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脑心肌炎病毒VP22A基因真核表达载体的构建 被引量：1
1
作者 邵帅 纪晓岚 +1 位作者 刘明启 李琼毅 《中国动物保健》 2025年第1期240-241,共2页
为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至... 为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定阳性单克隆菌落,对阳性单克隆提取重组质粒并双酶切进行验证,对阳性重组质粒进行测序。重组质粒双酶切和测序结果表明,pc DNA3.1-Flag-VP2和pc DNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建成功。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 VP2基因 2A基因 真核表达载体
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PRDM5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染Neuro-2a细胞的建立
2
作者 吴钊淳 李友 +2 位作者 何嘉文 廖科棋 李胜男 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第1期1-8,共8页
目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列... 目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列,将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-PRDM5过表达重组质粒,采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中,转染48 h后离心收集慢病毒,分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒,采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组,分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后使用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选,通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平;Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果:PCR法,GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp,GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致;GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL^(-1)。荧光显微镜,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好,且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法,与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量为75000附近出现特异性条带;与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论:成功构建PRDM5过表达慢病毒载体,建立了稳定转染的GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞。 展开更多
关键词 PR锌指区域蛋白 过表达慢病毒载体 稳定表达 Neuro-2a细胞
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p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达
3
作者 张春 苏丛 +1 位作者 伍婷 朱立雨 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第3期398-402,共5页
目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10... 目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。 展开更多
关键词 P62 慢病毒载体构建 三质粒包装系统 THP-1细胞 肺炎克雷伯菌 过表达
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人HACE1过表达慢病毒细胞株构建及其对胶质瘤细胞增殖迁移的影响
4
作者 黄冉 单明 李巍松 《安徽医科大学学报》 北大核心 2025年第7期1241-1245,共5页
