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猪表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及其生物活性研究
1
作者 周鑫鑫 郭莹莹 +4 位作者 肖运才 王金硕 周祖涛 刘华珍 石德时 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期2823-2836,共14页
【目的】构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的乳酸乳球菌原核表达系统,并探究其对断奶仔猪腹泻的影响。【方法】以pUC57-SP45-LEISSTCDA-pEGF序列为模板,利用PCR扩增获得缺失LEISSTCDA片段的融合产物,将其与酶切pNZ8149表达载体连接后电转... 【目的】构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的乳酸乳球菌原核表达系统,并探究其对断奶仔猪腹泻的影响。【方法】以pUC57-SP45-LEISSTCDA-pEGF序列为模板,利用PCR扩增获得缺失LEISSTCDA片段的融合产物,将其与酶切pNZ8149表达载体连接后电转至乳酸乳球菌NZ3900,以LacF为筛选标记获得重组菌pEGF-NZ。用nisin诱导重组菌pEGF-NZ表达重组蛋白pEGF,并通过Tricine-SDS-PAGE检测其表达情况。改良实验室及工业发酵条件以提高pEGF表达量。利用猪回肠上皮细胞(IPEC-J2)增殖试验体外验证表达的pEGF生物活性。通过动物试验验证重组蛋白pEGF对小鼠及断奶仔猪腹泻的影响。【结果】试验成功构建重组菌pEGF-NZ,并分泌表达pEGF蛋白。体外试验结果显示,pEGF蛋白能促进细胞增殖。pEGF-NZ重组菌及其表达的pEGF蛋白能延缓小鼠腹泻发生时间,降低腹泻率,保护小鼠肠绒毛的完整性。与对照组相比,pEGF-NZ重组菌处理后,小鼠结肠中乳酸菌数显著增加(P<0.05),大肠杆菌数、肠球菌数显著降低(P<0.05),白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β含量显著降低(P<0.05),IL-13含量显著升高(P<0.05)。饲粮中添加pEGF-NZ重组菌后,断奶仔猪腹泻情况明显缓解,平均日增重有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。【结论】pEGF-NZ重组菌及其分泌表达的pEGF能够修复肠道屏障,抑制病原菌黏附,调控肠道菌群,其主要通过下调部分促炎因子、上调抑炎因子表达发挥抑炎效果,从而保护断奶仔猪肠道健康,有效缓解腹泻。 展开更多
关键词 乳酸乳球菌 pEGF-NZ重组菌 猪表皮生长因子(pEGF)
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猪表皮生长因子在大肠杆菌中的表达 被引量：6
2
作者 杨桂香 黄伟华 彭险峰 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期90-93,共4页
采用RT-PCR方法从猪肾脏皮质组织中扩增出pEGF基因,将其连接到克隆载体pMD18-T上,经测序鉴定正确后,再克隆到原核表达载体pET-41 a(+)上,构建重组表达质粒pET-EGF.用重组质粒转化E.coliBL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电... 采用RT-PCR方法从猪肾脏皮质组织中扩增出pEGF基因,将其连接到克隆载体pMD18-T上,经测序鉴定正确后,再克隆到原核表达载体pET-41 a(+)上,构建重组表达质粒pET-EGF.用重组质粒转化E.coliBL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳和W estern-b lotting对GST-EGF融合蛋白进行分析,结果表明37℃诱导表达的融合蛋白含量较高,占菌体总蛋白的20.2%;30℃诱导表达的可溶性融合蛋白含量较高,占菌体总蛋白的7.7%. 展开更多
关键词 猪表皮生长因子 原核表达 Westem-blotting
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重组毕赤酵母高密度发酵表达猪表皮生长因子及其纯化鉴定 被引量：2
3
作者 焦晓军 黄显会 +1 位作者 刘帅帅 谭清甜 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期103-107,共5页
采用高密度发酵法在5.5 L发酵罐中对pPIC9-pEGF/GS115重组毕赤酵母Pichia pastoris菌株进行发酵,在培养至酵母菌体密度(D600 nm)约150时,以甲醇诱导目的蛋白表达,48 h后菌体密度达315,目的蛋白表达产量约300 mg/L.发酵上清液经0.45μm... 采用高密度发酵法在5.5 L发酵罐中对pPIC9-pEGF/GS115重组毕赤酵母Pichia pastoris菌株进行发酵,在培养至酵母菌体密度(D600 nm)约150时,以甲醇诱导目的蛋白表达,48 h后菌体密度达315,目的蛋白表达产量约300 mg/L.发酵上清液经0.45μm和截留相对分子质量30 000的超滤膜、亲和层析、透析后目的产物的纯度达90%以上.鉴定结果表明:纯化的表达产物pEGF对BALB/c 3T3细胞具有显著的增殖作用. 展开更多
