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猪瘟病毒E2基因部分表位区重组猪伪狂犬病病毒的构建及生物学特性研究
1
作者 王林青 张刘辉 +3 位作者 陈曦艋 马世杰 宋月 陈红英 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第4期1815-1824,共10页
【目的】猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)是当前影响生猪产业发展的两种重要病原,目前无高效的药物治疗方法,主要依靠疫苗接种进行预防。本试验旨在构建含有CSFV E2基因部分表... 【目的】猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)是当前影响生猪产业发展的两种重要病原,目前无高效的药物治疗方法,主要依靠疫苗接种进行预防。本试验旨在构建含有CSFV E2基因部分表位区的重组PRV毒株,并探究其生物学特性,为开发同时预防CSFV和PRV的二联疫苗提供参考。【方法】首先使用基因工程技术将包含CSFV E2蛋白B/C/D/A 4个表位区的一段基因插入pG-EGFP重组质粒的BamHⅠ位点,构建重组质粒pG-E2AD-EGFP;然后将质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV NY-gE^(-)/gI^(-)/TK^(-)的ST细胞,在ST细胞内发生同源重组,利用蚀斑纯化法拯救出带绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-E2AD-EGFP。使用CRISPR/Cas9敲除载体敲除EGFP基因,经蚀斑纯化得到无荧光的重组病毒rPRV-E2AD。利用PCR扩增和Western blotting检测重组病毒rPRV-E2AD的E2基因A-D表位区表达情况。通过半数组织培养感染剂量(TCID50)法检测不同理化性质处理后病毒增殖情况,对重组病毒培养特性、理化特性进行评价。【结果】通过细胞内同源重组和病毒蚀斑纯化,得到了同时表达CSFV E2AD抗原和EGFP的重组病毒rPRV-E2AD-EGFP。通过CRISPR/Cas9技术敲除EGFP基因,得到了无EGFP基因表达的重组病毒rPRV-E2AD。Western blotting检测结果显示,该毒株表达蛋白大小约27 ku,与预期CSFV E2AD抗原大小一致。rPRV-E2AD毒株与亲本株在ST、IPEC-J2、PK-15、Vero细胞中生长特性基本一致,均在感染后12 h引起细胞融合,36 h出现细胞脱落。理化特性检测结果显示,重组毒株与亲本株在相同理化条件处理下,培养特性相似。【结论】本研究成功获得重组病毒rPRV-E2AD,且外源基因不影响亲本株的增殖特性,试验结果为研发重组CSFV E2基因活载体疫苗提供了候选毒株,也为PRV活载体疫苗的开发提供了研究基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒(csfv) 伪狂犬病病毒(PRV) 重组病毒 E2基因
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用于非洲猪瘟病毒多靶标核酸检测的DNA假病毒制备及定量
2
作者 邓俊花 李昊轩 +6 位作者 陈冬杰 吕继洲 王晶晶 张舟 袁向芬 魏方 吴绍强 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3555-3560,共6页
本研究旨在研制一种全程质控非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测、避免质粒交叉污染的DNA假病毒。将ASFV B646L/CD2v/MGF505-1R/MGF360-12L 4种检测关键基因及EGFP基因共构建于杆状病毒的转移载体pFastBac^(TM)Dual中,转化形成重组Bacmid pFast... 本研究旨在研制一种全程质控非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测、避免质粒交叉污染的DNA假病毒。将ASFV B646L/CD2v/MGF505-1R/MGF360-12L 4种检测关键基因及EGFP基因共构建于杆状病毒的转移载体pFastBac^(TM)Dual中,转化形成重组Bacmid pFastBac-EGFP-ASFV,转染至sf21细胞,包装产生ASFV重组杆状病毒。结果显示:通过荧光倒置显微镜观察,表达的EGFP蛋白绿色荧光信号指示成功获取AcMNPV-EGFP-ASFV病毒;重组杆状病毒基因组溯源分析,ASFV B646L/CD2v/MGF505-1R/MGF360-12L基因序列满足现行检测方法质控需求;ASFV质控品均匀、稳定,-20℃保存至少可稳定24个月。采用ddPCR定量为4.09×10^(3) copies·μL^(-1)。本研究非洲猪瘟病毒DNA假病毒的制备,为非洲猪瘟疫情监测提供了新的技术支撑。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 DNA假病毒 定量
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表达非洲猪瘟pp62与Hsp70蛋白重组腺病毒对小鼠的免疫原性分析
3
