适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建 被引量：5

1

作者 罗维 赵墩 +1 位作者 蒋大良 余兴龙 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期404-408,共5页

为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A1... 为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第2轮细胞克隆,之后用同步接种法和异步接种法将PCV2感染A10细胞,并检测A10细胞接毒后的PCV2 DNA含量,2种接毒方法获得的最高PCV2基因组的拷贝数分别为3.0×109、6.2×109/mL,高于用PK15混合细胞培养PCV2所获得的最高PCV2基因组拷贝数(107/mL)。综合以上结果,构建的PK15均质细胞克隆株比PK15混合细胞更适合PCV2的培养。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2(PCV2) pk15细胞 细胞克隆 定量PCR 同步接毒 异步接毒

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猪肾上皮细胞SLA-1基因的克隆及分子结构特征分析

2

作者 王宝宝 金行 +2 位作者 鲜钰涵 冯宏盛 高凤山 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1671-1678,共8页

【目的】利用猪肾上皮细胞15(PK15)建立系统的猪白细胞抗原1(SLA-1)抗原表位筛选系统。【方法】提取PK15细胞总RNA,设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增SLA-1基因(SLA-1*PK15),将该基因克隆到pMD18-T载体上,并进行双酶切及测序鉴定;利用D... 【目的】利用猪肾上皮细胞15(PK15)建立系统的猪白细胞抗原1(SLA-1)抗原表位筛选系统。【方法】提取PK15细胞总RNA,设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增SLA-1基因(SLA-1*PK15),将该基因克隆到pMD18-T载体上,并进行双酶切及测序鉴定;利用DNAMAN 5.2.2、Mega 5.0、Multalin及同源建模进行系统进化树、二级结构、三级结构分析。【结果】RT-PCR扩增获得约1400 bp条带,质粒提取和酶切鉴定结果表明SLA-1成功插入pMD18-T载体;测序结果证实该基因共1419 bp,其中2-1087 bp为编码区,共编码361个氨基酸,信号肽为21个氨基酸,符合SLA-1基因特征。进化树分析结果显示,SLA-1*PK15与SLA-1*wxd(中国梅山猪)和SLA-1*0401(中国巴马小型猪)进化关系最近,而与SLA-1*lr02(丹麦长白猪)及SLA-1*0509(中国西藏野猪)进化关系较远。胞外区氨基酸比较分析表明,PK15细胞SLA-1基因与其他SLA-1基因胞外区主要变异位点存在于α1区和α2区,α3区的变异位点较少,无特征性氨基酸变异位点。PK15细胞SLA-1蛋白的二级结构主要以α-螺旋和β-折叠为主。同源建模结果显示,SLA-1蛋白具有SLA classⅠ典型的三级结构,α1区和α2区构成抗原多肽结合区。【结论】SLA-1基因稳定存在于PK15细胞,PK15细胞具有作为SLA-1抗原表位筛选系统的潜在应用价值。 展开更多

关键词 猪肾上皮细胞15(pk15) 猪白细胞抗原1(SLA-1) 克隆 生物信息学分析 同源模建

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猪细小病毒在PK15细胞中增殖规律的研究 被引量：15

3

作者 倪娇 赵建增 +2 位作者 刘长辉 邢海云 赵亚荣 《中国兽药杂志》 2009年第1期21-24,共4页

猪细小病毒毒株在不同细胞系上的生长情况不尽相同,如不能掌握其规律,将难以生产出优质的疫苗。对PPV(长春株)在PK15和ST细胞上生长情况进行了研究,在PK15细胞系中重点比较了不同的病毒接种方法、病毒接种量和病毒收获时间等因素对病毒... 猪细小病毒毒株在不同细胞系上的生长情况不尽相同,如不能掌握其规律,将难以生产出优质的疫苗。对PPV(长春株)在PK15和ST细胞上生长情况进行了研究,在PK15细胞系中重点比较了不同的病毒接种方法、病毒接种量和病毒收获时间等因素对病毒产量的影响。研究结果显示:本毒株在PK15和ST两种细胞系上的病变特征不同,但生长规模相似。在PK15细胞上按2%接种量、分步接种、80 h时收获病毒,最终得到的病毒滴度(TCID50)最高。提示这是一种比较好的生产方案。然而,进一步的大规模培养试验是有必要的。 展开更多

