H9N2亚型禽流感病毒多拷贝M2e蛋白单克隆抗体的制备

1

作者 张民秀 谢芝勋 +5 位作者 李孟 罗思思 谢志勤 谢丽基 李丹 阮志华 《中国家禽》 北大核心 2024年第11期45-51,共7页

为制备H9N2亚型禽流感病毒(AIV)多拷贝M2e蛋白单克隆抗体,试验将纯化的3M2e重组蛋白免疫BALB/c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞株;将获得的杂交瘤细胞株腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水;... 为制备H9N2亚型禽流感病毒(AIV)多拷贝M2e蛋白单克隆抗体,试验将纯化的3M2e重组蛋白免疫BALB/c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞株;将获得的杂交瘤细胞株腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水;采用间接ELISA测定腹水效价,鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒检测单克隆抗体腹水,三株单克隆抗体重链亚型均为IgG1;Westernblot鉴定单克隆抗体的特异性;使用IFA鉴定3M2e蛋白在Sf9细胞的表达和检测H9N2亚型AIV在MDCK细胞的感染。结果显示:获得了3株分泌多拷贝M2e抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4C7-B11、4E10-A10和5A12-B5;获得腹水的效价均为1∶1000000;三株单克隆抗体重链亚型均为IgG1;Westernblot鉴定三株单克隆抗体均能与2M2e、3M2e和4M2e原核重组蛋白及在Sf9细胞表达的3M2e发生特异性反应;IFA鉴定结果也显示三株单克隆抗体均能检测3M2e蛋白在Sf9细胞的表达,并且能检测到H9N2亚型AIV在MDCK细胞上的感染,出现特异性的绿色荧光;三株单克隆抗体重链亚型均为IgG1。研究获得了H9N2亚型AIV多拷贝M2e单克隆抗体,可用于Westernblot和IFA鉴定,为靶向M2e蛋白H9N2亚型禽流感疫苗的研究提供特异性的检测工具。 展开更多

关键词 禽流感病毒 m2e蛋白 蛋白表达 单克隆抗体

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抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：8

2

作者 李永清 杨敬 +1 位作者 张莉 韦莉 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期475-478,共4页

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2和GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能... 目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2和GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株。mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测mAb的特性。结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3和5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1∶4。抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2F8和5G6为IgG2b。抗原捕获ELISA表明,2F8 mAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应。IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合。结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8 mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂。 展开更多

关键词 禽流感病毒 m2蛋白 单克隆抗体

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禽流感病毒M2蛋白跨膜区基因的缺失 被引量：9

3

作者 李永清 姚四新 +1 位作者 韦莉 杨汉春 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2004年第5期6-9,共4页

根据禽流感病毒 (AIV ) A/ Chicken/ Korea/ MS96 / 96 (H9N2 )株的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过 RT- PCR,从AIV H9N1株感染的 MDCK细胞总 RNA中扩增出 2 94 bp的 AIV全长的 M2基因。通过软件分析其序列中的跨膜区后 ,将其与p GEM-... 根据禽流感病毒 (AIV ) A/ Chicken/ Korea/ MS96 / 96 (H9N2 )株的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过 RT- PCR,从AIV H9N1株感染的 MDCK细胞总 RNA中扩增出 2 94 bp的 AIV全长的 M2基因。通过软件分析其序列中的跨膜区后 ,将其与p GEM- T easy载体连接产物 p GEM- T/ M2为模板 ,通过 PCR扩增出约 90 bp左右 M2的膜外区编码序列和约 16 0 bp左右 M2的胞内区编码序列。将两个扩增产物同时作为模板 ,以 OE- PCR(overlap extension- PCR)扩增出约 2 5 0 bp的缺失跨膜区的 M2基因M2 d。测序结果表明 ,M2 d的序列除在跨膜区以 4个甘氨酸序列替代外 ,其余部分与 M2完全一致 ,由此说明 OE- PCR扩增法成功地将禽流感病毒 展开更多