关键词 猪表皮生长因子 毕赤酵母 高密度发酵 纯化 生物活性
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猪表皮生长因子真核表达产物的体外活性试验 被引量：2
4
作者 张万江 王秀梅 +1 位作者 吴波浪 杨桂香 《动物医学进展》 CSCD 2008年第4期31-34,共4页
为建立一种快速检测猪表皮生长因子(pEGF)活性的方法,用本实验室构建的pEGF酵母表达载体进行摇瓶培养,通过鉴定为所需要的目的蛋白,用pEGF为添加物培养Balbc/3T3细胞,以pEGF浓度为横坐标,吸光度为纵坐标建立曲线。结果表明,理想的接种... 为建立一种快速检测猪表皮生长因子(pEGF)活性的方法,用本实验室构建的pEGF酵母表达载体进行摇瓶培养,通过鉴定为所需要的目的蛋白,用pEGF为添加物培养Balbc/3T3细胞,以pEGF浓度为横坐标,吸光度为纵坐标建立曲线。结果表明,理想的接种细胞的个数为5 000个/孔,细胞计数试剂盒(CCK-8)孵育的最佳时间为1.5 h,pEGF和人表皮生长因子(hEGF)标准品,在1 ng/mL^100 ng/mL范围内对细胞的增值作用相当,表明pEGF和hEGF有相同的生物学活性。建立了用CCK-8快速测定pEGF活性的方法。 展开更多
关键词 猪表皮生长因子 生物活性 体外CCK-8
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猪表皮生长因子间接竞争ELISA检测方法的建立 被引量：2
5
作者 张万江 王秀梅 杨桂香 《动物医学进展》 CSCD 2008年第3期25-28,共4页
为建立酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测猪血清或尿液中猪表皮生长因子(porcinee pidermal growth factor,pEGF)的含量,以pEGF为包被原,人表皮生长因子(hu-mane pidermal growth factor,hEGF)为竞争抗原... 为建立酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测猪血清或尿液中猪表皮生长因子(porcinee pidermal growth factor,pEGF)的含量,以pEGF为包被原,人表皮生长因子(hu-mane pidermal growth factor,hEGF)为竞争抗原,两者与一定量的抗pEGF多抗反应。结果表明,理想的包被抗原浓度为0.625μg/mL,抗pEGF工作浓度为1∶64000,酶标二抗工作浓度为1∶20000,可检测的最适范围为0.4ng/mL^32ng/mL,最低检测限为1ng/mL,批内和批间变异系数分别为3.50%和5.22%。得到回归方程y=-34.53x+76.06(R2=0.993)和标准曲线,从而建立了快速定量测定pEGF含量的酶联免疫吸附试验方法。 展开更多
关键词 猪表皮生长因子 多克隆抗体 间接竞争ELISA
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重组猪表皮生长因子对早期断奶仔猪生长性能的影响 被引量：7
6
作者 王勇飞 段叶辉 +1 位作者 夏连喜 陈福华 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期3787-3792,共6页
本试验旨在研究重组猪表皮生长因子(porcine epidermal growth factor,p EGF)对早期断奶仔猪生长性能的影响。选用21日龄断奶三元杂交(杜×长×大)健康仔猪160头,按体重相近、性别比例相同原则随机分成4组,即高档教槽料+500μg/... 本试验旨在研究重组猪表皮生长因子(porcine epidermal growth factor,p EGF)对早期断奶仔猪生长性能的影响。选用21日龄断奶三元杂交(杜×长×大)健康仔猪160头,按体重相近、性别比例相同原则随机分成4组,即高档教槽料+500μg/kg p EGF组(GE组)、高档教槽料对照组(GD组)、中档教槽料+500μg/kg p EGF组(ZE组)、中档教槽料对照组(ZD组),每组4个重复,每个重复10头仔猪。试验期为10 d。结果表明:1)GE组平均日增重显著高于GD组(P<0.05),比GD组提高了6.29%;ZE组平均日增重极显著高于ZD组(P<0.01),比ZD组提高了17.08%;2)GE组平均日采食量与GD组无显著差异(P>0.05),ZE组平均日采食量显著高于ZD组(P<0.05),比ZD组提高了4.91%;3)GE组料重比显著低于GD组(P<0.05),比GD组降低了4.31%;ZE组料重比显著低于ZD组(P<0.05),比ZD组降低了10.37%;4)GE组腹泻率比GD组降低了57.14%;ZE组腹泻率比ZD组降低了38.46%。由此可见,饲粮添加p EGF提高了饲料转化率,降低了料重比和腹泻率,从而显著改善断奶仔猪生长性能,降低增重成本。 展开更多
关键词 重组猪表皮生长因子 早期断奶仔猪 生长性能
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猪表皮生长因子的原核表达及纯化
7
作者 刘庭 汤慧 +6 位作者 唐青海 刘莎 薛姣雄 吴广艳 马洁 赵婷芳 唐斯萍 《湖南畜牧兽医》 2022年第2期45-50,共6页