目的构建HACE1慢病毒过表达细胞株,检测其对胶质瘤细胞增殖、迁移的影响。方法以人HACE1全长的cDNA序列的菌液为模板,构建慢病毒表达质粒pCDH-HACE1并筛选慢病毒细胞株。采用Western blot法检测其在胶质瘤细胞中的表达情况,同时借助CCK-... 目的构建HACE1慢病毒过表达细胞株,检测其对胶质瘤细胞增殖、迁移的影响。方法以人HACE1全长的cDNA序列的菌液为模板,构建慢病毒表达质粒pCDH-HACE1并筛选慢病毒细胞株。采用Western blot法检测其在胶质瘤细胞中的表达情况,同时借助CCK-8实验、细胞划痕实验检测HACE1对胶质瘤细胞增殖、迁移的影响。结果成功构建了HACE1慢病毒细胞株,Western blot法检测表明HACE1在真核细胞中能有效表达。CCK-8检测显示:与对照组比较,培养24、48 h后HACE1过表达组细胞增殖增强(均P<0.01)。细胞划痕实验显示:与对照组比较,培养24、48 h后HACE1过表达组划痕面积减少(P<0.05、P<0.01)。结论成功构建HACE1过表达慢病毒细胞株,HACE1可促进U251胶质瘤细胞的增殖和迁移。 展开更多
关键词 HACE1 过表达 慢病毒载体 胶质瘤 增殖 迁移
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非病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达 被引量：6
5
作者 尹俊 王鸿利 +6 位作者 王学锋 璩斌 武文漫 丁秋兰 傅启华 戚正武 王振义 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2004年第6期721-725,共5页
为了观察非病毒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠 32D细胞系中的表达 ,将B结构域缺失(△ 76 0aa - 16 39aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBDcDNA)亚克隆至质粒载体pRC/RSV ,构建重组质粒载体 pRC/RSV hFⅧBDcDNA。经SuperFectTransfectionR... 为了观察非病毒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠 32D细胞系中的表达 ,将B结构域缺失(△ 76 0aa - 16 39aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBDcDNA)亚克隆至质粒载体pRC/RSV ,构建重组质粒载体 pRC/RSV hFⅧBDcDNA。经SuperFectTransfectionReagent转染小鼠 32D细胞系 ,分别采用一期法、ELISA法和RT PCR检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性 (hFⅧ∶C)和抗原含量 (hFⅧ∶Ag)以及细胞中hFⅧBDcDNA的转录。结果表明 :小鼠 32D细胞系培养上清液中的人FⅧ∶Ag最高达到了 4 5 0 .0 8毫微克 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,hFⅧ∶C最高达到了 2 .0 1单位 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,RT PCR可检测到 32D细胞中hFⅧBDcDNA转录的mRNA。结论 :非病毒质粒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因能够在小鼠 32D细胞系中表达人FⅧ蛋白 ,所表达的FⅧ与正常人血浆中的野生型FⅧ具有相似的凝血活性。 展开更多
关键词 血友病A 非病毒载体 人凝血因子Ⅷ 基因表达 32D细胞系
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腺病毒载体介导的LacZ基因在神经前体细胞的转染和表达 被引量：5
6
作者 郭灵 谢瑶 +1 位作者 汪华侨 姚志彬 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期135-138,共4页
为了观察含报告基因 L ac Z的重组 5型腺病毒载体 ( Ad5CMVLac Z)在神经前体细胞转染和表达的量效关系并探讨用该载体构建基因修饰细胞的可能性 ,本研究用不同滴度 ( 1× 10 3～ 1× 10 1 0 PFU/ml)的 Ad5CMVLac Z转染体外培养... 为了观察含报告基因 L ac Z的重组 5型腺病毒载体 ( Ad5CMVLac Z)在神经前体细胞转染和表达的量效关系并探讨用该载体构建基因修饰细胞的可能性 ,本研究用不同滴度 ( 1× 10 3～ 1× 10 1 0 PFU/ml)的 Ad5CMVLac Z转染体外培养的 SD胎鼠(胎龄 12 d)海马神经前体细胞 ,用β-半乳糖苷酶 (β-gal)免疫组化反应检测转染效率。结果显示 :当病毒滴度为 1× 10 7时 ,转染率约为 5 0 % ,当滴度增加到 1× 10 1 0时 ,转染率达 10 0 %。Ad5CMVL ac Z在神经前体细胞的转染率具有滴度依赖性的量效关系。表明高滴度的 Ad5CMVLac Z成功地转染了大部分神经前体细胞 ,Lac Z基因也得到充分表达。提示神经前体细胞是该载体转染的适宜靶细胞 ,并有可能通过该载体转导目的基因 。 展开更多
关键词 腺病毒载体 LACZ基因 神经前体细胞 转染 表达 大鼠
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逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达 被引量：2
7
作者 吴锦艳 田宏 +4 位作者 郑海学 陈妍 靳野 尚佑军 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期527-532,共6页
