猿猴病毒40T抗原介导永生化黑素细胞对其核型、HLA-DR和hTERT表达的影响

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作者 常海 邓军 +3 位作者 郝飞 杨希川 钟白玉 叶庆佾 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期366-369,共4页

目的:观察猿猴病毒40T(SV40T)抗原介导黑素细胞(melanocyte,MC)永生化对染色体核型、人白细胞抗原-DR(humanleucocyte antigen-DR,HLA-DR)和人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表达的影响。方法:利用SV40... 目的:观察猿猴病毒40T(SV40T)抗原介导黑素细胞(melanocyte,MC)永生化对染色体核型、人白细胞抗原-DR(humanleucocyte antigen-DR,HLA-DR)和人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表达的影响。方法:利用SV40T抗原基因和真核表达载体PEGFP,经SofastTM阳离子聚合物转染至体外培养的第4代MC细胞,使其永生化,通过G418筛选,滤纸片法挑选单一克隆。对培养至第15代的永生化细胞进行染色体分析,免疫组化方法检测HLA-DR和hTERT蛋白的表达,反转录(RT)-PCR检测hTERT mRNA表达,以人黑素瘤A375细胞株为对照。结果:SV40T抗原介导的永生化黑素细胞具有正常的二倍体,HLA-DR和hTERT的表达未受影响,均为阴性,同时也未检测到hTERT mRNA的表达。结论:①转化的MC染色体为正常核型、HLA-DR的表达不受体外长期传代培养和SV40T抗原的影响;②SV40T抗原不通过上调端粒酶反转录酶活性途径介导细胞永生化,同时也说明该转化细胞不易向恶性转化。 展开更多

关键词 黑素细胞 抗原 猿猴病毒40t 人类白细胞抗原DR 人端粒酶反转录酶

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JCV病毒T抗原诱发晶状体上皮肿瘤动物模型建立 被引量：5

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作者 王建平 张梅英 +6 位作者 徐小燕 王巍 夏蒲 郑志宏 王禄增 高野康雄 郑华川 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期27-29,共3页

目的利用α-crystallin启动子构建晶状体上皮细胞中JCV T抗原表达转基因鼠,试图建立晶状体自发肿瘤动物模型。方法利用限制性内切酶BclI分离pBSK(pBluescript SK)-T抗原,BamH I同尾连接插入以pBSK为载体的α-crystallin启动子下游,通过N... 目的利用α-crystallin启动子构建晶状体上皮细胞中JCV T抗原表达转基因鼠,试图建立晶状体自发肿瘤动物模型。方法利用限制性内切酶BclI分离pBSK(pBluescript SK)-T抗原,BamH I同尾连接插入以pBSK为载体的α-crystallin启动子下游,通过NciI酶切电泳分离带有α-crystallin启动子的T抗原核酸序列后显微注射入C57BL/6J小鼠受精卵中。PCR检测转基因阳性鼠及JCV病毒T抗原拷贝数,大体和组织学观察眼球及病变组织,免疫组织化学观察T抗原、p53和β-catenin表达。结果成功构建α-crystallin JCV T抗原表达质粒,转基因阳性鼠中2号鼠(αAT-2)拷贝数最高,该鼠眼球于11个月表现出肿瘤样改变,肿瘤细胞中T抗原、p53和β-catenin呈强阳性表达。结论 JCV T抗原直接诱发晶状体上皮肿瘤动物模型建立为JCV T抗原嵌入所致上皮肿瘤提供了直接实验依据,为JCV所致上皮肿瘤发生和演进分子机理研究奠定坚实基础,同时为抗肿瘤药物筛选及基因治疗监控提供了良好的动物模型。 展开更多

关键词 JC病毒 t抗原 转基因鼠 晶状体

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经癌胚抗原重组痘苗病毒转染的树突状细胞体外诱导特异性T细胞免疫 被引量：1

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作者 吴军 王晓怀 +2 位作者 杨太成 冼江 郑文岭 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第3期256-258,共3页