[目的]:提高重组猪表皮生长因子(pEGF)的表达量和纯化量,为后续研究pEGF对仔猪生长发育的影响奠定基础。[方法]:将人工合成的pEGF基因克隆至pEGF4T-1载体,转化至大肠杆菌Rossetta(DE3)中,得到重组菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF,IPTG诱导... [目的]:提高重组猪表皮生长因子(pEGF)的表达量和纯化量,为后续研究pEGF对仔猪生长发育的影响奠定基础。[方法]:将人工合成的pEGF基因克隆至pEGF4T-1载体,转化至大肠杆菌Rossetta(DE3)中,得到重组菌株Rossetta(DE3)-pGEX-pEGF,IPTG诱导表达,进行表达条件的优化,用GST-tag亲和层析纯化方法进行纯化。[结果]:pEGF基因大小为159 bp,融合表达蛋白分子量为32k Da,最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.01mmol/L、诱导温度15℃和诱导时间24h。流穿液和洗涤液中目的蛋白含量极少,洗脱液得到了高纯度的GST-pEGF融合蛋白,纯化较为成功。[结论]:成功构建了pEGF表达菌株,得到了最优的诱导表达条件和最优的纯化工艺,为pEGF相关产品的开发以及应用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪表皮生长因子 诱导表达 GST标签 蛋白纯化 条件优化 融合表达
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芽孢表面展示pEGF重组枯草杆菌对小鼠生长、肠道发育和消化酶活性研究
8
作者 费丽茹 陈彬 +5 位作者 胡正茂 洋赐 张丹 但鑫瑶 吴乐鹏 潘康成 《四川农业大学学报》 北大核心 2025年第2期469-478,共10页
【目的】构建一株在芽孢表面展示猪表皮生长因子(pEGF)的重组枯草芽孢杆菌,并评估其在小鼠体内的生物活性。【方法】设计得到肠激酶识别位点和pEGF串联基因序列(dkEGF),以CotB作为锚定原件构建了整合质粒pDG364-CotB-dkEGF。通过同源重... 【目的】构建一株在芽孢表面展示猪表皮生长因子(pEGF)的重组枯草芽孢杆菌,并评估其在小鼠体内的生物活性。【方法】设计得到肠激酶识别位点和pEGF串联基因序列(dkEGF),以CotB作为锚定原件构建了整合质粒pDG364-CotB-dkEGF。通过同源重组,获得1株在芽孢表面展示pEGF的重组枯草芽孢杆菌dkEGF,评估其对小鼠生长、肠道发育及肠道消化酶活性的影响。【结果】通过拌料饲喂重组枯草杆菌的芽孢,能够在小鼠血清内检测到高水平的pEGF;提高小鼠的生长性能,增加肠道长度;极显著增加肠绒毛高度、降低隐窝深度和提高绒隐比(P<0.01),显著提高回肠组织紧密连接蛋白mRNA相对表达量(P<0.05);显著提高肠道消化酶活性(P<0.05)。【结论】成功构建的重组枯草芽孢杆菌dkEGF可促进小鼠生长、肠道发育,提高消化酶活性和维护肠道黏膜屏障方面发挥着有效作用。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 芽孢表面展示 猪表皮生长因子 生长性能 肠道健康 小鼠
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分泌表达pEGF的重组酿酒酵母在断奶仔猪上的应用研究 被引量：8
9
作者 王蜀金 王斌星 +4 位作者 郭春华 柏雪 彭忠利 张正帆 周琳 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期944-954,共11页
本研究对分泌表达pEGF的重组酿酒酵母在断奶仔猪日粮中的应用效果进行验证。72头21~24日龄的断奶仔猪((6.10±0.15)kg),随机分为3组(每组4个重复,每个重复6头):对照组(基础日粮+228mL·kg^(-1)空白培养液)、空载体组(基础日粮+2... 本研究对分泌表达pEGF的重组酿酒酵母在断奶仔猪日粮中的应用效果进行验证。72头21~24日龄的断奶仔猪((6.10±0.15)kg),随机分为3组(每组4个重复,每个重复6头):对照组(基础日粮+228mL·kg^(-1)空白培养液)、空载体组(基础日粮+228mL·kg^(-1)空载体)及重组酵母组(基础日粮+228mL·kg^(-1) INVSc1(pYES2-Mfα-spEGF))。21d后,每组每栏选取1头仔猪屠宰,分别测定其小肠组织形态、小肠黏膜中IgA、IgG及IgM水平,碱性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)的酶活力及mRNA转录水平,小肠黏膜中表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGF-R)的mRNA转录水平。结果表明,与对照组及空载体组相比,重组酵母组INVSc1(pYES2-Mfα-spEGF)能够显著提高断奶仔猪小肠各段(十二指肠、空肠及回肠)黏膜中EGF-R及消化酶(ALP、CK及LDH)的mRNA转录水平(P<0.05),极显著提高CK和LDH的酶活力(P<0.01),显著促进其空肠及回肠黏膜中IgA、IgG及IgM水平(P<0.05),提高其平均日增重(ADG)及降低F/G(P<0.05)。综上,本研究获得的重组酿酒酵母INVSc1(pYES2-Mfα-spEGF)表达的EGF蛋白具有较高的生物学活性,能明显促进断奶仔猪小肠黏膜发育及其免疫功能,具有向养猪生产进一步转化的开发价值。 展开更多
关键词 猪表皮生长因子 酿酒酵母 断奶仔猪 肠道发育 免疫功能
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