作者 陈长春 吴植 +7 位作者 任冠宇 陈文玉 曹世诺 朱睿 张力 成玉婷 朱善元 卢会鹏 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期3027-3031,共5页
本研究旨在开发一种针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的重组腺病毒疫苗,为ASFV疫苗的临床应用和研发提供科学依据。利用pAdEasy-1系统构建融合表达ASFV CP530R基因和分支结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70)的重组腺病毒(rAd-... 本研究旨在开发一种针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的重组腺病毒疫苗,为ASFV疫苗的临床应用和研发提供科学依据。利用pAdEasy-1系统构建融合表达ASFV CP530R基因和分支结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70)的重组腺病毒(rAd-CP530R-Hsp70)。通过间接免疫荧光和Western blot验证目的蛋白的表达。将rAd-CP530R-Hsp70重组腺病毒免疫小鼠,检测小鼠体内产生的抗体和细胞因子水平。结果显示:重组腺病毒成功诱导小鼠产生针对pp62的特异性抗体,免疫后35 d抗体滴度达到1.33。免疫后小鼠脾细胞培养上清中IL-2、IL-4和IFN-γ水平显著升高,显示该疫苗能够有效激活体液和细胞免疫应答。构建的重组腺病毒疫苗可有效诱导小鼠产生免疫应答,为非洲猪瘟疫苗的研发提供数据支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 CP530R 重组腺病毒 HSP70
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非洲猪瘟病毒五基因缺失株的发现与分离鉴定
4
作者 戈胜强 左媛媛 +7 位作者 路皓东 初薛霏 吕艳 徐天刚 于家荣 李金明 蔡玉梅 王志亮 《中国动物检疫》 2025年第4期78-83,共6页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的高度致死性传染病,从1921年首次被发现至今,一直在全球范围内传播。研究表明,ASFV强毒株在传代细胞上连续传代会使其毒力降低,这为研发ASFV... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的高度致死性传染病,从1921年首次被发现至今,一直在全球范围内传播。研究表明,ASFV强毒株在传代细胞上连续传代会使其毒力降低,这为研发ASFV弱毒疫苗提供了重要思路。但在原代细胞上多次传代发生基因丢失的相关研究未见报道。本研究将ASFV强毒株在原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)上连续传代,发现一株ASFV多基因家族(MGFs)基因缺失毒株,并对其进行了分离纯化。全基因组测序结果显示,该分离株在MGF360和MGF505处有5个基因的缺失,且缺失区域位于ASFV MGFs基因研究的热点区域。体外验证表明,该基因缺失株与母本毒株复制能力相似,会在与母本野毒的混合增殖扩繁中稳定存在。提示ASFV在种子批毒制备过程中应保持较低的传代次数,以防基因缺失毒株出现。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 基因缺失 稳定增殖 病毒纯化
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非洲猪瘟基因Ⅰ/Ⅱ型重组病毒疫苗研究进展
5
作者 戈胜强 吕艳 +10 位作者 左媛媛 于家荣 殷磊 韩秀琚 王筱真 刘珊 郑辉 王晓华 李金明 魏荣 王志亮 《中国动物检疫》 2025年第3期72-76,共5页
非洲猪瘟病毒(ASFV)重组事件在临床中并不是偶然现象,它是造成ASFV遗传多样性的原因之一,但是以基因Ⅰ型和基因Ⅱ型为母本病毒,发生“嵌合式重组”尚属首次发现。目前,对于中国、越南和俄罗斯报道的重组毒均已开展过攻毒试验,证实重组... 非洲猪瘟病毒(ASFV)重组事件在临床中并不是偶然现象,它是造成ASFV遗传多样性的原因之一,但是以基因Ⅰ型和基因Ⅱ型为母本病毒,发生“嵌合式重组”尚属首次发现。目前,对于中国、越南和俄罗斯报道的重组毒均已开展过攻毒试验,证实重组毒致病力较强且同居感染能力较强。同时中国和越南实验室均对重组毒进行了在研/在售疫苗的攻毒保护评价,证实基因Ⅱ型弱毒疫苗不能抵御重组毒攻击,这对ASFV重组病毒疫苗研究提出了新的挑战。本文通过总结已发表的ASFV重组毒动物实验数据,进一步分析该病毒感染特点,总结该病毒疫苗研究进展,以期为国内相关研究和防控措施制定提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 重组病毒 疫苗研发
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青海省部分地区非洲猪瘟病毒弱毒株流行病学调查分析
6
作者 李秀英 张立成 +7 位作者 逯玉 傅义娟 炊文婷 张燕 应兰 黄龙 宋长芳 杨峻鹏 《山东畜牧兽医》 2025年第6期9-10,共2页
