。【结论】本研究建立的LAMP微流控芯片检测体系于63℃等温扩增30 min即可完成对SVCV、KHV、NNV和VHSV的同时检测,且特异性好、灵敏度高、重复性好,可为鱼类SVCV、KHV、NNV和VHSV等温快速联检提供技术支撑。 展开更多

关键词 环介导等温扩增微流控芯片技术 鲤春病毒血症病毒 锦鲤疱疹病毒 神经坏死病毒 病毒性出血性败血症病毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

200例败血症病原菌分布特征及耐药性分析 被引量：1

18

作者 张燕 李从荣 《中国全科医学》 CAS 北大核心 2017年第A01期52-55,共4页

目的探究我院200例败血症患者病原菌的种类及构成比,并通过耐药性分析探究主要菌种的耐药率,为败血症的临床诊断与治疗提供理论依据。方法选择2014年2月—2017年2月于武汉大学人民治疗的200例败血症患者,所有患者均进行血液标本采集,通... 目的探究我院200例败血症患者病原菌的种类及构成比,并通过耐药性分析探究主要菌种的耐药率,为败血症的临床诊断与治疗提供理论依据。方法选择2014年2月—2017年2月于武汉大学人民治疗的200例败血症患者,所有患者均进行血液标本采集,通过BD9120全自动血培养仪进行细菌分离培养,观察病原菌种类及构成比等分布特征。采用美国BD全自动微生物鉴定药敏分析系统进行耐药性分析,分别检测革兰阳性菌以及革兰阴性菌主要菌种对一般抗菌药物的耐药性。结果 200例败血症患者的血液标本中总检出病原菌220株,其中革兰阴性菌所占比例最大,共143株(占65.00%);其中排名前4位分别为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及阴沟杆菌,所占比例分别为18.18%(40/220)、17.27%(38/220)、6.36%(14/220)、5.45%(12/220)。革兰阳性菌65株(29.55%);其中排名前3位分别为凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌以及肠球菌属,所占比例分别为17.73%(39/220)、5.45%(12/220)、4.55%(10/220)。真菌12株(占5.45%)。革兰阴性菌中大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶检出率为68.42%(26/38)、肺炎克雷伯菌为22.50%(9/40),革兰阳性菌中金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药株比例为25.00%(3/12)、凝固酶阴性葡萄球菌为82.05%(32/39);败血症患者血液内革兰阴性菌、革兰阴性菌主要菌株对常用抗菌药物均表现出不同程度的耐药性,分别对亚胺培南、万古霉素敏感性最高。结论感染败血症患者病原菌以革兰阴性菌为主,其次为革兰阳性菌,真菌感染所占比例极小,耐药性分析分析情况不容乐观,对常用抗菌药物均表现出不同程度的耐药性,临床上需要根据病原菌分布特征及耐药性分析结果使用合理的抗生素治疗,同时要避免抗生素的不规范使用。 展开更多

关键词 出血性败血症 病毒性 病原菌分布特征 耐药性分析

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于RPA和CRISPR/Cas12a技术构建的VHSV快速检测方法

19

作者 王洪升 唐小千 +3 位作者 绳秀珍 邢婧 迟恒 战文斌 《中国海洋大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第7期19-27,共9页

病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)是一种对冷水鱼类具有高致死率的弹状病毒,在世界范围内广泛流行,严重危害水产养殖业安全和水生生物多样性。为了实现该病的便捷、快速、灵敏诊断,本文基于RPA和CRISPR... 病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)是一种对冷水鱼类具有高致死率的弹状病毒,在世界范围内广泛流行,严重危害水产养殖业安全和水生生物多样性。为了实现该病的便捷、快速、灵敏诊断,本文基于RPA和CRISPR/Cas技术,通过RPA引物和crRNA筛选及检测体系优化,结合侧向流层析技术与荧光显色法,构建了VHSV的快速检测体系。研究表明,RT-RPA在39℃下反应30 min可获得最佳扩增效果,通过CRISPR/Cas12a与侧向流层析技术的结合使用可在50 min内完成病毒样本的检测,检测结果可通过肉眼直接判断。该检测方法的检测限为9 copies/μL,与同属的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和牙鲆弹状病毒(HIRRV)之间无交叉反应,表现出较高的灵敏度与特异性。临床样本检测结果显示,本方法与RT-PCR检测结果一致,均表现出较高的准确性与稳定性。本研究构建了一种VHSV的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法,为VHSV的便捷、快速诊断提供了重要的技术支撑。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 重组酶聚合酶扩增 CRISPR/Cas12a 便捷诊断 快速检测 牙鲆

在线阅读 下载PDF 职称材料

Taqman MGB探针快速定量检测VHSV方法的研究 被引量：6

20

作者 许建明 张念之 +2 位作者 蒋一男 张利峰 夏春 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第2期208-213,共6页

为建立准确实时地定量检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV),在VHSV-N基因保守区设计了Taqman MGB探针与引物对,随后,采用体外转录技术获得了VHSV-N基因RNA,并以此为绝对定量标准品,建立了绝对定量(AQ)检测VHSV的实时荧光RT-PCR法(AQ-RT-PC... 为建立准确实时地定量检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV),在VHSV-N基因保守区设计了Taqman MGB探针与引物对,随后,采用体外转录技术获得了VHSV-N基因RNA,并以此为绝对定量标准品,建立了绝对定量(AQ)检测VHSV的实时荧光RT-PCR法(AQ-RT-PCR方法),并与世界动物卫生组织(OIE)推荐的普通RT-PCR法进行了比较。此荧光RT-PCR法特异性好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。检测线性范围为10^(10)～10~2拷贝/反应,灵法度达10~2拷贝/反应。此检测灵敏度比OIE推举的RT-PCR法高出5个数量级,比嵌套RT-PCR高出1个数量级。此法是出入境检疫VHSV的有效方法。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒(VHSV) TAQMAN MGB探针 荧光RT—PCR法 定量检测

在线阅读 下载PDF 职称材料