【目的】应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)建立基于颜色判定的简单、快速、灵敏并具有通用性的烟草疫霉(Phytophthora parasitica var. nicotianae)检测方法,为该病害的风险预判和防治提供依据...【目的】应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)建立基于颜色判定的简单、快速、灵敏并具有通用性的烟草疫霉(Phytophthora parasitica var. nicotianae)检测方法,为该病害的风险预判和防治提供依据。【方法】以PUF蛋白编码基因PpPuf4为靶序列,设计并筛选得到一组烟草疫霉菌特异性LAMP引物,建立了一种快速有效的LAMP检测体系。通过实验对该检测方法的特异性、灵敏度、通用性进行了评估,并对其实际应用效果进行了验证。【结果】在62℃恒温条件下进行扩增反应,反应结束后加入荧光染料SUPERGreenI作为显色剂,特异性检测结果显示,只有烟草疫霉菌株的LAMP反应液为阳性(黄绿色),另外14株其他烟草常见真菌病原菌反应液为阴性。灵敏度试验结果显示,最低能检测到烟草疫霉的DNA浓度为1 pg/μL。通用性结果显示18株不同地区来源的烟草疫霉菌均可被检出。人工接种发病组织和田间黑胫病烟株的检测结果均呈阳性,与组织分离法对烟草疫霉的检测结果相一致。【结论】该检测方法的建立,可用于田间烟草黑胫病的快速、简单、有效地检测,有利于烟草黑胫病的及时发现和防控。展开更多
为了明确燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)快速检测方法,以荧光染料SYBR Green I为指示剂,以燕麦镰孢菌(F.avenaceum)的ITS序列为目的 DNA片段,应用LAMP设计软件设计4条引物,优化LAMP反应体系和反应条件,用2%琼脂糖凝胶电泳和LAMP反应液...为了明确燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)快速检测方法,以荧光染料SYBR Green I为指示剂,以燕麦镰孢菌(F.avenaceum)的ITS序列为目的 DNA片段,应用LAMP设计软件设计4条引物,优化LAMP反应体系和反应条件,用2%琼脂糖凝胶电泳和LAMP反应液颜色变化进行特异性和灵敏度验证,同时进行田间发病组织检测和土壤燕麦镰孢菌灵敏度验证。结果表明:优化的LAMP反应体系,最佳反应温度为65℃,反应程序为65℃下1h,80℃下20min。特异性检测结果表明,燕麦镰孢菌LAMP检测均呈黄绿色(阳性),对照和其他病原菌均呈橘色(阴性)。灵敏度验证结果表明,LAMP反应液检测灵敏度在DNA水平达到10pg·μL-1,每克土壤中检测的灵敏度为40个燕麦镰孢菌孢子。对采自甘肃省甘南州卓尼县和临潭县的20份疑似病害样本提取的DNA进行检测,其中13份为阳性,表明该技术能够有效的检测出青稞发病组织中的燕麦镰孢菌。本方法的建立与应用能为燕麦镰孢菌的检测及其青稞茎基腐病的诊断提供一种新技术。展开更多
根据GenBank公布的沙门氏菌高度保守的fimY蛋白基因序列,利用Primer explorer V4软件设计4条针对沙门氏菌fimY基因的特异性引物,通过对Mg2+浓度、dNTP浓度、反应温度、反应时间、特异性、敏感性、重复性和稳定系及符合率等方面,优化LAM...根据GenBank公布的沙门氏菌高度保守的fimY蛋白基因序列,利用Primer explorer V4软件设计4条针对沙门氏菌fimY基因的特异性引物,通过对Mg2+浓度、dNTP浓度、反应温度、反应时间、特异性、敏感性、重复性和稳定系及符合率等方面,优化LAMP各种反应条件,建立针对沙门氏菌LAMP快速诊断方法。结果表明,该方法具有较强的特异性;比PCR检测方法敏感性高100倍,对沙门氏菌的最低检出量为6.2CFU/mL;对24份样品的3次检测结果与国标法完全一致。证明建立的针对fimY蛋白基因的LAMP检测方法操作简便,特异性强,敏感性高,适用于现场检测。展开更多
文摘为了明确燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)快速检测方法,以荧光染料SYBR Green I为指示剂,以燕麦镰孢菌(F.avenaceum)的ITS序列为目的 DNA片段,应用LAMP设计软件设计4条引物,优化LAMP反应体系和反应条件,用2%琼脂糖凝胶电泳和LAMP反应液颜色变化进行特异性和灵敏度验证,同时进行田间发病组织检测和土壤燕麦镰孢菌灵敏度验证。结果表明:优化的LAMP反应体系,最佳反应温度为65℃,反应程序为65℃下1h,80℃下20min。特异性检测结果表明,燕麦镰孢菌LAMP检测均呈黄绿色(阳性),对照和其他病原菌均呈橘色(阴性)。灵敏度验证结果表明,LAMP反应液检测灵敏度在DNA水平达到10pg·μL-1,每克土壤中检测的灵敏度为40个燕麦镰孢菌孢子。对采自甘肃省甘南州卓尼县和临潭县的20份疑似病害样本提取的DNA进行检测,其中13份为阳性,表明该技术能够有效的检测出青稞发病组织中的燕麦镰孢菌。本方法的建立与应用能为燕麦镰孢菌的检测及其青稞茎基腐病的诊断提供一种新技术。
文摘根据GenBank公布的沙门氏菌高度保守的fimY蛋白基因序列,利用Primer explorer V4软件设计4条针对沙门氏菌fimY基因的特异性引物,通过对Mg2+浓度、dNTP浓度、反应温度、反应时间、特异性、敏感性、重复性和稳定系及符合率等方面,优化LAMP各种反应条件,建立针对沙门氏菌LAMP快速诊断方法。结果表明,该方法具有较强的特异性;比PCR检测方法敏感性高100倍,对沙门氏菌的最低检出量为6.2CFU/mL;对24份样品的3次检测结果与国标法完全一致。证明建立的针对fimY蛋白基因的LAMP检测方法操作简便,特异性强,敏感性高,适用于现场检测。