为掌握青海省非洲猪瘟病毒(ASFV)弱毒株感染现状并评估疫情风险,本研究通过现场问卷调查与实验室监测相结合的方法,在西宁市、海东市及环湖地区部分农区县(市区)开展ASFV弱毒株流行病学调查,旨在提升全省非洲猪瘟防控预警能力,为科学防... 为掌握青海省非洲猪瘟病毒(ASFV)弱毒株感染现状并评估疫情风险,本研究通过现场问卷调查与实验室监测相结合的方法,在西宁市、海东市及环湖地区部分农区县(市区)开展ASFV弱毒株流行病学调查,旨在提升全省非洲猪瘟防控预警能力,为科学防控提供技术支撑。结果显示,生猪样本阳性率为0.10%,较2022年上升0.05%;环境样本阳性率达1.85%。结果表明,当前病毒环境污染范围较广,生猪及其产品的生产、调运、屠宰及市场流通等环节的生物安全防控仍存在薄弱环节。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒弱毒株 流行病学调查 分析
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非洲猪瘟病毒抗体阻断ELISA法测量不确定度评估
7
作者 柴娟 张璐 +10 位作者 董建斐 周丰超 王雅婷 孙仁杰 陈文静 黄晓兵 冯肖肖 黄靖 郑方宇 谢荣辉 张传亮 《中国动物检疫》 2025年第5期120-124,共5页
为了评估阻断ELISA方法检测结果的可靠性,使用阻断ELISA方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体,并分别使用“影响因素分析”法和“对照样品”法对试验进行测量不确定度评估。“影响因素分析”法和“对照样品”法评估的扩展不确定度(U)分别为0.... 为了评估阻断ELISA方法检测结果的可靠性,使用阻断ELISA方法检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体,并分别使用“影响因素分析”法和“对照样品”法对试验进行测量不确定度评估。“影响因素分析”法和“对照样品”法评估的扩展不确定度(U)分别为0.053 0和0.044 2 (k=2),表明在控制好移液器、培养箱和酶标仪等仪器引入的不确定度基础上,ELISA方法检测ASFV抗体的整体不确定度相对较低。两种方法评估的不确定度值差异不显著,使用“影响因素分析”法可以通过分析各分量在测量结果中的相对贡献,得到影响结果的关键因素,并进行改进;使用“对照样品”法可减少大量计算过程,操作更简单。ASFV抗体ELISA试验判定引入不确定度,可以提高结果的准确性,有利于进一步完善兽医检测领域不确定度评估体系。 展开更多
关键词 ELISA 非洲猪瘟病毒抗体 测量不确定度 “影响因素分析”法 “对照样品”法
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屠宰企业洗消中心运输车辆非洲猪瘟病毒洗消效果分析
8
作者 熊丽文 王武 +5 位作者 黄稳妃 张由亮 黎益图 梁惠娟 胡然旺 韦建立 《广西畜牧兽医》 2025年第3期132-133,共2页
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种猪的烈性传染病,死亡率可高达100%,被世界动物卫生组织列为需要通报的动物重大烈性传染病,被中国列为一类动物疫病[1]。流行病学调查结果表明,被污染的车辆和人员是非洲猪瘟病毒传播、扩散的主要方... 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种猪的烈性传染病,死亡率可高达100%,被世界动物卫生组织列为需要通报的动物重大烈性传染病,被中国列为一类动物疫病[1]。流行病学调查结果表明,被污染的车辆和人员是非洲猪瘟病毒传播、扩散的主要方式之一,加强运输车辆洗消中心建设和管理,做好运输车辆、人员和物品的清洗消毒,是切断非洲猪瘟病毒传播途径的重要手段[2]。为了解屠宰企业洗消中心对运输车辆非洲猪瘟(ASF)的洗消效果,2023年12月对来宾市屠宰企业3家洗消中心的15辆运输车辆进行了采样,运用实时荧光定量PCR方法对样品进行非洲猪瘟病毒核酸检测。现报告如下。 展开更多
关键词 洗消中心 病毒洗消 屠宰企业 实时荧光定量PCR 非洲猪瘟
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非洲猪瘟病毒感染过程中巨噬细胞极化表型变化的研究 被引量：1
9
作者 崔宏全 姜成刚 +6 位作者 文莉莉 范宇琴 刘英豪 都兰 王靖飞 赵东明 何希君 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第1期54-62,共9页
为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)对巨噬细胞极化表型的影响,本研究将100ng/mL脂多糖(LPS)+50ng/mL IFN-γ诱导猪肺泡巨噬细胞(PAM)成为M1型巨噬细胞(M1组),用50 ng/mL IL-4诱导PAM成为M2型巨噬细胞(M2组),以不做任何处理的PAM作为对照组。24 ... 为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)对巨噬细胞极化表型的影响,本研究将100ng/mL脂多糖(LPS)+50ng/mL IFN-γ诱导猪肺泡巨噬细胞(PAM)成为M1型巨噬细胞(M1组),用50 ng/mL IL-4诱导PAM成为M2型巨噬细胞(M2组),以不做任何处理的PAM作为对照组。