目的研究人癌胚抗原重组痘苗病毒(rV-CEA)转染外周血树突状细胞(DC)后能否在体外诱导CEA特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫。方法将rV-CEA转染外周血单核细胞来源的DC后用于激发同源的T细胞,检测其对T细胞的增殖作用以及对CEA分泌性肿瘤细胞... 目的研究人癌胚抗原重组痘苗病毒(rV-CEA)转染外周血树突状细胞(DC)后能否在体外诱导CEA特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫。方法将rV-CEA转染外周血单核细胞来源的DC后用于激发同源的T细胞,检测其对T细胞的增殖作用以及对CEA分泌性肿瘤细胞的杀伤活性,并与未经rV-CEA转染的DC激发的T细胞进行比较。结果经rV-CEA转染的DC激活的T细胞对CEA分泌性肿瘤细胞具特异性杀伤作用。结论rV-CEA转染的DC可以诱导CEA特异性T细胞活性。 展开更多

关键词 树突状细胞 癌胚抗原 痘苗病毒 t淋巴细胞 细胞增值 基因转染 rV-CEA

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野生及笼养猕猴SV40T抗原基因检测方法的建立 被引量：1

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作者 唐东红 任英 +5 位作者 黄璋琼 陈谨 叶尤松 匡德宣 高家红 代解杰 《中国比较医学杂志》 CAS 2008年第3期59-63,共5页

目的建立猴外周血单核细胞SV40 DNA的PCR检测方法,对猕猴SV40 T抗原基因进行检测。方法使用PCR方法对分别来自野外(云南宁蒗71只、景东60只)及笼养猕猴(64只)的SV40大T抗原基因进行检测,同时对扩增出的阳性结果进行测序。结果在195份样... 目的建立猴外周血单核细胞SV40 DNA的PCR检测方法,对猕猴SV40 T抗原基因进行检测。方法使用PCR方法对分别来自野外(云南宁蒗71只、景东60只)及笼养猕猴(64只)的SV40大T抗原基因进行检测,同时对扩增出的阳性结果进行测序。结果在195份样本中,有4只来自野生猴样本扩增出SV40大T抗原基因(3.1%,4/131),1只来自笼养猴样本扩增出SV40大T抗原基因(1.6%,1/64)。测序结果显示:猴血样本扩增片段序列与GenBank中的SV40大T抗原C-末端的基因序列片段有15个核苷酸不同(3.3%差异),与SV40-776标准株的序列基本一致,但SV40-776在nt3020处有一缺口。结论云南野生及笼养猕猴猴群均能检出SV40 T抗原基因。因此建立SV40病毒的DNA检测技术,对用于科研及疫苗生产的实验猕猴的病毒学质量控制具有重要意义。 展开更多

关键词 猕猴 猴肉瘤病毒 t抗原基因 PCR扩增

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辅助性T细胞表位HBV表面抗原融合基因真核表达质粒的构建

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作者 唐彤宇 朴云峰 +1 位作者 王峰 牛俊奇 《临床肝胆病杂志》 CAS 北大核心 2003年第5期288-289,共2页

为提高HBVDNA疫苗的免疫效率,将一个通用型辅助性T细胞表位基因引入HBV表面抗原基因的5’末端,构建成真核表达质粒。PCR方法合成PADRE-HBsAg目的基因,产物与pMD18T载体连接,经HindⅢ,EcoRI双酶切,再克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)。酶... 为提高HBVDNA疫苗的免疫效率,将一个通用型辅助性T细胞表位基因引入HBV表面抗原基因的5’末端,构建成真核表达质粒。PCR方法合成PADRE-HBsAg目的基因,产物与pMD18T载体连接,经HindⅢ,EcoRI双酶切,再克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)。酶切及测序鉴定,该真核表达载体构建成功,为进一步观察其特异性细胞和体液免疫反应奠定了基础。 展开更多

关键词 辅助性t细胞表位 HBV 表面抗原 融合基因 真核表达质粒 乙型肝炎病毒

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CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达

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作者 马会慧 陆才生 +4 位作者 陈雪娟 高志良 李刚 杨绍基 姚集鲁 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第B03期157-159,共3页