关键词 禽流感病毒 m2蛋白 跨膜区 基因缺失 OE—PCR

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禽流感病毒M2蛋白的原核表达及免疫原性研究 被引量：4

4

作者 吴仁蔚 毕丁仁 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第8期9-12,共4页

基质蛋白M2是流感病毒的3种表面抗原之一,也是流感病毒中最为保守的蛋白之一,被认为是具有交叉保护能力的流感疫苗的理想候选抗原。论文从H9N2亚型禽流感病毒感染的狗肾传代(madindarby canine kidney,MDCK)细胞中克隆全长M2基因,并采用... 基质蛋白M2是流感病毒的3种表面抗原之一,也是流感病毒中最为保守的蛋白之一,被认为是具有交叉保护能力的流感疫苗的理想候选抗原。论文从H9N2亚型禽流感病毒感染的狗肾传代(madindarby canine kidney,MDCK)细胞中克隆全长M2基因,并采用OE-PCR(overlap extension,PCR)得到缺失跨膜区的M2基因(sM2)。将sM2基因克隆到pGEX-KG原核表达载体,在大肠埃希菌中获得表达量较高的融合蛋白GST-sM2,而且以可溶形式存在。利用亲和层析的方法纯化蛋白,经Western blot证明,GST-sM2蛋白具有良好的免疫原性。ELISA检测发现GST-sM2能与H9、H5和H7亚型禽流感病毒抗体均发生反应。进一步将纯化蛋白与佐剂混合后免疫Balb/c鼠,结果在免疫小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体,为开发具有交叉保护力的禽流感疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 禽流感病毒 m2蛋白 原核表达

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A型流感病毒M2蛋白研究进展 被引量：4

5

作者 万春和 刘明 《动物医学进展》 CSCD 2007年第7期56-60,共5页

M2蛋白是A型流感病毒所特有的一种结构保守的非糖基化的跨膜蛋白,主要在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境,在表面血凝素糖蛋白合成过程中作为质子通道调节高尔基体跨膜转移通道的pH。其核苷酸序列高度保守,几乎不发生变异。其25位~43... M2蛋白是A型流感病毒所特有的一种结构保守的非糖基化的跨膜蛋白,主要在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境,在表面血凝素糖蛋白合成过程中作为质子通道调节高尔基体跨膜转移通道的pH。其核苷酸序列高度保守,几乎不发生变异。其25位~43位氨基酸多肽是金刚烷胺类抗流感病毒药物的作用靶位,氨基酸极小变异都可能导致流感病毒抗药性的产生。M2蛋白胞外区域的氨基酸残基多肽（M2e）的特异性抗体可以在感染流感病毒的动物血清中检测出来,将M2e与相关佐剂联合使用可极大的提高机体对流感病毒的免疫力,在病毒感染中起重要作用,是一种潜在的交叉保护性抗原,常被用来探索具有广谱性和持久性的流感＂通用疫苗＂。 展开更多

关键词 A型流感病毒 m2蛋白 疫苗

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H9N2亚型禽流感病毒M2e蛋白在原核系统中的表达 被引量：1

6

作者 张民秀 谢芝勋 +6 位作者 黄莉 谢志勤 刘加波 谢丽基 邓显文 罗思思 黄娇玲 《动物医学进展》 北大核心 2017年第4期7-12,共6页

以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板,经PCR扩增得到M2e基因;利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系,构建顺次连接的多拷贝体M2e,并连接入原核表达载体pGEX-6p-1,构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组... 以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板,经PCR扩增得到M2e基因;利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系,构建顺次连接的多拷贝体M2e,并连接入原核表达载体pGEX-6p-1,构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组质粒,并转化至表达宿主菌中;将测序正确的菌液经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,对蛋白进行可溶性分析;利用Western blot分析5种重组蛋白的反应原性。结果显示,在37℃下,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.25、0.25、0.5、0.25、0.75mmol/L的IPTG诱导4h时,表达量最高;2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白大小分别为31.7、37.2、42.7、48.2、53.9ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,5种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blot分析显示,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2epGEX重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体具有良好的特异性反应,为后期进一步获得高免疫原性蛋白和筛选具有通用免疫原性的重组蛋白奠定基础。 展开更多

关键词 H9N2亚型禽流感病毒 m2蛋白胞外区(m2e)蛋白 重组蛋白

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SYNPO2蛋白在狂犬病病毒复制过程中的功能初探 被引量：1