24 h后采用荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞中M1型细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α及M2型细胞因子IL-10及其标志物精氨酸酶-1(Arg-1)、几丁质酶-1(Ym-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)mRNA的转录水平;采用Luminex细胞多因子试剂盒检测各组细胞上清中M1型细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18和M2型细胞因子IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)、IL-10的表达水平;采用NO试剂盒及流式细胞术分别检测各组细胞上清中M1型巨噬细胞代谢物NO的含量及其细胞表面标志物CD80+细胞的占比;采用western blot检测各组细胞中M2型巨噬细胞标志物Arg-1蛋白的表达。结果显示,M1组中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-αmRNA的转录和蛋白分泌水平、IL-1α的分泌水平、NO的含量及CD80+细胞的占比均显著和极显著高于其余两组。M2组中抑炎细胞因子IL-10和Arg-1 mRNA的转录和蛋白的分泌水平均极显著高于其余两组。未检测到IL-18和IL-1RA的表达。在此基础上将ASFV Pig/HLJ/2018株以MOI 1感染PAM,不同时间后(0、12 h、24 h、36 h及48 h)分别按照上述各方法检测PAM中各细胞因子及极化标志物的转录水平及蛋白的分泌水平,分析ASFV感染后巨噬细胞表型的极化方向。结果显示,与对照组相比,ASFV感染后PAM中M1型细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的转录水平均极显著升高,IL-6的转录水平一直维持在较高水平,PAM中M2型细胞因子IL-10及Arg-1的转录水平先升后降,并分别于感染后48h与12 h达到峰值,后者随后下降;Ym-1与PPAR的转录水平均在感染后24 h达到峰值,随后下降;ASFV感染后PAM中部分细胞因子蛋白的分泌水平与其转录水平的变化趋势类似;NO含量显著和极显著升高,CD80+细胞占比显著升高直至达到峰值;Arg-1的表达量均极显著升高(除了感染后48 h),在感染后36 h达到峰值后下降。上述结果表明,ASFV感染后PAM同时向M1型及M2型极化,M1型极化随着感染时间的延长持续存在,而M2型极化则呈先上升后下降的趋势。本研究为进一步探究ASFV感染对宿主免疫状态的影响及宿主如何响应ASFV感染的机制奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 肺泡巨噬细胞 极化
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非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：2
10
作者 王小格 司煊瑛 +8 位作者 闫志伟 王飞 尤龙琪 刘梗 蔡茂 梁珺珹 梁玉秀 杜永坤 张改平 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第2期781-791,共11页
[目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重... [目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重组蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合制备单克隆抗体。通过Western blotting鉴定单克隆抗体特异性,通过ELISA方法测定腹水效价;利用在线软件预测p22蛋白抗原表位分布情况并合成重叠多肽,通过Dot blotting鉴定抗体识别的抗原表位。[结果]本研究成功构建了p22重组蛋白的原核表达质粒,获得原核系统表达的p22重组蛋白,分子质量约为22 ku。用纯化后p22蛋白作为免疫原免疫小鼠,成功筛选到4株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别为1G3D7G11、2G5H6H8、6D10G7D6和8F6F8B9,其腹水效价均达到1∶500 000。Western blotting结果显示,4株单克隆抗体均能与p22蛋白发生特异性反应。单克隆亚型鉴定结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8和6D10G7D6株单克隆抗体的重链均为IgG1类,8F6F8B9株单克隆抗体的重链为IgG2a类,4株单克隆抗体轻链均为Kappa型。Dot blotting检测结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8株单克隆抗体识别抗原表位位于第58—89位氨基酸处;8F6F8B9株单克隆抗体识别抗原表位位于第126—150位氨基酸处。[结论]本研究成功制备了4株ASFV p22蛋白的单克隆抗体,并初步鉴定了单克隆抗体所识别的B细胞表位区间。研究结果为p22蛋白的生物学功能研究和ASFV血清学检测提供了参考依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p22蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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表达非洲猪瘟病毒基因B602L-B646L的重组病毒免疫原性的初步分析
