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副猪嗜血杆菌对猪腹膜间皮细胞系损伤作用的体外试验
1
作者 李晓敏 田俊可 +3 位作者 陆启荣 邱银生 郭璞 刘宇 《饲料工业》 北大核心 2025年第14期106-111,共6页
试验旨在研究副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)对猪腹膜间皮细胞系的细胞损伤作用,进一步阐明猪腹膜炎的发病机制。采用猪腹膜间皮永生化细胞系(SV40T-PPMCs)为试验材料,分为空白组和GPS组,应用qRT-PCR和Western blotting方法检... 试验旨在研究副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)对猪腹膜间皮细胞系的细胞损伤作用,进一步阐明猪腹膜炎的发病机制。采用猪腹膜间皮永生化细胞系(SV40T-PPMCs)为试验材料,分为空白组和GPS组,应用qRT-PCR和Western blotting方法检测GPS感染对腹膜间皮细胞炎症、细胞凋亡、紧密连接和黏附连接相关基因及蛋白质表达的影响。结果表明:GPS组的炎性相关白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等基因和IL-6、IL-1β、TNF-α、环氧合酶-2(COX-2)等蛋白质的表达水平高于空白组(P<0.05),细胞凋亡相关Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶3剪切体(Cleaved Caspase3)等蛋白质表达水平显著高于空白组(P<0.01);GPS组的B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白质表达水平低于空白组(P<0.05);GPS组的紧密连接相关胞质紧密黏连蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白-1(Claudin-1)等基因和蛋白质的表达水平以及黏附连接主要组成成分E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达水平显著低于空白组(P<0.05)。说明GPS感染会造成SV40T-PPMCs的炎性损伤、细胞凋亡、紧密连接和黏附连接损伤,腹膜间皮细胞参与猪腹膜炎的发生和发展。 展开更多
关键词 猪腹膜间皮细胞永生化细胞系 副猪嗜血杆菌 细胞损伤 猪腹膜炎 发病机制
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CD163单等位基因表达的iPAMs细胞系的构建及其介导PRRSV感染的特征分析 被引量：1
2
作者 王慧 冯保亮 +4 位作者 向光明 黄雷 刘志国 李奎 牟玉莲 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2617-2628,共12页
【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得CD 163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine r... 【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得CD 163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的特征,为深入研究CD 163基因在PRRSV感染中的作用机制奠定基础。【方法】在猪CD 163基因外显子1区域设计8条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接到pX458载体中,通过T7E1酶切试验检测不同sgRNA载体的活性;将活性较高的3条sgRNAs表达载体电转染到iPAMs中,通过流式细胞术分选单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定、蛋白表达检测、脱靶分析以及PRRSV感染分析。【结果】在设计的8条sgRNAs中有3条基因编辑效率在28%以上。基因型鉴定结果表明,50株片段敲除的单克隆细胞中有4株符合预期的CD 163单等位基因表达的iPAMs,效率为8%。蛋白表达检测和脱靶分析结果显示,CD 163单等位基因表达的iPAMs中CD163蛋白表达量显著下降(P<0.05),且在预测位置未发生脱靶现象。PRRSV感染分析显示,CD 163单等位基因表达的iPAMs可以正常感染PRRSV,病毒拷贝数和PRRSV-N蛋白表达量与野生型细胞无显著差异(P>0.05)。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统构建了可以正常感染PPRSV的CD 163单等位基因表达的iPAMs,为阐明CD163在猪繁殖与呼吸综合征传染病中所起的作用以及培育抗病猪新品种奠定了基础。 展开更多
关键词 CD163 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) CRISPR/Cas9 永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs)
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CD163基因敲除iPAMs的构建及其感染PRRSV的特征分析
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作者 董泽霞 林鑫 +5 位作者 周期律 王楠 黄雷 刘志国 冯政 牟玉莲 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3471-3483,共13页
[目的]获得分化抗原163(cluster of differentiation 163,CD163)基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and r... [目的]获得分化抗原163(cluster of differentiation 163,CD163)基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵过程中的作用。[方法]将靶向CD 163基因第7外显子的sgRNA质粒(pX330-sgCD163)转染至iPAMs,转染48 h后通过有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型鉴定,通过Western blotting和脱靶分析来筛选CD 163基因敲除的iPAMs;通过实时荧光定量PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和半数细胞培养物感染量(50%tissue culture infective dose,TCID 50)等试验分析CD 163基因敲除的iPAMs感染PRRSV的特征。[结果]测序结果表明,100株单克隆细胞中有1株CD 163双等位基因敲除的iPAMs,敲除效率为1%;Western blotting结果显示,CD 163基因敲除的iPAMs中检测不到CD163蛋白的表达,且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。实时荧光定量PCR结果表明,与野生型iPAMs组相比,CD 163基因敲除的iPAMs组病毒拷贝数极显著降低(P<0.01);Western blotting和IFA结果表明,在接毒24 h后的CD 163基因敲除的iPAMs组中未检测到PRRSV-N蛋白的表达;TCID 50试验结果同样显示,在CD 163基因敲除的iPAMs组中未观察到细胞病变。[结论]本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了CD 163基因敲除的iPAMs,该细胞系可以完全抵抗PRRSV感染。该细胞系的建立为后续研究PRRSV与CD163蛋白的互作机制提供了新型试验材料。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 CD 163基因 永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs) 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)
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