关键词 猪细小病毒 pk15细胞 增殖规律

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猪RPL36A基因对PK15细胞增殖过程的影响

4

作者 王首元 贠红梅 +5 位作者 史明月 秦云梦 李熊 陈军舟 周琛帛 曹果清 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3035-3044,共10页

【目的】探究核糖体蛋白L36A(ribosomal protein L36A,RPL36A)基因对PK15细胞增殖过程的影响,为解析马身猪和大白猪生长速度差异的生理机制奠定基础。【方法】采用脂质体法将RPL 36 A基因干扰和过表达载体转染至PK15细胞中,通过实时荧... 【目的】探究核糖体蛋白L36A(ribosomal protein L36A,RPL36A)基因对PK15细胞增殖过程的影响,为解析马身猪和大白猪生长速度差异的生理机制奠定基础。【方法】采用脂质体法将RPL 36 A基因干扰和过表达载体转染至PK15细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测RPL 36 A基因表达效率及细胞增殖标志基因(PCNA、Ki67、Cyclin B、CDK4)的表达变化,并通过划痕试验、CCK-8和EdU法检测细胞增殖情况。【结果】过表达RPL 36 A基因后,PK15细胞中PCNA、Ki 67、CDK 4基因mRNA表达量均极显著升高(P<0.01),Cyclin B基因mRNA表达量显著升高(P<0.05);PCNA蛋白表达量显著升高(P<0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量极显著高于空载组(P<0.01),细胞增殖速度升高;阳性细胞数极显著升高(P<0.01)。干扰RPL 36 A基因后,PK15细胞中PCNA、Cyclin B基因mRNA表达量均极显著降低(P<0.01),Ki 67、CDK 4基因mRNA表达量均显著降低(P<0.05);PCNA蛋白表达量显著降低(P<0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量显著低于对照组(P<0.05),细胞增殖速度降低;阳性细胞数极显著降低(P<0.01)。【结论】在PK15细胞中过表达和干扰RPL 36 A基因后,细胞增殖关键基因PCNA、Ki 67、Cyclin B、CDK 4的表达量及48 h的细胞数量和阳性细胞数均有显著变化,RPL 36 A基因可影响PK15细胞的增殖过程。 展开更多

关键词 猪 RPL 36 A基因 pk15细胞 过表达 干扰 细胞增殖

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无血清全悬浮PK15细胞培养猪圆环病毒2型的研究 被引量：1

5

作者 刘天伦 《中国兽药杂志》 2022年第1期1-6,共6页

为改进猪圆环病毒2型的培养工艺,驯化了一株可无血清培养的全悬浮PK15细胞用于培养猪圆环病毒2型,并对病毒的敏感性、接毒时间、接毒量、收获方法进行了试验。结果表明,用该细胞培养猪圆环病毒2型,如果采用批次收获,接毒时细胞密度为0.5... 为改进猪圆环病毒2型的培养工艺,驯化了一株可无血清培养的全悬浮PK15细胞用于培养猪圆环病毒2型,并对病毒的敏感性、接毒时间、接毒量、收获方法进行了试验。结果表明,用该细胞培养猪圆环病毒2型,如果采用批次收获,接毒时细胞密度为0.5×10^(6)/mL,接毒量为0.1 MOI,接毒72 h后收毒,病毒滴度能达到10^(6.4)TCID_(50)/mL;如果采用连续收获,接毒和带毒传代时均使细胞密度为0.5×10^(6)/mL,接毒量为0.04 MOI,收毒时间为接毒后72 h,连续收获三次,病毒滴度分别为10^(6.0)TCID_(50)/mL、10^(6.25)TCID_(50)/mL、10^(6.5)TCID_(50)/mL,病毒滴度和收获液体积较为理想,可为大规模培养猪圆环病毒2型提供参考。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 pk15细胞 全悬浮 无血清 连续收获

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猪miR-22前体上游序列突变的PK15细胞系构建

6

作者 丁兆雪 王佳洁 +5 位作者 沈中浩 周晓龙 杨松柏 金航峰 赵阿勇 汪涵 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2022年第9期1849-1855,共7页

猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgR... 猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2;随后将重组质粒转染猪肾上皮细胞系(PK15),经嘌呤霉素初步筛选后,提取基因组DNA,通过PCR及测序鉴定编辑效果;最后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测编辑前后miR-22相对表达量的变化。结果显示,81个阳性克隆中,共产生6种突变类型,突变率达60.49%;qRT-PCR检测显示,编辑后miR-22的表达量显著下调约50%。本研究成功获得了miR-22前体上游序列突变的猪PK15细胞模型,为今后猪miR-22的功能研究提供了新的可应用研究对象。 展开更多