本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞... 本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性。用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性。结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱。免疫荧光检测发现所表达的T7RNAP蛋白具有良好的反应原性。本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具。 展开更多
关键词 T7RNA聚合酶基因 逆转录病毒载体 PK15细胞 SK6细胞 稳定表达
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杆状病毒载体介导的氯霉素乙酰转移酶基因在HepG2中的表达 被引量：1
8
作者 郭亚兵 戴琳 +2 位作者 冯筱榕 杨洁 周福元 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第9期648-649,共2页
目的 重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法 用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFκB）启动子和增强子序列，并插入AcMNPV中，用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒。... 目的 重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法 用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFκB）启动子和增强子序列，并插入AcMNPV中，用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒。分别感染昆虫细胞Sf5和人肝癌细胞株HepG2或HepG2.2.15细胞，测定CAT表达相对活性。结果 由CMV启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2或HepG2.2.15细胞均可表达CAT，而NFκB启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2细胞中CAT表达低，而在有HBV表达的HepG2.2.15细胞中有较高的CAT表达活性。结论 重组杆状病毒能在人肝癌细胞中表达外源基因，而且成功构建了HBV感染细胞特异性表达的杆状病毒载体。 展开更多
关键词 杆状病毒载体 HEPG2细胞系 乙型肝炎病毒 肝癌 氯霉素乙酰转移酶 基因表达
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无辅助病毒HSV-1载体介导LacZ基因在培养皮层神经元中的表达 被引量：1
9
作者 王汉森 潘虹 +3 位作者 张玉稚 包新华 张国荣 吴希如 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期172-174,共3页
目的:探讨无辅助单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype 1,HSV 1)载体的包装及其介导LacZ基因在体外培养神经元表达的作用, 解决该载体系统在包装及体外培养神经元应用中的有关问题。方法:将一组含HSV 1基因组的粘粒以限制性内切酶PacⅠ... 目的:探讨无辅助单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype 1,HSV 1)载体的包装及其介导LacZ基因在体外培养神经元表达的作用, 解决该载体系统在包装及体外培养神经元应用中的有关问题。方法:将一组含HSV 1基因组的粘粒以限制性内切酶PacⅠ酶切、纯化后,与含LacZ和酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase,TH)及神经微丝(neurofilament,NF)嵌合启动子的HSV 1质粒DNA在脂质体作用下,共转染 2 2细胞;在 34℃条件下培养 72h,收获病毒颗粒。将含病毒颗粒的上清液,加入BHK细胞培养液中,继续培养 24h后,加X gal染液作用 4h,观察表达LacZ基因的蓝染细胞。取培养第 3天的胚胎大鼠大脑皮层神经元,加入含病毒颗粒的培养液,过夜后更换新鲜培养液,分组继续培养 1, 7和 14d,进行X gal染色,光镜下观察。结果:包装形成的病毒颗粒感染BHK细胞, 24h后可见表达LacZ基因的蓝染细胞;感染培养第 3天的皮层神经元,继续培养 1, 7和 14d后均可见蓝染神经元。结论:无辅助病毒包装系统能够使含TH NF嵌合启动子的HSV 1载体形成有效的病毒颗粒,并且在体外培养神经元中持续稳定地表达外源基因,为在神经系统进行基因转移和基因功能研究提供了有效的工具。 展开更多
关键词 LACZ基因 HSV-1 辅助病毒 载体介导 培养神经元 大脑皮层神经元 病毒颗粒 X-gal 单纯疱疹病毒 限制性内切酶 酪氨酸羟化酶 继续培养 基因功能研究 质粒DNA 细胞培养液 BHK细胞 载体系统 神经微丝 胚胎大鼠 镜下观察 包装系统
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MAVS全长及其截短体真核表达载体的构建和鉴定
10
作者 玉妹 毕冬琳 +1 位作者 郑天倚 李琼毅 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第1期49-60,共12页
