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甲基化CpG结合域重组蛋白的表达与鉴定
1
作者
徐建
潘世扬
+3 位作者
许雨乔
孙瑞红
黄蕾
彭珊珊
《南京医科大学学报（自然科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第11期1511-1515,共5页
目的:在大肠杆菌中表达甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)重组蛋白。方法:对人甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,Mecp2)的MBD区行密码子优化,将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a,在大肠杆菌E.coli ...
目的:在大肠杆菌中表达甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)重组蛋白。方法:对人甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,Mecp2)的MBD区行密码子优化,将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a,在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达;镍亲和层析柱纯化重组蛋白。表面等离子共振分析重组MBD蛋白与甲基化DNA的结合能力。结果:酶切和核酸测序证实,成功构建了含密码子优化的MBD基因的原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot结果显示,MBD重组蛋白在大肠杆菌中得到表达。亲和层析法纯化后获得了相对分子量为38 000的MBD重组蛋白。SPR分析显示MBD重组蛋白能特异结合甲基化DNA。结论:成功构建含密码子优化的MBD基因的原核表达载体,MBD重组蛋白能在大肠杆菌中表达。
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关键词
甲基化cpg结合域
甲基
化
cpg
结合
蛋白2
原核表达
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职称材料
基于将mTET1-H6与MBD融合的新蛋白酶促体系的优化
2
作者
胡珊珊
柏骁
+2 位作者
肖君华
李凯
周宇荀
《东华大学学报(自然科学版)》
2025年第4期133-141,共9页
TET(Ten-Eleven-Translocation)是依赖于Fe^(2+)和α-酮戊二酸(α-KG)的双加氧酶,具有氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)的能力。为了提高酶的催化效率,以小鼠TET1(mTET1)为研究对象,将甲基化CpG结合域(MBD)与mTET1进行融合,研究亚铁盐种类及浓度...
TET(Ten-Eleven-Translocation)是依赖于Fe^(2+)和α-酮戊二酸(α-KG)的双加氧酶,具有氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)的能力。为了提高酶的催化效率,以小鼠TET1(mTET1)为研究对象,将甲基化CpG结合域(MBD)与mTET1进行融合,研究亚铁盐种类及浓度、小分子添加剂种类及浓度、缓冲液种类、酶浓度与不同种类、代数的聚酰胺-胺树状大分子对酶促反应的影响。结果表明,甲基化CpG结合域(MBD)的融合有利于结合底物DNA,从而提高mTET1-H6的酶活性。在100μL反应体系中,1 mmol/L的硫酸亚铁铵和Hepes-NaOH缓冲液有助于酶促反应,相对酶活分别提高2.04倍和3.88倍,且10μg的酶量有利于提高酶促反应速率。此外,在催化体系中添加1 mmol/L的L-半胱氨酸和四氯对苯醌小分子、40 nmol/L的第五代树状大分子可以进一步提高酶的氧化能力,相对酶活分别提高5.7倍、6.39倍和7.62倍。mTET1-H6-MBD对5mC迭代氧化为5hmC、5fC和5caC的转化率达78.66%。
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关键词
mTET1蛋白
甲基化cpg结合域
酶促反应体系优
化
聚酰胺-胺树状大分子
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职称材料
题名
甲基化CpG结合域重组蛋白的表达与鉴定
1
作者
徐建
潘世扬
许雨乔
孙瑞红
黄蕾
彭珊珊
机构
南京医科大学第一附属医院检验医学部
南京医科大学医学检验系
出处
《南京医科大学学报（自然科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第11期1511-1515,共5页
基金
国家自然科学基金(30972821,30901262)
江苏省自然科学基金(BK2009440)
+1 种基金
江苏省实验诊断学重点实验室基金(XK201114)
江苏省高等学校大学生实践创新训练计划(ky102j201205)
文摘
目的:在大肠杆菌中表达甲基化CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)重组蛋白。方法:对人甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,Mecp2)的MBD区行密码子优化,将人工合成的DNA克隆至原核表达载体pGS21a,在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达;镍亲和层析柱纯化重组蛋白。表面等离子共振分析重组MBD蛋白与甲基化DNA的结合能力。结果:酶切和核酸测序证实,成功构建了含密码子优化的MBD基因的原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot结果显示,MBD重组蛋白在大肠杆菌中得到表达。亲和层析法纯化后获得了相对分子量为38 000的MBD重组蛋白。SPR分析显示MBD重组蛋白能特异结合甲基化DNA。结论:成功构建含密码子优化的MBD基因的原核表达载体,MBD重组蛋白能在大肠杆菌中表达。
关键词
甲基化cpg结合域
甲基
化
cpg
结合
蛋白2
原核表达
Keywords
methyl-
cpg
-binding domain
methyl-
cpg
-binding protein 2
prokaryotic expression
分类号
Q786 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
基于将mTET1-H6与MBD融合的新蛋白酶促体系的优化
2
作者
胡珊珊
柏骁
肖君华
李凯
周宇荀
机构
东华大学生物与医学工程学院
出处
《东华大学学报(自然科学版)》
2025年第4期133-141,共9页
基金
科技部重大研发计划(2018YFA0801101)。
文摘
TET(Ten-Eleven-Translocation)是依赖于Fe^(2+)和α-酮戊二酸(α-KG)的双加氧酶,具有氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)的能力。为了提高酶的催化效率,以小鼠TET1(mTET1)为研究对象,将甲基化CpG结合域(MBD)与mTET1进行融合,研究亚铁盐种类及浓度、小分子添加剂种类及浓度、缓冲液种类、酶浓度与不同种类、代数的聚酰胺-胺树状大分子对酶促反应的影响。结果表明,甲基化CpG结合域(MBD)的融合有利于结合底物DNA,从而提高mTET1-H6的酶活性。在100μL反应体系中,1 mmol/L的硫酸亚铁铵和Hepes-NaOH缓冲液有助于酶促反应,相对酶活分别提高2.04倍和3.88倍,且10μg的酶量有利于提高酶促反应速率。此外,在催化体系中添加1 mmol/L的L-半胱氨酸和四氯对苯醌小分子、40 nmol/L的第五代树状大分子可以进一步提高酶的氧化能力,相对酶活分别提高5.7倍、6.39倍和7.62倍。mTET1-H6-MBD对5mC迭代氧化为5hmC、5fC和5caC的转化率达78.66%。
关键词
mTET1蛋白
甲基化cpg结合域
酶促反应体系优
化
聚酰胺-胺树状大分子
Keywords
mTET1 protein
methylated
cpg
-binding domain
optimization of enzymatic reaction system
PAMAM dendrimers
分类号
Q814 [生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
甲基化CpG结合域重组蛋白的表达与鉴定
徐建
潘世扬
许雨乔
孙瑞红
黄蕾
彭珊珊
《南京医科大学学报（自然科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2012
0
在线阅读
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职称材料
2
基于将mTET1-H6与MBD融合的新蛋白酶促体系的优化
胡珊珊
柏骁
肖君华
李凯
周宇荀
《东华大学学报(自然科学版)》
2025
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