7

作者 王姝捷 谢鑫 +4 位作者 张曦 陈明 雷桃红 邓俊杰 许运斌 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期154-160,共7页

目的探明SYNPO2蛋白对狂犬病病毒复制的影响。方法通过免疫印迹分析病毒感染后SYNPO2蛋白的差异表达情况;构建SYNPO2基因真核表达载体和shRNA干扰载体,转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,免疫印迹分析过表达或干扰SYNPO2对病毒蛋白表达的影... 目的探明SYNPO2蛋白对狂犬病病毒复制的影响。方法通过免疫印迹分析病毒感染后SYNPO2蛋白的差异表达情况;构建SYNPO2基因真核表达载体和shRNA干扰载体,转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,免疫印迹分析过表达或干扰SYNPO2对病毒蛋白表达的影响,荧光定量PCR分析过表达或干扰SYNPO2对病毒基因组复制和转录水平的影响,病毒滴度测定分析过表达或干扰SYNPO2对感染性病毒粒子释放能力的影响;SYNPO2真核表达载体转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,或与构建成功的病毒M基因真核表达载体共转染SK-N-SH细胞,间接免疫荧光实验结合激光共聚焦拍照技术分析SYNPO2与M蛋白在病毒感染或真核表达细胞中的亚细胞定位情况。结果狂犬病病毒感染可诱导SYNPO2蛋白的下调表达;SYNPO2过表达可促进病毒M蛋白表达,但未影响病毒基因组的复制、转录及感染性病毒粒子释放的能力;干扰SYNPO2则在未影响病毒基因组复制和转录的情况下显著抑制了病毒M蛋白的表达和感染性病毒粒子的释放;进一步经共定位分析发现SYNPO2与病毒M蛋白存在明显共定位现象。结论确定了SYNPO2蛋白对狂犬病病毒复制起着正向调控作用,为挖掘狂犬病治疗潜在的药物靶标奠定基础数据。 展开更多

关键词 狂犬病病毒 病毒复制 SYNPO2蛋白 病毒m蛋白

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H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

8

作者 王粲 张民秀 +6 位作者 谢芝勋 李孟 罗思思 李丹 阮志华 谢丽基 谢志勤 《中国动物检疫》 CAS 2024年第4期103-110,共8页

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Ba... 为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H9N2亚型 m1蛋白 NA蛋白 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

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流感病毒M1蛋白与M2蛋白相互作用以及其在病毒出芽中的作用 被引量：4

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作者 侯天龙 包旦奇 +2 位作者 李泽君 刘芹防 刘焕奇 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2016年第6期1-5,共5页

流感病毒为囊膜病毒,以出芽的方式释放病毒。M1蛋白是流感病毒的基质蛋白,在维持病毒颗粒形态与病毒的致病性中发挥重要作用。M2蛋白是离子通道蛋白,在病毒出芽过程中发挥重要作用。研究显示M1蛋白与M2蛋白存在相互作用,但是这种互作在... 流感病毒为囊膜病毒,以出芽的方式释放病毒。M1蛋白是流感病毒的基质蛋白,在维持病毒颗粒形态与病毒的致病性中发挥重要作用。M2蛋白是离子通道蛋白,在病毒出芽过程中发挥重要作用。研究显示M1蛋白与M2蛋白存在相互作用,但是这种互作在病毒出芽中的功能尚不清楚。根据M1蛋白的结构,M1蛋白分成N端、C端和中间区域3个区域,与M2蛋白相互作用的区域也不清楚。本文利用双分子荧光互补实验与病毒出芽实验方法研究了M1蛋白与M2蛋白互作的区域及这种互作在病毒出芽中的作用。研究结果显示,M2蛋白通过与M1蛋白的N端1～160个氨基酸相互作用,从而帮助M1蛋白出芽;M1蛋白的1～20氨基酸与140～160氨基酸在决定M1蛋白的稳定性与功能发挥中具有重要作用,缺失这2个氨基酸序列可导致M1蛋白N端1～160个氨基酸蛋白不稳定,并不能与M2蛋白互作。本研究揭示了3H1N1流感病毒M1蛋白与M2蛋白互作功能区域、以及他们之间相互作用在流感病毒出芽中发挥的重要作用。 展开更多