【目的】构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达。【方法】分离人外周血单个核细胞，提取细胞总RIgA，经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区（含绞链区-CH2-CH3）基因片段。将PCR... 【目的】构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达。【方法】分离人外周血单个核细胞，提取细胞总RIgA，经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区（含绞链区-CH2-CH3）基因片段。将PCR产物克隆入pCDNA3，阳性重组子以双酶切和测序鉴定。将目的基因CTLA4-Ig亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183，经细菌内同源重组构建重组腺病毒载体。采用脂质体法转染293细胞包装产生重组腺病毒，进一步感染HepG2细胞，采用RT-PCR及ELISA测定CTLA4Ig表达情况。【结果】构建了表达人CTLA4Ig基因的重组腺病毒，病毒滴度可达6×10^9pfu／mL，并能在HepG2和骨髓间充质干细胞中表达CTLA4Ig。【结论】成功构建表达CTLA4Ig的重组腺病毒载体，为进一步研究肝细胞移植排异及自身免疫性疾病的免疫调节治疗提供有力的手段与工具。 展开更多

关键词 细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白 腺病毒 载体 基因表达

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噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

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作者 田栢会 易乐 +8 位作者 王习文 李颂 付世杰 王雨田 曲晗 李志萍 王丽萍 张淑华 夏志平 《吉林大学学报（理学版）》 CAS 北大核心 2019年第4期989-996,共8页

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库.首先,从GeneBank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因,将其截短、修饰、简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列.其次,将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、酶切,链接... 构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库.首先,从GeneBank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因,将其截短、修饰、简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列.其次,将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、酶切,链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上,构成重组噬菌体DNA.最后,重组噬菌体DNA经体外包装和扩增,得到T7噬菌体展示文库,并进行T7噬菌体展示文库滴度、重组率和免疫活性测定.实验结果表明,从Gene Bank中查找、筛选、剪切和修饰共获得96258条序列构建T7噬菌体展示文库,原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL,重组率大于90%.用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获,经聚合酶链式反应(PCR)鉴定,得到理想目的条带,证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性,可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选。 展开更多

关键词 t7噬菌体 噬菌体展示 禽流感病毒 抗原变异性基因 文库鉴定

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口蹄疫病毒VP1基因C末端串连表达及其抗体ELISA方法的初步建立 被引量：1

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作者 彭贵青 陈焕春 +3 位作者 钱平 李祥敏 洪琦 顾贫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期670-674,共5页

口蹄疫病毒主要免疫原性基因VP1的B细胞和T细胞抗原表位位于其C末端,参照Taiwanse97(AJ294928)设计了1对特异性引物,扩增出VP1基因C末端。序列分析表明:其C末端长285bp,编码74个氨基酸,与O/HKN/12/91、O/PEN/TAW/99核苷酸和氨基酸同源... 口蹄疫病毒主要免疫原性基因VP1的B细胞和T细胞抗原表位位于其C末端,参照Taiwanse97(AJ294928)设计了1对特异性引物,扩增出VP1基因C末端。序列分析表明:其C末端长285bp,编码74个氨基酸,与O/HKN/12/91、O/PEN/TAW/99核苷酸和氨基酸同源性分别为95%、93%和96%、93%;利用同尾酶Xho 、Sal 将VP1基因C末端串连起来;再将单拷贝和双拷贝C末端基因插入到原核表达载体pGEX-KG后,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得表达,经Westernblot检测证实表达产物具有活性。以表达产物包被ELISA板,初步建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。同时用表达产物免疫Balb/c小鼠,能产生一定的抗O型口蹄疫病毒的抗体。 展开更多

关键词 抗体 表达产物 末端 ELISA方法 VP1基因 t细胞抗原 表位 口蹄疫病毒 O型口蹄疫 特异性引物

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HIV-1_(CN)嵌合基因与IL-2基因共表达产物诱导产生CTL的实验研究

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作者 郭焱 郭巍 张学英 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2001年第2期51-51,55,共2页