关键词 猪 微小RNA 突变 CRISPR/Cas9技术 pk15细胞系

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不同培养基对PK15细胞增殖影响的研究 被引量：3

7

作者 付世新 李晓龙 +1 位作者 王长远 刘国文 《黑龙江八一农垦大学学报》 2004年第1期62-64,共3页

采用无血清液体培养基、DMEM培养基和MEM培养基进行PK15细胞的培养,观察细胞增殖及传代效果,确定无血清液体培养基的营养功能。结果表明:无血清液体培养基只能维持第一代细胞的生长,不能用于第二代后的培养,效果不如DMEM、MEM培养基,且... 采用无血清液体培养基、DMEM培养基和MEM培养基进行PK15细胞的培养,观察细胞增殖及传代效果,确定无血清液体培养基的营养功能。结果表明:无血清液体培养基只能维持第一代细胞的生长,不能用于第二代后的培养,效果不如DMEM、MEM培养基,且差异显著。 展开更多

关键词 培养基 pk15细胞 增殖 营养 猪传代肾细胞

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肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响 被引量：1

8

作者 朱喆 张剑英 +6 位作者 华再东 任红艳 肖红卫 张立苹 郑新民 毕延震 卢晟盛 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第2期345-351,共7页

本研究旨在揭示肌抑素(MSTN)与基质金属蛋白酶(MMPs)的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系:单等位基因敲除的PK3108细胞系和双... 本研究旨在揭示肌抑素(MSTN)与基质金属蛋白酶(MMPs)的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系:单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调(P<0.01);细胞外基质中纤连蛋白(FN)和层连接蛋白(LN)含量均极显著增加(P<0.01)。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞(P<0.01);Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。 展开更多

关键词 猪 肌抑素(MSTN) 基质金属蛋白酶2/7/9(MMP-2/7/9) pk15细胞

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凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响 被引量：3

9

作者 翟云云 李佳佳 +4 位作者 张爽 任子昱 金前跃 杜永坤 万博 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期478-487,共10页

本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK-15)ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒... 本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK-15)ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异;RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL^-1βmRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID50检测子代病毒感染力的滴定。结果表明:两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-ASC-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-ASC-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 凋亡相关斑点样蛋白 先天性免疫 猪肾上皮细胞

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乙型脑炎病毒感染PK15细胞的lncRNA差异表达谱分析 被引量：1

10

作者 朱静静 戴政列 +4 位作者 汪涵 李向臣 赵阿勇 周晓龙 杨松柏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期272-281,共10页

旨在分析乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染猪肾上皮细胞PK15后的lncRNA差异表达谱,探究宿主lncRNA在JEV感染和宿主防御中的潜在功能。本研究中利用JEV感染PK15细胞,感染36 h,收集细胞,同时设立未感染对照组,每组3个... 旨在分析乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染猪肾上皮细胞PK15后的lncRNA差异表达谱,探究宿主lncRNA在JEV感染和宿主防御中的潜在功能。本研究中利用JEV感染PK15细胞,感染36 h,收集细胞,同时设立未感染对照组,每组3个生物学重复。提取细胞总RNA,构建cDNA文库后进行高通量测序,筛选出差异表达lncRNA。通过对差异表达lncRNA与mRNA的位置关系以及序列相似性预测顺式和反式作用的靶基因,将预测的靶基因进行GO和KEGG分析。最后随机选出9个差异表达lncRNAs,利用实时荧光定量PCR(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)技术进行表达验证。结果表明,本研究中共鉴定出856个差异表达lncRNAs,其中452个lncRNAs显著上调表达,404个lncRNAs显著下调表达。GO分析发现,lncRNA的靶基因主要富集于先天性免疫反应;KEGG通路分析发现lncRNA的靶基因显著富集于肿瘤坏死因子、Toll样受体和NF-κB等信号通路。通过qRT-PCR验证发现,定量结果和测序结果基本一致。本研究为进一步探究lncRNA参与宿主免疫反应调控JEV复制奠定了理论基础。 展开更多

关键词 猪 乙型脑炎病毒 先天免疫反应 pk15细胞 高通量测序

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猪圆环病毒2型基因1群B亚簇的体外培养特征 被引量：1

11

作者 罗维 赵墩 +2 位作者 吴海超 蒋大良 余兴龙 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期534-538,共5页

