【目的】探究牛巴贝斯虫(Babesia bovis)SBP2蛋白(spherical body protein 2,SBP2)的生物信息学特征并进行原核表达及多克隆抗体制备,为牛巴贝斯虫疫苗和诊断抗原筛选提供理论依据。【方法】对牛巴贝斯虫SBP2基因进行扩增和克隆,运用Meg...【目的】探究牛巴贝斯虫(Babesia bovis)SBP2蛋白(spherical body protein 2,SBP2)的生物信息学特征并进行原核表达及多克隆抗体制备,为牛巴贝斯虫疫苗和诊断抗原筛选提供理论依据。【方法】对牛巴贝斯虫SBP2基因进行扩增和克隆,运用Mega7.0构建牛巴贝斯虫SBP2蛋白系统进化树,利用IEDB Analysis Resource等生物信息学方法对牛巴贝斯虫SBP2蛋白的磷酸化位点和B细胞抗原表位进行预测分析;对SBP2蛋白与弓形虫致密颗粒蛋白(GRA)的氨基酸序列比对分析;构建原核表达载体p ET-28a-SBP2,诱导表达SBP2重组蛋白并进行蛋白纯化,通过Western blotting验证SBP2重组蛋白反应原性;以SBP2重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并利用间接ELISA方法检测其效价。【结果】系统进化树显示,本研究牛巴贝斯虫SBP2蛋白与泰国株(OM46855)的氨基酸序列亲缘关系最近。生物信息学分析显示,SBP2蛋白包含17个B细胞抗原表位和31个磷酸化位点,其中包括12个丝氨酸位点、14个苏氨酸位点及5个酪氨酸位点。牛巴贝斯虫SBP2蛋白氨基酸序列与弓形虫GRA蛋白之间有很强的相关性。成功构建了重组质粒p ET-28a-SBP2;Western blotting结果显示,SBP2重组蛋白分子质量大小约为35ku,具有良好的反应原性;制备的多克隆抗体效价为1∶204800。【结论】本研究通过预测牛巴贝斯虫SBP2蛋白生物学特性,加深了对SBP2蛋白的认识,利用原核表达系统成功获得牛巴贝斯虫SBP2重组蛋白,并获得其小鼠源多克隆抗体,为进一步研究SBP2功能及其在牛巴贝斯虫致病机制中的作用奠定了基础。展开更多
克隆合作猪神经营养因子3基因(Neurotrophin3,NTF3)的编码区序列(Coding region sequence,CDS),预测分析其结构与功能,并检测基因在不同组织中的表达量,构建组织表达谱。通过PCR扩增、Sanger测序等方法获得合作猪NTF3基因CDS区序列,使...克隆合作猪神经营养因子3基因(Neurotrophin3,NTF3)的编码区序列(Coding region sequence,CDS),预测分析其结构与功能,并检测基因在不同组织中的表达量,构建组织表达谱。通过PCR扩增、Sanger测序等方法获得合作猪NTF3基因CDS区序列,使用生物信息学方法分析其结构,并使用RT-qPCR技术检测其在不同组织中的表达水平。结果显示,合作猪NTF3基因CDS区长774 bp,编码257个氨基酸;等电点(pI)为9.46,属于碱性蛋白;合作猪与猪、牛亲缘关系较近;二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,三级结构主要由β-折叠、α-螺旋等组成;整条链中亲水性氨基酸残基数量多于疏水性氨基酸残基数量,是亲水性蛋白;无跨膜区域,是非跨膜蛋白;在37~58位氨基酸残基有一个线圈结构域、64~79位有一个低复杂度结构域和144~249位有一个神经生长因子结构域;存在信号肽,推测是分泌蛋白;NTF3基因在合作猪脾脏的表达量最高,回肠表达量最低。展开更多
B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(Bcl-X_L/Bcl-2 associated death promoter,Bad)是麝鼠(Ondatra zibethicus)香腺miRNA测序筛选出的显著差异miRNA靶基因之一。为了解麝鼠Bad基因的基因结构和生物学功能,探讨其在麝鼠香腺发育和泌香中的作...B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(Bcl-X_L/Bcl-2 associated death promoter,Bad)是麝鼠(Ondatra zibethicus)香腺miRNA测序筛选出的显著差异miRNA靶基因之一。为了解麝鼠Bad基因的基因结构和生物学功能,探讨其在麝鼠香腺发育和泌香中的作用,通过比对麝鼠的全基因组获得麝鼠Bad基因的CDS区序列,并利用多种在线预测软件进行生物信息学分析。结果表明:麝鼠Bad基因的CDS区全长为615 bp,编码204个氨基酸;编码的蛋白相对分子质量为22087.40,等电点为9.63,不稳定系数为72.03,平均亲水系数为-0.885,是不稳定的亲水蛋白;无跨膜结构,无信号肽,有26个潜在的磷酸化结合位点。亚细胞定位结果显示,该蛋白主要定位于线粒体。二级结构主要由α-螺旋(32.84%)、无规则卷曲(56.86%)、β-转角(4.90%)和延伸链(5.39%)构成。构建系统发育进化树结果显示,麝鼠与仓鼠科(Cricetidae)亲缘关系最近,说明Bad基因在进化过程中相对保守。蛋白质互作预测结果显示,Bad蛋白与Bcl-2、Akt、Ywhaq、Ywhaz和Ywhab等蛋白相互作用,提示Bad蛋白与这些蛋白间的相互作用可能促进麝鼠香腺萎缩;与Mapk8等互作提示在香腺发育时具有抑制凋亡的作用。研究结果为进一步探究麝鼠Bad基因在香腺周期性发育中的功能提供参考。展开更多
文摘克隆合作猪神经营养因子3基因(Neurotrophin3,NTF3)的编码区序列(Coding region sequence,CDS),预测分析其结构与功能,并检测基因在不同组织中的表达量,构建组织表达谱。通过PCR扩增、Sanger测序等方法获得合作猪NTF3基因CDS区序列,使用生物信息学方法分析其结构,并使用RT-qPCR技术检测其在不同组织中的表达水平。结果显示,合作猪NTF3基因CDS区长774 bp,编码257个氨基酸;等电点(pI)为9.46,属于碱性蛋白;合作猪与猪、牛亲缘关系较近;二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,三级结构主要由β-折叠、α-螺旋等组成;整条链中亲水性氨基酸残基数量多于疏水性氨基酸残基数量,是亲水性蛋白;无跨膜区域,是非跨膜蛋白;在37~58位氨基酸残基有一个线圈结构域、64~79位有一个低复杂度结构域和144~249位有一个神经生长因子结构域;存在信号肽,推测是分泌蛋白;NTF3基因在合作猪脾脏的表达量最高,回肠表达量最低。