建立线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)全长及截短体的真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达,为后续探索MAVS在病毒逃逸机制研究中的作用提供重要的实验材料。首先,根据NCBI数据库中人源MAVS的... 建立线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)全长及截短体的真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达,为后续探索MAVS在病毒逃逸机制研究中的作用提供重要的实验材料。首先,根据NCBI数据库中人源MAVS的全长序列,设计截短体引物,通过PCR从cDNA模板中扩增出MAVS全长及不同截短体的基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1-3xflag载体中。随后,将构建好的载体转染到HEK-293细胞中,利用RT-PCR技术检测扩增产物大小,与目的大小进行对比,用Western blot技术检测MAVS蛋白在293细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了全长MAVS(MAVS-FL)及其截短体MAVS-△C、MAVS-△CP、MAVS-PBD、MAVS-△Tm的真核表达载体,Western blot结果表明,构建的载体蛋白在HEK-293中能够有效表达。本研究成功构建了MAVS全长及其截短体的真核表达载体,并在HEK-293细胞中表达了这些蛋白,为后续研究MAVS蛋白的功能和抗病毒机制提供了实验材料。 展开更多
关键词 线粒体抗病毒蛋白 真核表达载体 截短体构建 蛋白表达
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植物病毒载体介导的可溶性甲烷单加氧酶B亚单位在蚕豆植物中的表达 被引量：6
11
作者 王振东 《辽宁农业科学》 2005年第4期5-8,共4页
用基因操作技术将编码可溶性甲烷单加氧酶B亚单位(SolubleMethaneMonoxygenase-Bcomponent;sM-MO-B)的基因全长序列导入来自三叶草黄脉病毒(Cloveryellowveinvirus;ClYVV)侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pClYVV/CP/W基因组... 用基因操作技术将编码可溶性甲烷单加氧酶B亚单位(SolubleMethaneMonoxygenase-Bcomponent;sM-MO-B)的基因全长序列导入来自三叶草黄脉病毒(Cloveryellowveinvirus;ClYVV)侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pClYVV/CP/W基因组的NIb/CP基因之间,构建了重组病毒克隆pCV-mmoB。用上述重组病毒克隆接种该病毒的自然寄主植物蚕豆,表现了与野生型ClYVV相同的症状。RT-PCR检测结果表明,子代病毒基因组中的外源基因获得了转录。蛋白质杂交(Westernblotting;WB)检测结果表明,sM-MO-B亚单位蛋白在被重组病毒克隆侵染的寄主植物中获得了表达。 展开更多
关键词 sMMO B亚单位 植物病毒载体 表达
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复制缺陷型腺病毒载体介导hVEGF cDNA在C2C12和NIH3T3细胞中的表达 被引量：1
12
作者 孙欲晓 陈诗书 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期704-709,共6页
为提高hVEGFcDNA在心肌中的表达 ,降低在其它组织中表达可能产生的不良反应 ,用PCR法得到人磷酸肌酸激酶 (MCK)增强子和CMV核心启动子 .利用克隆技术构建了含双拷贝MCK增强子 (m)和人巨细胞病毒 (CMV)核心启动子 (c)的嵌合启动子 (mmc) ... 为提高hVEGFcDNA在心肌中的表达 ,降低在其它组织中表达可能产生的不良反应 ,用PCR法得到人磷酸肌酸激酶 (MCK)增强子和CMV核心启动子 .利用克隆技术构建了含双拷贝MCK增强子 (m)和人巨细胞病毒 (CMV)核心启动子 (c)的嵌合启动子 (mmc) ,构建真核表达质粒pK3 mmcLacZ ,制备受mmc嵌合启动子调控的重组腺病毒Ad mmcVEGF .经X gal染色、β 半乳糖苷酶定量分析、RT PCR、hVEGFELISA定量分析、VEGF活性测定等研究表明 。 展开更多
关键词 人磷酸肌酸激酶增强子 嵌合启动子 肌细胞 特异性表达 血管内皮生长因子 腺病毒载体 心肌缺血 基因治疗 复制
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植物病毒载体介导的sMMO-C在蚕豆植物中的表达
13
作者 陈超力 张敏 +2 位作者 王丽 孟可心 王振东 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期575-579,共5页
构建了可溶性甲烷单加氧酶C亚单位(soluble methane monoxygenase-C component,sMMO-C)基因和绿色荧光蛋白-S65T(green fluorescence protein,GFP-S65T)基因的融合基因sMMO-C/GFP-S65T。将融合基因sMMO-C/GFP-S65T克隆到三叶草黄脉病毒(... 构建了可溶性甲烷单加氧酶C亚单位(soluble methane monoxygenase-C component,sMMO-C)基因和绿色荧光蛋白-S65T(green fluorescence protein,GFP-S65T)基因的融合基因sMMO-C/GFP-S65T。将融合基因sMMO-C/GFP-S65T克隆到三叶草黄脉病毒(glover yellow vein virus,ClYVV)侵染性植物表达载体pClYVV/CP/W的NIb/CP基因之间,构建了侵染性重组病毒克隆pCV-mmoC/GFP-S65T。RT-PCR检测结果表明,sMMO-C/GFP-S65T在子代病毒基因组中获得了转录。用GFP抗体进行蛋白质杂交(western blotting,WB),检测到25kDa左右的GFP蛋白,这一结果表明GFP蛋白在被pCV-mmoC/GFP-S65T侵染的寄主植物中获得了表达,并被病毒自身编码的NIa蛋白酶从病毒聚合蛋白及sMMO-C/GFP-S65T融合蛋白中自动切断。可见,sMMO-C亚单位蛋白在植物中获得了表达,因在sMMO-C/GFP-S65T中sMMO-C位于GFP上游。 展开更多