11
作者 卢会鹏 曹世诺 +6 位作者 吴植 陈长春 陈文玉 成玉婷 周晓慧 孙怀昌 朱善元 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2816-2825,共10页
本研究旨在分析表达非洲猪瘟病毒基因B602L-B646L的重组腺病毒和杆状病毒的免疫原性。联合CpG佐剂注射3 d后或单独免疫rAd-F-Hsp7021 d后用rBac-F加强免疫,或以rBac-F为初免21 d后用rAd-F-Hsp70进行加强免疫,免疫剂量1×10^(8)·... 本研究旨在分析表达非洲猪瘟病毒基因B602L-B646L的重组腺病毒和杆状病毒的免疫原性。联合CpG佐剂注射3 d后或单独免疫rAd-F-Hsp7021 d后用rBac-F加强免疫,或以rBac-F为初免21 d后用rAd-F-Hsp70进行加强免疫,免疫剂量1×10^(8)·只^(-1)。在初免21和42 d后采集血清检测针对ASFV pB602L和p72蛋白的抗体水平。检测初免42 d后的由抗原刺激后外周血单核细胞(PBMCs)上清中干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的含量。结果显示:自免疫后第21天起,所有免疫猪的血清中均能检测到特异性IgG抗体,且在加强免疫后,抗体水平显著上升。CpG联合rAd-F-Hsp70/rBac-F免疫组血清中,pB602L和p72抗体水平均显著高于rAd-F-Hsp70/rBac-F(P<0.01)和rBac-F/rAd-F-Hsp70(P<0.01),其中rAd-F-Hsp70/rBac-F免疫组特异性抗体水平也显著高于rBac-F/rAd-F-Hsp70(P<0.01)。用ASFV pB602L和p72重组抗原刺激PBMCs后,CpG佐剂联合rAd-F-Hsp70/rBac-F免疫组细胞上清中IFN-γ和IL-4含量显著高于其他免疫组(P<0.01),表明以rAd-F-Hsp70作为首免载体优于rBac-F以及CpG佐剂显著提高体液免疫和细胞免疫效果。综上,以rAd-F-Hsp70作为初免疫苗和以rBac-F作为加强疫苗,同时联合使用CpG佐剂显著增强了针对pB602L和p72特异性抗体和细胞因子水平,为进一步优化非洲猪瘟病毒相关疫苗策略提供了数据支持和参考依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 重组腺病毒 重组杆状病毒 CpG分子
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重组腺病毒表达非洲猪瘟病毒pA104R蛋白免疫效果评价
12
作者 卢会鹏 顾陈怡 +6 位作者 吴植 朱睿 曹世诺 雷昕诺 朱善元 孙怀昌 陈长春 《江苏农业科学》 北大核心 2025年第7期191-197,共7页
将非洲猪瘟病毒(ASFV)的pA104R基因与分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)基因融合,并利用BJ5183-AD-1重组菌将融合基因嵌入rAd5复制缺陷型腺病毒基因组,获得含有融合基因的重组腺病毒质粒pAd-A104R-Hsp70,并转染至HEK293A细胞,拯救重组腺病毒r... 将非洲猪瘟病毒(ASFV)的pA104R基因与分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)基因融合,并利用BJ5183-AD-1重组菌将融合基因嵌入rAd5复制缺陷型腺病毒基因组,获得含有融合基因的重组腺病毒质粒pAd-A104R-Hsp70,并转染至HEK293A细胞,拯救重组腺病毒rAd-A104R-Hsp70。通过免疫荧光和免疫印记对拯救的病毒进行鉴定。将重组腺病毒通过腹腔途径免疫小鼠,剂量为108 PFU/只,首免14 d后以相同的剂量和途径加强免疫1次。免疫后不同时间点采集血清和脾细胞,利用间接ELISA检测血清中针对pA104R的特异性抗体。在首免28 d后采集小鼠脾细胞,采用pA104R重组蛋白刺激小鼠脾细胞,检测脾细胞上清中的IL-4和IFN-γ含量。结果显示,将pAd-A104R-Hsp70腺病毒质粒转染HEK293A细胞5 d后,细胞出现变圆、聚集成葡萄串状病变。用rAd-A104R-Hsp70感染HEK293A细胞,能被ASFV抗体阳性血清识别,感染的细胞经免疫印记鉴定,显示在17 ku处有单一的目的条带,说明目的基因在细胞中稳定表达。小鼠首次免疫后14 d,通过间接ELISA检测到小鼠血清中针对pA104R蛋白的特异性抗体,D450 nm为0.38,加强免疫后14 d升至1.53,显著高于对照组(P<0.01)。pA104R蛋白刺激下小鼠的脾细胞上清中的IL-4(28.43 pg/mL)和IFN-γ(1281.67 pg/mL)细胞因子显著高于对照组(P<0.01)。本研究构建的融合Hsp70的pA104R重组腺病毒能有效激发小鼠的体液和细胞免疫反应,可为开发有效的ASFV疫苗提供理论支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 A104R 腺病毒载体 HSP70 细胞免疫反应
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非洲猪瘟病毒D205R蛋白单克隆抗体的制备和抗原表位鉴定