为探寻猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中的复制特征,将PCV2基因1群B亚簇(PCV2–1B)病毒感染PK15均质细胞A10,待感染细胞层长满,对其进行连续传代;对第5、6代细胞进行维持培养,即在细胞长满后隔天更换培养基,以维持细胞良好的生长;用第1... 为探寻猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中的复制特征,将PCV2基因1群B亚簇(PCV2–1B)病毒感染PK15均质细胞A10,待感染细胞层长满,对其进行连续传代;对第5、6代细胞进行维持培养,即在细胞长满后隔天更换培养基,以维持细胞良好的生长;用第10代带毒细胞的培养液接种A10细胞,并进行换液维持培养。PCR与定量PCR检测结果表明,PCV2–1B病毒感染A10细胞后,其病毒基因组的含量在感染细胞长满之前(约96 h)随着细胞的增多而上升,同时也随着传代次数的增多而上升;换液维持培养的细胞,在维持10 d后PCV2–1B病毒基因组的含量能维持在107～108拷贝/mL,而第10代带毒细胞的培养液接毒A10之后,病毒基因组含量随细胞增多而上升,在达到约108拷贝/mL后,病毒基因组含量维持在107～108拷贝/mL。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 复制动态 pk15细胞 毒株

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他莫昔芬对猪伪狂犬病病毒体外增殖的影响

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作者 邢嘉友 樊文杰 +5 位作者 王昱旻 鲁秀香 宋月 褚贝贝 王江 王梦迪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第11期4503-4512,共10页

【目的】研究他莫昔芬(Tamoxifen)在PK15细胞模型上对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染的抗病毒作用。【方法】以PK15细胞为模型,采用CCK-8细胞计数法检测他莫昔芬对细胞活力的影响;利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒检测他... 【目的】研究他莫昔芬(Tamoxifen)在PK15细胞模型上对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染的抗病毒作用。【方法】以PK15细胞为模型,采用CCK-8细胞计数法检测他莫昔芬对细胞活力的影响;利用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒检测他莫昔芬对细胞周期和凋亡的影响;利用CytoFLEX流式细胞仪和荧光显微镜检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-GFP后病毒增殖的差异;利用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后PRV gB基因mRNA和蛋白表达水平的变化;利用病毒滴度测定法检测他莫昔芬处理细胞感染PRV-QXX后对病毒的抑制情况。【结果】他莫昔芬用药浓度在6μmol/L时对细胞活力无影响;在6μmol/L以下时,与空白组相比,他莫昔芬处理组对细胞周期与凋亡没有显著影响(P>0.05)。在同一时间点,他莫昔芬处理组PRV-GFP在PK15细胞中的增殖速度极显著低于对照组(P<0.01);实时荧光定量PCR结果表明,他莫昔芬处理后极显著抑制了PRV gB基因mRNA在PK15细胞中的表达(P<0.01);Western blotting结果显示,不同给药浓度同一时间点,他莫昔芬都显著或极显著抑制了PRV gB蛋白的表达(P<0.05;P<0.01);病毒滴度测定结果表明,在PK15细胞中,同一时间点他莫昔芬处理组的PRV-QXX子代病毒的复制速度显著或极显著低于对照组(P<0.05;P<0.01)。【结论】他莫昔芬能显著抑制PRV在PK15细胞中的增殖。 展开更多

关键词 他莫昔芬 伪狂犬病病毒(PRV) 猪肾上皮细胞 抗病毒作用

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从病毒引入方面加强防控以阻制猪场病毒循环

13

《北方牧业》 2018年第5期19-19,共1页

农业部兽医诊断中心主任亢文华研究员： 猪圆环病毒病（PCV）已经变成一个可以独立发病的一线传染病 观察猪圆环病毒病的发展历程．PCV1，1974年首次从PK15细胞中发现，无致病力，1982年被正式命名（DNA分子片段大小1759bp）。从临床... 农业部兽医诊断中心主任亢文华研究员： 猪圆环病毒病（PCV）已经变成一个可以独立发病的一线传染病 观察猪圆环病毒病的发展历程．PCV1，1974年首次从PK15细胞中发现，无致病力，1982年被正式命名（DNA分子片段大小1759bp）。从临床的PCV2病例中，有一半以上检测到PCV1的参与，应该重视PCV1的潜在致病性。 展开更多