关键词 流感病毒 m1蛋白 m2蛋白 出芽

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蝙蝠流感病毒与H9N2亚型禽流感病毒M蛋白的免疫原性比较研究 被引量：2

10

作者 黄敏 刘宸瑞 +10 位作者 滕巧泱 刘芹防 李雪松 陈鸿军 车广胜 任超超 崔宏锐 闫大为 周伟光 李泽君 杨健美 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2018年第3期7-15,共9页

为比较新发蝙蝠流感病毒H17N10亚型与禽流感病毒H9N2亚型的M蛋白(包括M1和M2蛋白)的免疫原性,分别构建两种亚型流感病毒M1、M2的原核表达载体和真核表达载体,利用前期反向遗传学技术拯救获得两种重组病毒感染MDCK细胞,并分别与相应的单... 为比较新发蝙蝠流感病毒H17N10亚型与禽流感病毒H9N2亚型的M蛋白(包括M1和M2蛋白)的免疫原性,分别构建两种亚型流感病毒M1、M2的原核表达载体和真核表达载体,利用前期反向遗传学技术拯救获得两种重组病毒感染MDCK细胞,并分别与相应的单抗或多抗进行免疫印迹和免疫荧光鉴定。结果显示,两种亚型病毒的M1蛋白的原核表达产物均与M1多抗反应,均不与2株M1单抗反应;拯救的两种重组病毒感染细胞后及其M1蛋白的真核表达产物均与M1的单抗5F2反应,不与单抗3G8及M1的多抗反应,两种亚型的结果一致;而两种亚型的M2蛋白通过与单抗和多抗反应,出现了不一致的结果,M2的单抗仅与蝙蝠流感病毒M2的原核表达产物反应,不与H9N2禽流感病毒M2的原核表达产物反应,M2的多抗则反之;且M2的多抗仅与H9N2禽流感M2的真核表达产物以及拯救病毒反应,均不与蝙蝠流感病毒M2的真核表达产物及拯救病毒反应。本研究证实这两种亚型流感病毒的M2蛋白之间确实存在免疫原性的差异,并且筛选到了可以区分蝙蝠流感病毒和禽流感病毒的M2抗体,为进一步研究流感病毒M蛋白相关的生物学机制提供了基础。 展开更多

关键词 蝙蝠流感病毒 H9N2亚型禽流感病毒 m蛋白 免疫原性

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人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P、L和M2-1重组质粒的构建和鉴定 被引量：1

11

作者 赵秀玲 张梅 +1 位作者 何金生 付远辉 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2012年第8期895-899,共5页

目的构建可表达人呼吸道合胞病毒(RSV)转录延长/终止抑制因子M2-1(简称M2-1)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的真核表达载体并鉴定蛋白表达情况。方法采用合成T7启动子Oligo DNA及PCR方法获得含有T7启动子的表达盒,通过体外连接方法... 目的构建可表达人呼吸道合胞病毒(RSV)转录延长/终止抑制因子M2-1(简称M2-1)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的真核表达载体并鉴定蛋白表达情况。方法采用合成T7启动子Oligo DNA及PCR方法获得含有T7启动子的表达盒,通过体外连接方法克隆入载体px8δT,制备表达载体px8δT-PT。设计3对PCR引物,PCR扩增出RSV的M2-1、N和P基因,并克隆至px8δT-PT,构建px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N和px8δT-PT-P。同时利用已有的质粒pcDNA3.1-L构建px8δT-PT-L。用重组质粒转染BSR T7/5细胞,72 h后再用Western blot法鉴定蛋白的表达。结果成功实现px8δT的改造,构建的4种重组质粒px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P和px8δT-PT-L,经限制性内切酶分析与预期一致,经Western blot法分析证实M2-1、N及P蛋白被表达。结论获得以T7为启动子的表达载体px8δT-P,成功构建了含有M2-1、N及P编码基因的表达载体,为利用反向遗传学技术进一步改造RSV奠定了基础。 展开更多

关键词 人呼吸道合胞病毒 核蛋白 磷蛋白 转录延长/终止抑制因子m2-1 大蛋白

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基于流感病毒M2蛋白的通用疫苗研究进展 被引量：1

12

作者 修金生 陈如敬 陈小权 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期74-76,61,共4页