关键词 植物病毒载体 表达 GFP sMMO-C
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腺病毒载体介导的人凝血因子 IX 基因的离体和活体表达
14
作者 王琪 卢大儒 +2 位作者 颜永碧 邱信芳 薛京伦 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 1998年第8期45-49,共5页
为血友病Ｂ的基因治疗探索了高效转移和表达载体，建立了重组腺病毒载体介导的基因转移系统（Ａｄｈｆｉｘ），并进行了离体和活体表达研究。结果显示：腺病毒离体基因转移效率可达９８％以上并可在多种细胞中高效表达，ｈＦＩＸ蛋白最... 为血友病Ｂ的基因治疗探索了高效转移和表达载体，建立了重组腺病毒载体介导的基因转移系统（Ａｄｈｆｉｘ），并进行了离体和活体表达研究。结果显示：腺病毒离体基因转移效率可达９８％以上并可在多种细胞中高效表达，ｈＦＩＸ蛋白最高可达６．８６μｇ／１０６细胞／２４ｈｒ。小鼠血浆中ｈＦＩＸ蛋白含量最高可达１０７２ｎｇ／ｍｌ血浆，并可持续表达１０周左右；以腹腔注射效果最好；免疫抑制剂环磷酰胺可明显延长表达持续时间。结果表明重组腺病毒载体可介导ｈＦＩＸｃＤＮＡ在离体细胞和活体组织中高效转移和表达。 展开更多
关键词 腺病毒载体 凝血因子IX 基因 转移 血友病 表达
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反转录病毒载体介导可溶性Fas的体外表达
15
作者 王良利 邹萍 +3 位作者 胡中波 刘凌波 李爱香 马艳萍 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2002年第2期97-99,共3页
将含全长FascDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除 ,获得sFascDNA。通过DNA重组技术 ,将sFascDNA插入到反转录病毒载体 pLXIN ,构建了重组表达载体pLXIN sFas。经酶切鉴定及测序 ,表明成功地构建了重组表达载体 pLXIN sFas。该载体经P... 将含全长FascDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除 ,获得sFascDNA。通过DNA重组技术 ,将sFascDNA插入到反转录病毒载体 pLXIN ,构建了重组表达载体pLXIN sFas。经酶切鉴定及测序 ,表明成功地构建了重组表达载体 pLXIN sFas。该载体经PA317细胞包装后 ,感染靶细胞COS 7,分别采用ELISA及凋亡抑制实验检测其蛋白表达量为 (2 .2± 0 .7) μg/ml,且具有良好的生物学活性 ,能明显抑制抗 Fas(CH 11)介导的T淋巴瘤细胞株Jurkat的凋亡。 展开更多
关键词 反转录病毒载体 可溶性FAS 基因表达 基因转移 体外表达 白血病 免疫监视
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含内部核糖体进入位点的逆转录病毒载体介导多药耐药基因的高效表达
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作者 傅建新 王玮 +1 位作者 阮长耿 陈子兴 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 1999年第3期198-204,共7页
为研究内部核糖体进入位点(IRES)引导多药耐药基因(MDR1)的表达效率，利用pSXLC／pHa载体系统构建双顺反予载体pHa-IRES-MDR1(HaiMDR)。其中的MDR1基因翻译由脑心肌炎病毒IRES控制。通过脂质体法将载体HaiMDR转染入单嗜性包装细胞GP+E8... 为研究内部核糖体进入位点(IRES)引导多药耐药基因(MDR1)的表达效率，利用pSXLC／pHa载体系统构建双顺反予载体pHa-IRES-MDR1(HaiMDR)。其中的MDR1基因翻译由脑心肌炎病毒IRES控制。通过脂质体法将载体HaiMDR转染入单嗜性包装细胞GP+E86而得到滴度2．0×10^5CFU／ml的病毒；用单嗜性病毒重复感染GP+env Am12细胞获得滴度约6．5×10^5CFU／ml的双嗜性病毒生产细胞，并命名为Am12／HaiMDR。两种病毒生产细胞均具经典MDR表型，与未转染的细胞相比，两者对长春新碱、柔红霉素和紫杉醇产生15—358倍耐药。采用聚合酶链反应，在两种生产细胞均证实有外源性MDR1基因的整合和转录。但同时也发现有异常剪接的转录本存在。利用P-糖蛋白(P-gp)特异性单克隆抗体UIC2结合流式细胞术分析。两种耐药细胞均表达高水平的P-gp。因而，MDR1基因可在IRES控制下以帽非依赖性方式进行有效表达，其在基因治疗研究中可有两种用途：在癌症患者化疗后用于保护干／祖细胞，或在双顺反子载体中作为体内显性选择性标志用于共表达治疗性基因。 展开更多
关键词 逆转录病毒载体 多药耐药基因 基因转移 基因表达 内部核糖体进入位点
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猪流行性腹泻病毒Nsp7基因真核表达载体的构建及表达