关键词 猪圆环病毒病 循环 猪场 防控 pk15细胞 诊断中心 分子片段 PCV2

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血根碱对雄性小鼠的生殖毒性研究 被引量：1

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作者 林海 张明军 +1 位作者 杨佳亮 郭静 《中兽医医药杂志》 2015年第6期31-35,共5页

研究血根碱对雄性小鼠的生殖毒性。采用MTS法检测血根碱对猪肾上皮细胞(PK-15)和猪睾九细胞(ST)的增殖抑制作用。将120只3周龄普通级ICR雄性小鼠随机分为5组:空白对照组(蒸馏水)、溶媒对照组(蒸馏水:丙二醇为2:1)、低剂量组(5mg/kg)、... 研究血根碱对雄性小鼠的生殖毒性。采用MTS法检测血根碱对猪肾上皮细胞(PK-15)和猪睾九细胞(ST)的增殖抑制作用。将120只3周龄普通级ICR雄性小鼠随机分为5组:空白对照组(蒸馏水)、溶媒对照组(蒸馏水:丙二醇为2:1)、低剂量组(5mg/kg)、中剂量组(10mg/kg)和高剂量组(20mg/kg),血根碱用量为0.1 mL/10g,连续灌胃37d,并于开始灌胃后的第24、31和37天分别采集样品并检测。结果表明,微量的血根碱对猪肾上皮细胞(PK-15)和猪睾九细胞(ST)可产生显著的增殖抑制作用(对ST的MIC为0.25μmol/L,对PK-15的MIC为0.5μmol/L);在体试验结果显示,试验组小鼠各项指标与对照组无显著差异,说明血根碱对雄性小鼠无显著生殖毒性。 展开更多

关键词 血根碱 猪肾上皮细胞 猪睾丸细胞 ICR小鼠 细胞增殖抑制作用 生殖毒性

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Toll样受体7基因敲除对水疱性口炎病毒增殖的影响

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作者 孟洁洁 宋月 +6 位作者 樊文杰 杨乐 邢嘉友 王江 褚贝贝 杨国宇 王梦迪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2011-2021,共11页

【目的】探究敲除Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)基因对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)复制的影响。【方法】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞(porcine renal epi... 【目的】探究敲除Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)基因对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)复制的影响。【方法】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞(porcine renal epithelial cells,PK15)系。通过构建pTLR7-sgRNA重组质粒并转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到PK15-TLR7^(-/-)多克隆细胞,并在Western blotting鉴定后通过有限稀释法获得PK15-TLR7^(-/-)单克隆稳定细胞系。为验证敲除TLR7基因稳定细胞系是否构建成功,分别利用光学显微镜和细胞毒性检测(cell counting kit 8,CCK-8)观察并检测PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞的形态与活力;利用荧光倒置显微镜和流式细胞术观察VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞后病毒增殖情况;利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞后GFP蛋白和VSV-N基因mRNA水平的表达情况;利用病毒滴度检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞后子代病毒产生情况。【结果】采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的3种sgRNA均对TLR7进行了有效的编辑,其中sgRNA2的基因编辑效率最高,但敲除TLR7基因并不影响PK15细胞的形态及活力;当感染VSV-GFP后,通过荧光显微镜观察发现,荧光强度随着时间逐次增加,且PK15-TLR7^(-/-)细胞的GFP荧光强度强于PK15细胞。流式细胞术检测结果显示,相同时间点的PK15-TLR7^(-/-)细胞感染VSV-GFP的比例显著或极显著高于PK15细胞(P<0.05;P<0.01);实时荧光定量PCR结果表明,感染4~36 h VSV-N基因mRNA相对表达量随着时间逐渐增加,且PK15细胞中VSV-N基因的mRNA相对表达量显著或极显著低于PK15-TLR7^(-/-)细胞(P<0.05;P<0.01);Western blotting结果表明,PK15与PK15-TLR7^(-/-)细胞中的VSV-GFP GFP蛋白均从6 h开始表达,表达量随时间逐渐增多,且在PK15-TLR7^(-/-)细胞中VSV-GFP GFP蛋白含量比PK15细胞更高;感染VSV-GFP 6 h后子代病毒开始释放,此时PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7^(-/-)细胞(P>0.05),但PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度随着感染时间的增加显著或极显著低于PK15-TLR7^(-/-)细胞(P<0.05;P<0.01)。【结论】TLR7基因的敲除可以促进VSV在PK15细胞中的复制,初步验证了TLR7在天然免疫中的作用,为VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新思路。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 TLR7基因 猪肾上皮细胞(pk15) 水疱性口炎病毒(VSV)

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