经脂质体介导共表达中国流行株HIV 1gag gp12 0基因与IL 2基因的核酸疫苗质粒 pGPIL 2转染BHK 2 1细胞 ,以间接免疫荧光法鉴定其表达。取 pGPIL 2免疫鼠脾细胞 ,检测 pGPIL 2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性。杀伤实验结果证明 ,经基因免... 经脂质体介导共表达中国流行株HIV 1gag gp12 0基因与IL 2基因的核酸疫苗质粒 pGPIL 2转染BHK 2 1细胞 ,以间接免疫荧光法鉴定其表达。取 pGPIL 2免疫鼠脾细胞 ,检测 pGPIL 2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性。杀伤实验结果证明 ,经基因免疫获得的CTL效应细胞 ,可杀伤HIV 1CN嵌合基因转染的靶细胞。提示pGPIL 2可有效诱导CTL的产生 ,该研究结果为进一步设计中国流行株HIV 1核酸疫苗提供了重要实验依据。 展开更多

关键词 嵌合基因 IL-2基因 细胞毒性t细胞 HIV病毒 抗原蛋白

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Cre/LoxP系统联合SV40 LTag诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立 被引量：2

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作者 李晓航 张佳林 +5 位作者 康铁利 李乐 程颖 石蕊 赵宁 刘永锋 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期979-982,共4页

目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体(SSR69)转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞;用表达Cre重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,... 目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体(SSR69)转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞;用表达Cre重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞。对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力。免疫荧光染色检测Vimentin在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性。结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞(P<0.05),在体外培养传代>25代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异(P>0.05),无致瘤性。结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系。 展开更多

关键词 永生化 猿猴病毒大t抗原基因 Cre/LoxP位点特异性重组酶系统

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表达hTERT及SV40T永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立 被引量：5

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作者 上官陶 王洪梅 +2 位作者 冯敏燕 仲跻峰 何洪彬 《山东农业科学》 2013年第2期1-4,共4页

构建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T载体,线性化后,共转染荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞,研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40 T)对荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养的作用,并对细胞进行RT-PCR检测分析及免疫荧光鉴定。结... 构建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T载体,线性化后,共转染荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞,研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40 T)对荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养的作用,并对细胞进行RT-PCR检测分析及免疫荧光鉴定。结果表明,hTERT和SV40 T在奶牛乳腺上皮细胞中表达可以有效地延长细胞的体外培养时间,增加细胞传代次数,获得的细胞系可以正常表达角蛋白。说明在体外培养的乳腺细胞中共表达hTERT和SV40 T可以有效延长细胞寿命且不影响乳腺细胞特性。 展开更多

关键词 荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞 永生化 端粒酶 猿猴空泡病毒40大t抗原

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禽痘病毒载体疫苗研究进展 被引量：2

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作者 黄兵 王莉莉 《家禽科学》 2005年第12期40-42,共3页

关键词 禽痘病毒 载体疫苗 体外生产 抗原基因 接种方法 外源DNA 生物学领域 功能化研究 t细胞反应 免疫抵抗力

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血管瘤内皮细胞增殖机制的初步研究 被引量：1

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作者 代晓明 李龙江 +4 位作者 温玉明 王昌美 刘华 张义正 邓尹琳 《实用口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期290-294,共5页

目的 :探讨血管瘤内皮细胞活跃增生与猿猴病毒 40大T抗原、端粒酶活性表达及端粒长度变化的关系 ,明确血管瘤发病的相关机制。方法 :应用免疫组化、基于逆转录聚合酶链反应的端粒重复末端扩增分析法及端粒限制性片段分析化学发光、原位... 目的 :探讨血管瘤内皮细胞活跃增生与猿猴病毒 40大T抗原、端粒酶活性表达及端粒长度变化的关系 ,明确血管瘤发病的相关机制。方法 :应用免疫组化、基于逆转录聚合酶链反应的端粒重复末端扩增分析法及端粒限制性片段分析化学发光、原位杂交法检测血管瘤、鳞状细胞癌、人胚肾内皮细胞的猿猴病毒 40大T抗原、端粒酶活性表达及端粒长度变化。结果 :5 4%和 45 %的血管瘤中分别检出端粒酶、猿猴病毒 40大T抗原的表达 ,猿猴病毒 40大T抗原阳性内皮细胞散在分布。血管瘤端粒长度位于 6.8～ 13 .2kb之间。结论 :猿猴病毒 40对血管内皮细胞的作用与血管瘤的发生有关 ;血管瘤端粒酶活性高于一般良性肿瘤 。 展开更多

关键词 血管瘤 增生 猿猴病毒40大t抗原 端粒酶 端粒长度

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