13
作者 林志钊 赵燕燕 +6 位作者 任豪杰 史赛燕 韩世充 何文瑞 万博 张雨杭 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2025年第2期124-130,共7页
非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表... 非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表位。结果显示,成功构建pET32a-D205R表达质粒,并纯化大小约为44 ku的重组D205R蛋白。蛋白质免疫印迹(Western blot)检测结果表明,重组D205R蛋白与ASFV阳性血清发生特异性反应,有良好的免疫原性。利用杂交瘤细胞融合、筛选的方法,得到mAb 19A5。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测结果表明,mAb 19A5能特异性识别真核表达的重组D205R蛋白,并能检测到野生型D205R蛋白。用丙氨酸扫描法鉴定出167-SDPPVVWLGGRPGD-180是mAb 19A5的抗原表位,S167、W173、L174、G175、P178和D180是与mAb19A5结合的关键氨基酸。保守性和结构分析表明,抗原表位高度保守,且位于蛋白质表面,是线性表位。综上,成功制备mAb 19A5,并鉴定了mAb 19A5识别的抗原表位。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D205R蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型PCR-RFLP鉴别方法的建立
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作者 孙仁杰 徐慧玲 +6 位作者 孙思琪 柴娟 虞一聪 谢荣辉 李肖梁 赵灵燕 张传亮 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第5期1017-1028,共12页
本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因Ⅰ型和Ⅱ型的PCR-RFLP鉴别方法。通过对ASFV基因Ⅰ型与基因Ⅱ型基因组序列的比对分析,针对B385R基因和B125R基因保守区设计1对特异性PCR-RFLP引物,与其他临床上常... 本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因Ⅰ型和Ⅱ型的PCR-RFLP鉴别方法。通过对ASFV基因Ⅰ型与基因Ⅱ型基因组序列的比对分析,针对B385R基因和B125R基因保守区设计1对特异性PCR-RFLP引物,与其他临床上常见的9种猪病病毒均无交叉反应。通过该引物扩增获得覆盖B646L基因全长的DNA片段作为检测靶标,结合BmgBⅠ酶切进行RFLP图谱分析,即可实现对B646L基因全序列的快速检测,有效区分ASFV基因Ⅰ型和Ⅱ型,最低检测DNA质量浓度可达到5 pg·mL^(-1)。模拟临床样本的研究结果表明,本方法还能够有效应对实际检测中基因Ⅰ型和Ⅱ型的混合感染。综上,本方法操作简便、准确性高、特异性强、灵敏度高、成本较低,具有良好的应用前景,为基层兽医技术人员开展非洲猪瘟疫情的监测和流行病学研究提供了一种新方法。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性 基因Ⅰ型 基因Ⅱ型
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猪I类白细胞抗原单克隆抗体的制备及其在非洲猪瘟病毒感染机制研究中的初步应用
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作者 王可欣 Weldu Tesfagaber +7 位作者 王婉 尹丽 孔惠 张振江 李芳 高彩霞 步志高 赵东明 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第1期90-95,共6页
猪I类白细胞抗原(SLA I)是机体内至关重要的免疫相关蛋白,是启动特异性细胞毒性T细胞(CTL)免疫应答的核心分子。在机体内,SLA I负责将内源性抗原肽递呈至细胞膜表面,由CD8+T细胞识别,启动机体适应性免疫应答。为了制备SLA I的单克隆抗体... 猪I类白细胞抗原(SLA I)是机体内至关重要的免疫相关蛋白,是启动特异性细胞毒性T细胞(CTL)免疫应答的核心分子。在机体内,SLA I负责将内源性抗原肽递呈至细胞膜表面,由CD8+T细胞识别,启动机体适应性免疫应答。为了制备SLA I的单克隆抗体(MAb),本研究将SLA I-1*04:01等位基因胞外区序列与麦芽糖结合蛋白(MBP)序列连接,在大肠杆菌原核表达系统中表达,获得可溶性重组蛋白MBP-SLA I。经亲和层析纯化后,采用MBP-SLA I免疫BALB/c小鼠3次,采用ELISA检测小鼠血清抗体水平,对血清抗体效价在1:10 000以上的小鼠进一步冲击免疫后,分离小鼠脾脏B淋巴细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合。采用ELISA方法筛选阳性的杂交瘤细胞进行3次克隆纯化,最终筛选得到稳定分泌SLA I抗体的杂交瘤细胞株MAb-1A11。经ELISA检测纯化后的MAb-1A11效价可达1:3 200,经小鼠MAb抗体亚类鉴定试剂盒鉴定其重链为IgG2b,轻链为κ。采用western blot检测该抗体的特异性,结果显示,MAb-1A11能够识别猪肺泡巨噬细胞(PAM)表达的内源性SLA I,在42 ku处出特异性条带,而对HEK293T细胞中表达的同源物人白细胞抗原无交叉识别作用。利用MAb-1A11为一抗,采用western blot进一步检测非洲猪瘟病毒(ASFV)HLJ/18-6GD株感染的PAM中SLA I的表达水平,结果显示,随着ASFV感染时间的延长,SLA I表达水平出现轻微下降。本研究制备了SLA I的MAb,并初步将其应用于ASFV感染机制的研究中,为深入了解SLA I所受调控的机制提供了可靠工具。 展开更多