目前,疫苗免疫仍然是防控流感病毒最有效的措施,但当前商品化的流感疫苗主要是通过诱发流感病毒血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的抗体起免疫保护作用。由于流感病毒亚型众多,HA有16个亚型,NA有9个亚型,

关键词 流感病毒血凝素 疫苗免疫 m2蛋白 流感病毒亚型 通用 免疫保护作用 神经氨酸酶 流感疫苗

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甲型流感病毒M1、M2和M42蛋白研究进展 被引量：6

13

作者 谭伟 谢芝勋 《动物医学进展》 北大核心 2015年第2期80-83,共4页

甲型流感病毒基因组由8个分节段的基因组成,最初认为流感病毒的每个基因只能编码1个病毒蛋白,但随后发现M基因编码2种蛋白,即M1基质蛋白和M2离子通道蛋白。近年来的研究表明PB1基因编码PB1、PB1-F2和PB1-N40 3种蛋白,而PA基因则能编码PA... 甲型流感病毒基因组由8个分节段的基因组成,最初认为流感病毒的每个基因只能编码1个病毒蛋白,但随后发现M基因编码2种蛋白,即M1基质蛋白和M2离子通道蛋白。近年来的研究表明PB1基因编码PB1、PB1-F2和PB1-N40 3种蛋白,而PA基因则能编码PA、PA-X、PA-N155及PA-N182 4种蛋白。到目前为止,流感病毒的4个基因都已被证明能编码两种或两种以上的蛋白,说明流感病毒可以利用感染细胞的mRNA选择性剪接及蛋白翻译的不同机制实现其相关基因节段编码更多蛋白的能力。2012年发现流感病毒M基因可以编码一种新的蛋白,即M42蛋白。论文将对甲型流感病毒M基因所编码的M1、M2及M42这3种病毒蛋白的研究概况进行综述。 展开更多

关键词 流感病毒m基因 mRNA选择性剪接 m1基质蛋白 m2离子通道蛋白 m42蛋白

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H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定 被引量：1

14

作者 余晓颖 田园 +4 位作者 张国利 吴广谋 刘雨玲 李泽鸿 岳玉环 《中国兽药杂志》 2019年第1期1-8,共8页

为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯... 为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯化的M1目的蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771 bp的M1基因,成功构建p ET-SUMO-M1表达载体,表达的融合蛋白相对分子量为41 kD,主要以可溶形式表达,纯化后获得蛋白纯品,Western blot检测显示用M1蛋白(28 k D)免疫小鼠制备的多抗能与制备的蛋白纯品发生特异性反应,从而证明蛋白纯品为M1目的蛋白。试验制备出的M1蛋白纯品可为进一步制备通用型抗犬流感病毒抗体提供纯品抗原。 展开更多

关键词 H3N2犬流感病毒 m1蛋白 原核表达 蛋白纯化

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转H5禽流感病毒M2e基因烟草的研究 被引量：3

15

作者 张保龙 杨郁文 +1 位作者 倪万潮 侯继波 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第1期51-54,共4页

将禽流感病毒M2e与鸡IgG Fc的融合基因转入烟草植株,利用烟草生产禽流感抗原蛋白,探索利用植物作为生物反应器生产禽流感疫苗的可行性。将M2e-Fc融合基因克隆到植物表达载体pBI121中,与CaMV35s启动子相连,以烟草子叶作为外植体,利用农... 将禽流感病毒M2e与鸡IgG Fc的融合基因转入烟草植株,利用烟草生产禽流感抗原蛋白,探索利用植物作为生物反应器生产禽流感疫苗的可行性。将M2e-Fc融合基因克隆到植物表达载体pBI121中,与CaMV35s启动子相连,以烟草子叶作为外植体,利用农杆菌介导法将外源基因转入烟草中。对抗性植株进行了PCR、RT-PCR分析。结果表明,M2e基因已经导入到烟草中,在转录水平得到了表达。为进一步利用转基因植物生产禽流感疫苗进行了前期的探索工作。 展开更多

关键词 H5亚型禽流感病毒 病毒基质蛋白2(m2) 烟草 转化

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His-tag不影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性 被引量：9