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作者 魏佳琪 高振秋 +6 位作者 郑亮 牛欣雨 武峰峰 吴春宇 王志昊 张华 曹宏伟 《黑龙江八一农垦大学学报》 2024年第1期91-97,共7页
PEDV Nsp7蛋白是猪流行性腹泻病毒的一种非结构蛋白,它在病毒复制过程中表达,并与感染细胞的内质网和细胞膜相关,是病毒基因组翻译的两个大型复制酶的关键辅助因子。为了对PEDV Nsp7蛋白进行更加深入的研究,试验从病变猪小肠中提取总RNA... PEDV Nsp7蛋白是猪流行性腹泻病毒的一种非结构蛋白,它在病毒复制过程中表达,并与感染细胞的内质网和细胞膜相关,是病毒基因组翻译的两个大型复制酶的关键辅助因子。为了对PEDV Nsp7蛋白进行更加深入的研究,试验从病变猪小肠中提取总RNA,并通过RT-PCR扩增获取PEDVNsp7基因,最终将其连接到pCMV-Myc载体上。试验结果显示,成功构建了pCMV-Myc-Nsp7的重组质粒,并通过Western Blot技术和免疫荧光技术在真核细胞中验证了其蛋白表达情况,为后续研究PEDV Nsp7的生物学功能奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 Nsp7基因 真核表达载体 蛋白表达
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羊口疮病毒 ORF116 基因真核表达载体的构建 被引量：1
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作者 覃绍洋 周伟杰 庞峰 《贵州畜牧兽医》 2024年第4期57-59,共3页
为了构建羊口疮病毒ORF116基因的真核表达载体,以ORFV-JS株基因组为参考序列,PCR特异性扩增ORF116基因;将ORF116基因与pEGFP-N1载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞,菌液PCR和测序筛选鉴定阳性单克隆;阳性克隆扩大培养后提取pEGFP-ORF116... 为了构建羊口疮病毒ORF116基因的真核表达载体,以ORFV-JS株基因组为参考序列,PCR特异性扩增ORF116基因;将ORF116基因与pEGFP-N1载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞,菌液PCR和测序筛选鉴定阳性单克隆;阳性克隆扩大培养后提取pEGFP-ORF116重组质粒,并进行酶切鉴定。结果:ORF116基因PCR产物为696 bp;菌液PCR共得到3个阳性单克隆,测序结果正确;pEGFP-ORF116重组质粒双酶切得到696 bp的ORF116基因片段。结论:试验成功构建了羊口疮病毒ORF116基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的表达及编码蛋白的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 ORF116基因 克隆 真核表达载体
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羊口疮病毒F1L基因真核表达载体的构建及鉴定
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作者 蒋尊 安红艳 +3 位作者 孙创奇 葛佳仪 梁倩 鲜思美 《贵州畜牧兽医》 2024年第1期57-59,共3页
为构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达载体,以ORFV-DZ分离株基因组作为模板,PCR特异性扩增F1L基因,扩增产物与pEGFP-N1质粒连接构建重组质粒pEGFP-F1L,经测序和酶切验证的阳性重组子转染HEK-293t细胞进行表达,通过荧光显微镜观察和Western... 为构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达载体,以ORFV-DZ分离株基因组作为模板,PCR特异性扩增F1L基因,扩增产物与pEGFP-N1质粒连接构建重组质粒pEGFP-F1L,经测序和酶切验证的阳性重组子转染HEK-293t细胞进行表达,通过荧光显微镜观察和Western blotting对融合蛋白的表达进行鉴定。结果:PCR产物长度为1 029 bp,与F1L基因片段长度相符;阳性重组质粒pEGFP-F1L转染HEK-293t细胞可观察到明显绿色荧光,表达的融合蛋白大小约65 ku,与预期相符。结论:试验成功构建了pEGFP-F1L真核表达载体。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 F1L基因 真核表达载体
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胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立
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作者 李胜男 何嘉文 +1 位作者 廖科棋 李友 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1322-1329,共8页
目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限... 目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。 展开更多
关键词 胞质分裂作用因子4 过表达慢病毒载体 Neuro-2a细胞 稳定转染 过表达慢病毒
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