关键词 猪白细胞抗原I 单克隆抗体 WESTERNBLOT 非洲猪瘟病毒
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猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定
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作者 林琪虹 李长尧 +2 位作者 张朝霞 宋厚辉 翁长江 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期179-184,共6页
为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb... 为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb亚类鉴定试剂盒检测结果显示3D5 MAb为IgM型。采用western blot检测制备的3D5 MAb与293T细胞中过表达的E2蛋白及CSFV感染猪肾细胞(PK-15细胞)后(感染后不同时间)天然表达E2蛋白的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测3D5 MAb与PK-15细胞中天然表达E2蛋白的反应性。Western blot结果显示,过表达E2蛋白的293T细胞和感染CSFV的PK-15细胞中(感染后12 h)均出现了40 ku左右的特异性条带。IFA结果显示,感染CSFV的PK-15细胞中出现红色荧光。以上结果表明,制备的3D5 MAb均能够与过表达的和天然表达的E2蛋白有较强的反应性。利用一系列表达截短的重组E2片段,通过western blot鉴定3D5 MAb识别的抗原表位,结果显示,E2蛋白氨基酸序列中的157REKPFPHRMD167为3D5 MAb的抗原表位。本研究首次制备了CSFV E2蛋白的MAb,并对其进行了表位鉴定,为进一步深入研究CSFV E2蛋白的结构、功能、抗原表位的筛选及新疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒H108R蛋白的制备及其免疫原性评价
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作者 张越 茹毅 +7 位作者 郝荣增 杨锐 赵陇和 李亚军 杨洋 张荣 蒋成辉 郑海学 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1344-1354,共11页
本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化... 本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化后经IPTG诱导表达,用镍亲和层析纯化目标蛋白质。免疫小鼠利用流式细胞术检测脾脏活化的CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞,分离小鼠血清测定特异性抗体滴度,利用Western blot和IFA鉴定多克隆抗体的特异性。并用试剂盒检测血清中细胞因子含量,将血清与ASFV-GFP病毒孵育评估抗体是否能抑制病毒的复制。生物信息学分析表明H108R蛋白为亲水性蛋白质,有跨膜区,无信号肽,蛋白二三级结构中存在较多α-螺旋。SDS-PAGE、Western blot显示IPTG诱导后,成功表达纯化H108R蛋白。蛋白免疫小鼠后能够诱导小鼠脾脏T细胞的活化,刺激机体产生更高水平的细胞因子。免疫制备的多克隆抗体效价为1∶128000,能与ASFV-GFP病毒特异性结合,与病毒孵育后能明显抑制病毒的复制。本研究成功表达制备了ASFV H108R蛋白,免疫能够诱导脾脏T淋巴细胞活化,引起细胞因子水平升高,制备的多克隆抗体能够明显抑制病毒的复制,具有较好的免疫原性,为深入研究H108R蛋白的生物学功能及疫苗研究奠定基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) H108R蛋白 多克隆抗体 免疫原性
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GOPC对猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖的影响
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作者 何俊瑶 宋梦昭 +2 位作者 纪甜甜 罗燕 邓文 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期1-5,共5页