16

作者 曾瑞红 王卫华 +3 位作者 房桂珍 龚伟 梅兴国 魏林 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1066-1070,共5页

目的:观察His-tag是否影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。方法:PCR扩增G1和F/M2基因片段,插入表达载体pET-His和pET-DsbA-His中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和层析法纯化得His-G1F/M2和DsbA-His-G1F/M2,将后者用... 目的:观察His-tag是否影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。方法:PCR扩增G1和F/M2基因片段,插入表达载体pET-His和pET-DsbA-His中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和层析法纯化得His-G1F/M2和DsbA-His-G1F/M2,将后者用凝血酶消化,再经Ni+螯合亲和层析法纯化得G1F/M2,将His-G1F/M2和G1F/M2免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果:两种蛋白在BALB/c小鼠中诱导的RSV特异性抗体和CTL活性无显著差异。结论:His-tag不影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。 展开更多

关键词 呼吸道合胞病毒 HIS-TAG 重组蛋白G1F/m2 免疫原性

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M型磷脂酶A2受体及其抗体在乙肝病毒相关性膜性肾病中的临床意义 被引量：6

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作者 许向青 朱雪婧 +7 位作者 袁曙光 姜文玲 夏运成 刘虹 李军 孙林 彭佑铭 刘伏友 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1064-1068,共5页

目的:研究M型磷脂酶A2受体(phospholipase A2 receptor,PLA2R)在乙肝病毒相关性膜性肾病(hepatitis B virus-associated membranous nephropathy,HBV-MN)患者血液及肾组织中的表达情况,并探讨肾组织PLA2R阳性表达在乙型肝炎相关性肾小... 目的:研究M型磷脂酶A2受体(phospholipase A2 receptor,PLA2R)在乙肝病毒相关性膜性肾病(hepatitis B virus-associated membranous nephropathy,HBV-MN)患者血液及肾组织中的表达情况,并探讨肾组织PLA2R阳性表达在乙型肝炎相关性肾小球肾炎(hepatitis B virus associated glomerulone nephritis,HBV-GN)患者中的临床和病理特点。方法:选取经肾活检确诊的49例HBV-MN患者。检测血清抗PLA2R抗体以及肾组织PLA2R的表达,将患者分为肾组织PLA2R表达阳性组和阴性组,比较两组间临床指标、病理改变、血抗PLA2R抗体表达水平的差异。结果:17例患者存在肾组织PLA2R阳性表达,其中10例患者血清抗PLA2R抗体阳性。肾组织阳性组较阴性组24 h尿蛋白水平升高,血白蛋白水平下降,血清Hbs Ag阳性比例更高(70.5%),肾组织Hbs Ag表达比例更高(71%)。结论:肾组织PLA2R以及血清抗PLA2R抗体在HBV-MN患者中有一定表达,其表达可能与HBV-MN患者血清以及肾组织中Hbs Ag沉积有关。肾组织PLA2R阳性患者肾小球慢性损伤可能相对更重。 展开更多

关键词 乙肝病毒相关性膜性肾病 磷脂酶A2受体 m型磷脂酶A2受体抗体

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呼吸道合胞病毒感染导致豚鼠气道反应性增高及M2受体作用的研究 被引量：5

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作者 方丽萍 戚好文 +1 位作者 林汉军 许东亮 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期443-445,共3页

目的:通过电刺激迷走神经,检测呼吸道合胞病毒(RSV)感染急性期豚鼠气道反应性的变化及其影响机制,探讨RSV感染与哮喘发病之间的关系。方法:RSV感染豚鼠,第6 d电刺激迷走神经法测定气道反应性,二道生理记录仪记录并比较气道内压力(IP mmH... 目的:通过电刺激迷走神经,检测呼吸道合胞病毒(RSV)感染急性期豚鼠气道反应性的变化及其影响机制,探讨RSV感染与哮喘发病之间的关系。方法:RSV感染豚鼠,第6 d电刺激迷走神经法测定气道反应性,二道生理记录仪记录并比较气道内压力(IP mmH2O)。给予选择性M2受体激动剂匹罗卡品,检测IP的变化,判断M2受体功能是否障碍。结果:未刺激迷走神经时,感染组和对照组豚鼠的IP分别为(11.08±1.02)mmH2O、(11.75±1.47)mmH2O,差异无显著(P>0.05)。给予电刺激后,2组IP均呈频率依赖性增高,且感染组明显高于对照组(P<0.01)。依次给予匹罗卡品,对照组IP呈剂量依赖性降低,而感染组IP下降幅度明显低于对照组(P<0.01)。结论:RSV感染导致气道副交感神经自身抑制性M2受体功能障碍,引起气道高反应性发生。 展开更多