旨在探究高尔基体支架蛋白GOPC对猪瘟病毒(CSFV)增殖的影响,为其在CSFV增殖过程中的作用和分子机制研究奠定基础。设计合成3条靶向猪GOPC基因的siRNA,验证对GOPC mRNA的干扰效率。以高效siRNA序列为基础,干扰GOPC在PK-15细胞表达,接毒... 旨在探究高尔基体支架蛋白GOPC对猪瘟病毒(CSFV)增殖的影响,为其在CSFV增殖过程中的作用和分子机制研究奠定基础。设计合成3条靶向猪GOPC基因的siRNA,验证对GOPC mRNA的干扰效率。以高效siRNA序列为基础,干扰GOPC在PK-15细胞表达,接毒后检测GOPC敲低情况下CSFV的增殖状况。同时用RT-qPCR和Western blot分析CSFV感染后PK-15细胞中GOPC的表达情况。结果表明,GOPC敲低的PK-15细胞中CSFV基因组拷贝数显著上升,IFA也检测到GOPC敲低后CSFV E2蛋白表达量显著增高。在CSFV感染PK-15细胞后,随着病毒感染时间的延长,宿主细胞GOPC的表达量出现了下调趋势,但在感染后24 h出现短暂上调。因此,从上述结果可以初步推断GOPC蛋白抑制CSFV的增殖复制,而CSFV则可以通过调节细胞GOPC蛋白表达从而促进自身增殖。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 GOPC蛋白 病毒增殖
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非洲猪瘟病毒干扰先天性免疫的分子机制
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作者 于家荣 王筱真 +6 位作者 左媛媛 高晟斌 徐蛟 房琳琳 魏荣 包静月 王志亮 《中国动物检疫》 2025年第6期79-86,98,共9页
非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种大型、复杂的DNA病毒,可感染家猪和野猪,对全球养猪业构成重大威胁。除越南外,目前尚未有针对该病的商品化疫苗。ASFV基因及其表达产物的免疫调节能力与病毒毒力和致病性密切相关。目前发现ASFV可通过多种策略... 非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种大型、复杂的DNA病毒,可感染家猪和野猪,对全球养猪业构成重大威胁。除越南外,目前尚未有针对该病的商品化疫苗。ASFV基因及其表达产物的免疫调节能力与病毒毒力和致病性密切相关。目前发现ASFV可通过多种策略来抑制被感染动物的先天性免疫反应。本文聚焦于ASFV相关蛋白与宿主防御的复杂机制,从干扰素信号调节、炎症信号通路调控以及细胞凋亡影响等几个方面进行系统总结,以期为ASFV疫苗和抗病毒药物的研发提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 天然免疫 免疫逃逸 分子机制
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非洲猪瘟病毒p72蛋白抗体全自动化学发光酶免疫检测方法的建立
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作者 马晓莉 李段 +6 位作者 曾道平 刘燕玲 王晓敏 彭国良 宋长绪 王磊 徐铮 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1355-1365,共11页
抗体检测对于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染诊断和疫苗研究至关重要,因此建立一种基于ASFV p72蛋白抗体的全自动化学发光酶免疫分析方法(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)具有重要意义。本研究以重组p7... 抗体检测对于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染诊断和疫苗研究至关重要,因此建立一种基于ASFV p72蛋白抗体的全自动化学发光酶免疫分析方法(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)具有重要意义。本研究以重组p72蛋白偶联的磁微粒(magnetic particles,MPs)捕获p72蛋白抗体,再结合碱性磷酸酶(alkaline phosphates,AP)标记的p72蛋白,借助全自动化学发光分析仪,分析猪血清中p72蛋白特异性抗体水平。经反应条件优化,建立了一种ASFV p72蛋白抗体全自动化学发光酶免疫检测方法。结果显示,建立的CLEIA阴性、阳性临界值为9.505 U·mL^(-1),诊断特异性和灵敏性分别为98.33%和100%,与其他猪病原阳性血清无交叉反应,批内和批间变异系数分别小于5%和10%,各种试剂组分可以保存6个月以上,对ASFV阳性标准血清,分析敏感性为1∶12800,与国产商品化试剂盒的总符合率达95.90%。综上,本研究建立的化学发光方法具有高灵敏性和可重复性,有自动化检测、操作步骤简单的优势,可为ASFV的检测提供新的技术支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p72 化学发光酶免疫 抗体检测
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