关键词 呼吸道合胞体病毒 气道高反应性 迷走神经 受体 胆碱能m2

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禽流感病毒M2e基因与鸡IgG Fc基因在巴斯德毕赤酵母中的融合表达 被引量：3

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作者 尚书文 侯继波 +5 位作者 徐公豹 牛明福 王秀清 何家惠 陈溥言 姜平 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2008年第1期17-22,共6页

【目的】得到融合蛋白M2e-Fc,并检测其免疫学特性,为研制禽流感通用疫苗奠定基础。【方法】根据禽流感病毒H5N1的M2e蛋白氨基酸序列设计2条长互补引物,通过重叠区互补扩增基因法扩增出目的基因M2e,然后与鸡IgGFc片段基因一起克隆入毕赤... 【目的】得到融合蛋白M2e-Fc,并检测其免疫学特性,为研制禽流感通用疫苗奠定基础。【方法】根据禽流感病毒H5N1的M2e蛋白氨基酸序列设计2条长互补引物,通过重叠区互补扩增基因法扩增出目的基因M2e,然后与鸡IgGFc片段基因一起克隆入毕赤酵母表达质粒中,构建酵母表达载体。将阳性质粒线性化后电转化入感受态毕赤酵母X-33中,再经甲醇诱导后,通过Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定融合蛋白。之后用其免疫非免疫鸡,检验其免疫原性。【结果】成功构建了表达M2e和Fc融合蛋白的酵母表达载体pPICZαA-M2-Fc,并通过Zeocin筛选及PCR鉴定出了阳性重组子;阳性重组子经甲醇诱导后得到融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定证实,融合蛋白得到正确表达,并且可以与M2e阳性血清反应。动物免疫试验证实,该融合蛋白可以诱导鸡产生抗M2e抗体,具有良好的免疫原性。【结论】融合蛋白M2e-Fc在巴斯德毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,该融合蛋白具有较好的免疫原性,为后期进行其他免疫试验奠定了基础。 展开更多

关键词 禽流感病毒 m2e基因 鸡IGG Fc基因 巴斯德毕赤酵母

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呼吸道合胞病毒M_(2-1)基因表达对人肺腺癌PAa细胞生长的影响 被引量：2

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作者 陈杭薇 杜玉国 +1 位作者 辛庆红 李继成 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第7期585-587,共3页

探讨呼吸道合胞病毒(RSV)M2 -1基因在人肺腺癌PAa细胞的表达及对其生长的影响。重组真核质粒PXJ 4 1/M2 -1转染肺腺癌PAa细胞 ,应用RT PCR、Westernblot方法检测表达。通过MTT生长曲线、流式细胞光度术、细胞贴壁能力、集落形成、接种... 探讨呼吸道合胞病毒(RSV)M2 -1基因在人肺腺癌PAa细胞的表达及对其生长的影响。重组真核质粒PXJ 4 1/M2 -1转染肺腺癌PAa细胞 ,应用RT PCR、Westernblot方法检测表达。通过MTT生长曲线、流式细胞光度术、细胞贴壁能力、集落形成、接种裸鼠等 ,观察PAa细胞体内外生长变化。结果显示 :①转染阳性重组子经双酶切及RT PCR扩增均可见目的区带 ;②Westernblot检测可见特异性条带 ;③PAa/M2 -1细胞S期下降 ,G2 /M期增加 ;贴壁能力下降 ,集落形成率增高 ,集落细胞数增多 ;④PAa/M2 -1细胞成瘤时间晚 ,但生长速度快 ,瘤组织由腺癌向鳞癌分化。提示M2 -1基因可能促进PAa细胞生长 。 展开更多

关键词 肺腺癌 呼吸道合胞病毒 m2-1基因 肺肿瘤 PAa细胞

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